應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用代謝組學(xué)技術(shù)探究Pb2+脅迫對(duì)大麥籽粒中差異代謝物及關(guān)鍵通路的影響

王冀菲，曹冬梅,2,3,4，崔航,4，楊建，張東杰,3,5

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319）（2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶 163319）（3.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319）（4.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319）（5.北大荒現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)省級(jí)培育協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江大慶 163319）

大麥（Hordeum vulgareL.）是禾本科作物，別名牟麥、飯麥、赤膊麥，與小麥的營養(yǎng)成分近似，但纖維素含量略高，為全球第五大糧食作物[1]。大麥的籽粒收獲后主要應(yīng)用于啤酒釀造、食品加工、食品保健品等。相比于其他谷物類作物，大麥含有豐富的可溶性β-葡聚糖纖維、淀粉、蛋白質(zhì)、多酚[2-6]、抗氧化酶和類黃酮等營養(yǎng)物質(zhì)，可調(diào)節(jié)人體腸道菌群，降低人體患慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，大麥能夠抵御生物及非生物脅迫[7-10]，對(duì)生長環(huán)境變化感知靈敏，使大麥成為Pb2+脅迫生長條件下探究營養(yǎng)物質(zhì)變化的理想作物模型。隨著工業(yè)化進(jìn)程的發(fā)展，田間農(nóng)藥[11]和磷肥[12]的大量使用、糧食產(chǎn)品加工后的廢棄排放等行為，導(dǎo)致土地金屬污染現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。我國耕地土壤的污染指數(shù)達(dá)19.4%，其中重金屬Pb2+為土壤環(huán)境污染的主要污染物之一，點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)1.5%[13]，超標(biāo)土壤面積達(dá)9.45萬km2。土壤受到Pb2+污染的影響，Pb2+隨糧食作物生長進(jìn)入食物鏈并在人體中富集，當(dāng)超過人體耐受極限值后容易引起嚴(yán)重的急慢性Pb2+中毒[14]，危害人體健康。

研究植物內(nèi)源代謝物[15]，代謝組學(xué)可以對(duì)其進(jìn)行一個(gè)相對(duì)全面的分析[16]。因此，選擇代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)Pb2+脅迫條件下大麥中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行差異研究[17]。目前，代謝組學(xué)常用檢測(cè)方法有核磁共振[18-20]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[21]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[22]以及僅近年來新興的毛血管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用[23]技術(shù)。LC-MS液相色譜作為分離系統(tǒng)，具備分析分離性能好、靈敏度高和專屬性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，適用于植物代謝差異代謝物的定性定量分析。羅慶[24]應(yīng)用LC-MS代謝組學(xué)技術(shù)探究不同Pb濃度脅迫下的東南景天根系分泌物的差異變化，定性出16種差異代謝物，糖脂代謝和能量循環(huán)差異變化顯著。郭山等[25]通過使用LC-MS技術(shù)，對(duì)不同濃度Cd脅迫下的鳳眼蓮代謝物進(jìn)行差異分析，篩選主要發(fā)生變化的代謝通路與有機(jī)酸代謝及氨基酸代謝有關(guān)。王晶晶[26]探究青梗菜在不同濃度Cr脅迫下植物體內(nèi)小分子代謝物及代謝通路分析，從青梗菜篩選出多種差異代謝物，氨基酸代謝和能量代謝通路響應(yīng)了不同濃度的Cr脅迫。Zhao等[27]采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)探究低溫條件下影響草菇品質(zhì)的差異代謝物，共有216個(gè)差異代謝物，主要差異產(chǎn)生涉及氨基酸代謝、碳水化合物代謝等39條代謝通路。本實(shí)驗(yàn)以Pb2+脅迫生長的大麥為原材料，進(jìn)行代謝組學(xué)分析，篩選出具有代表性的差異代謝物及代謝通路，以探究大麥對(duì)Pb2+脅迫的響應(yīng)機(jī)制及Pb2+脅迫對(duì)大麥營養(yǎng)價(jià)值的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選取優(yōu)質(zhì)CK15大麥，購自黑龍江省佳木斯農(nóng)科院；硝酸鉛，購自鄭州中天泓達(dá)化工科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（分析純），均購自Fisher Chemical公司；甲酸，購自CNW公司；異丙醇，購自Merck公司；L-2-氯苯丙氨酸，購自Adamas-beta有限公司。本研究在實(shí)驗(yàn)過程中為消除其余可能存在的金屬離子對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，故實(shí)驗(yàn)全程均使用去離子水。

Vanquish超高效液相、Q Exactive HFX高分辨率質(zhì)譜、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）液相色譜柱、Heraeus Frescol17離心機(jī)，均購自Thermo Fisher Scientific公司；FOSS-KN295組織研磨儀，購自丹麥福斯儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大麥模擬田間種植實(shí)驗(yàn)

選取大小均勻一致、飽滿、健康無損傷的CK15大麥種子，放入m=10%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min后用去離子水反復(fù)沖洗3～5次，于干燥通風(fēng)的環(huán)境中放置24 h自然風(fēng)干[28]。種植區(qū)選擇在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行模擬田間實(shí)驗(yàn)，并采集農(nóng)田表層耕作土壤，平鋪在塑料薄膜上風(fēng)干，壓碎，剔除其中的根系及石塊后過篩待用；種植時(shí)每株大麥間隔5 cm，每組大麥種植12箱，播種在塑料箱（長0.6 m，寬0.5 m，高0.45 m）中[29]。取12.5 kg過篩后土壤，使用從前期萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中確定的Pb2+含量（1600 mg/kg土壤）進(jìn)行土壤拌種，將硝酸鉛與土壤混合均勻后開始種植大麥，并分別于7、10、14 d合理間苗，保證每箱4～6株大麥幼苗。

1.2.2 代謝組學(xué)樣品制備

將收獲后的大麥籽粒經(jīng)冷凍組織研磨儀研磨6 min后過100目篩，稱取過篩后樣品50 mg至2 mL離心管中，加入研磨珠、400 μL提取液（V甲醇:V水=4:1）與0.02 mg/mL內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸）。將樣品置于-20 ℃中低溫超聲30 min；超聲結(jié)束后于12000 r/min離心15 min，使用移液槍吸取靜置后上清液于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)，剩余樣品分別吸取等量上清液混合成質(zhì)控樣品（QC）上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 LC-MS代謝組學(xué)設(shè)備及參數(shù)設(shè)置

本研究數(shù)據(jù)使用UHPLC -Q Exactive HF-X系統(tǒng)進(jìn)行代謝組學(xué)分析。所選用色譜柱為：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm；Waters，Milford，USA），具體質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如表1所示。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

多元數(shù)據(jù)分析應(yīng)用R軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以及峰的提取和對(duì)齊，再通過PCA、PLS-DA。應(yīng)用學(xué)生式t檢驗(yàn)結(jié)合PLS-DA的多變量分析（P＜0.05，VIP＞1），用來篩選差異代謝物，以揭示GSCK-GS1600組大麥籽粒的代謝物類型和關(guān)鍵代謝途徑的差異。采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，同時(shí)使用HMDB進(jìn)一步鑒定代謝產(chǎn)物分子；最后將篩選出的差異代謝物進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫注釋分析對(duì)差異代謝物參與的代謝途徑進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.1.1 主成分分析（PCA）

圖1a、b分別為正、負(fù)離子模式下GSCK-GS1600組的PCA得分圖。由圖中可以看出，所有樣本點(diǎn)均處在置信區(qū)間內(nèi)，且組間樣本點(diǎn)分離度良好；組內(nèi)樣本點(diǎn)稍有部分聚集，推測(cè)為品種相同所導(dǎo)致代謝物相似。有研究表明，Pb2+對(duì)于大麥苗期營養(yǎng)物質(zhì)影響極顯著[30]，而相同培養(yǎng)條件下Pb2+脅迫對(duì)于大麥籽粒的代謝產(chǎn)物有何明顯差異，使得后續(xù)針對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行的PLS-DA分析更為重要。

圖1 Pb2+脅迫GSCK-GS1600組PCA得分圖Fig.1 PCA score map of Pb2+ stress GSCK-GS1600 group

2.1.2 偏最小二乘判別-分析（PLS-DA）

圖2a、2b分別為正、負(fù)離子模式下GSCK-GS1600組的PLS-DA得分圖。所有的數(shù)據(jù)在建立PLS-DA模型時(shí)，均通過200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)（RPT）進(jìn)行驗(yàn)證，且結(jié)果顯示Q2＞0.5，說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)沒有假陽性現(xiàn)象，模型具有更高的可靠性?；赑LS-DA結(jié)合帕萊托換算（Par）得分圖顯示，GSCK-GS1600組樣本點(diǎn)的分離趨勢(shì)明顯、程度大，說明分類效果顯著，即可以清晰的解釋實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異，證明Pb2+脅迫對(duì)大麥籽粒代謝物存在一定的影響，并且兩組模型的預(yù)測(cè)能力較好、無過擬合現(xiàn)象。

圖2 GSCK-GS1600組PLS-DA得分圖Fig.2 PLS-DA score ofGSCK-GS1600 group

由圖2a的PLS-DA得分圖可以看出GS1600組的大麥籽粒樣本點(diǎn)對(duì)比GSCK組，其樣本點(diǎn)分布的離散程度較好，說明大麥籽粒再受到Pb2+脅迫后其內(nèi)部代謝物類型變化較大。在大麥生長過程中拌Pb土壤呈可溶態(tài)性Pb2+，可以與植物螯合肽、金屬硫蛋白等小分子肽形成絡(luò)合物[31,32]，堆積在大麥果實(shí)中，使Pb2+對(duì)大麥的代謝產(chǎn)物在一定程度上發(fā)生改變，故呈現(xiàn)在PLS-DA得分圖中。

2.2 差異代謝物相關(guān)性分析

圖3 為通過Pearson相關(guān)分析所得到的GSCK-GS1600組差異代謝產(chǎn)物相關(guān)性圖。在兩組實(shí)驗(yàn)中，GSCK組與GS1600組之間有幾種不同的差異代謝物，其中對(duì)苯二甲酸、傘形酮、檸檬酸、橙鈍葉決明素、馬爾維丁、蘋果酸、表兒茶素、2-吡咯烷酮、甘油磷脂、D-2-氨基丁酸化合物聚為一類，這些化合物在GSCK組與GS1600組中呈正相關(guān)，與其他代謝產(chǎn)物呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），表明上述化合物的相對(duì)含量變化趨勢(shì)相似，以上化合物均含有羧基及羥基，且多為雜環(huán)類化合物，說明有相似化學(xué)基團(tuán)的代謝物在受Pb2+脅迫大麥籽粒中有較強(qiáng)的相關(guān)性。

圖3 GSCK-GS1600組差異代謝物相關(guān)性分析圖Fig.3 Correlation Analysis of differential metabolites between GSCK-GS1600 group

2.3 Pb2+脅迫大麥籽粒差異代謝物定性分析

圖4為GSCK-GS1600組差異代謝物篩選火山圖，圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)特定的代謝物，點(diǎn)的大小表示VIP值。從圖中可以直觀看出，含量下調(diào)的代謝物數(shù)量多于含量上調(diào)的代謝物數(shù)量；其中上調(diào)代謝物多數(shù)為苯環(huán)和有機(jī)雜環(huán)類化合物，下調(diào)代謝物多數(shù)為有機(jī)氧化合物、脂質(zhì)化合物和有機(jī)酸。脂質(zhì)類代謝物的減少會(huì)抑制細(xì)胞的生長和增值[33]，減少大麥生長過程中的能量供應(yīng)，營養(yǎng)成分流失。而大麥籽粒中有機(jī)酸含量的高低，將可能會(huì)直接影響大麥的品質(zhì)[34]，破壞其化學(xué)穩(wěn)定性。GSCK-GS1600兩組樣品之間的差異表明，當(dāng)篩選條件VIP＞1，P＜0.05時(shí)，陽離子模式下共篩選出26個(gè)差異代謝物，其中11個(gè)含量上調(diào)，15個(gè)含量下調(diào)；陰離子模式下篩選出24個(gè)差異代謝物，其中9個(gè)含量上調(diào)，15個(gè)含量下調(diào)。如表2中，主要差異代謝物為：有機(jī)雜環(huán)化合物、有機(jī)含氧化合物、脂質(zhì)及類脂分子以及有機(jī)酸類化合物。在Pb2+脅迫作用下，植物體內(nèi)次級(jí)代謝物開始增加，促進(jìn)有機(jī)酸等代謝物的合成。

圖4 GSCK-GS1600組差異代謝物篩選火山圖Fig.4 Screening diagram of differential metabolites between GSCK-GS1600 group

表2 重要差異代謝物鑒定結(jié)果表Table 2 Identification results of important differential metabolites

通過表2可知，在GSCK-GS1600組的差異代謝物對(duì)比中，產(chǎn)生差異的多數(shù)為有機(jī)雜環(huán)類化合物和苯丙素聚酮類化合物。其中，GS1600組存在3種有機(jī)雜環(huán)類化合物的代謝物、2種苯丙素聚酮類的代謝物表達(dá)量顯著高于GSCK組。根據(jù)差異代謝物鑒定結(jié)果分析可知，甘油脂質(zhì)類代謝物的含量呈下降趨勢(shì)，其中甘油二酯含量下降極顯著。在大麥生長過程中，由于重金屬Pb的脅迫會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞生成大量活性氧，改變了大麥內(nèi)部氧化還原電位的穩(wěn)定[35]。有機(jī)氧類化合物整體呈上升趨勢(shì)，羧酸及其衍生物在大麥籽粒成熟階段呈上升趨勢(shì)，谷胱甘肽及L-同型谷胱甘肽含量顯著上升，且谷胱甘肽易被H2O2激發(fā)，隨著Pb2+濃度的升高，谷胱甘肽含量到達(dá)峰值后下降。甾醇類激素化合物呈上升趨勢(shì)，且甾醇α含量顯著上調(diào)，植物通過分泌甾醇類激素與Pb2+發(fā)生螯合[36]，甾醇結(jié)構(gòu)中含有活潑的酚羥基，可通過捕獲過量的自由基獲得強(qiáng)抗氧化力，來消除Pb2+對(duì)葉綠素代謝通路的影響，減少大麥在生長過程中產(chǎn)生葉面泛黃、黑色素顯著增加[37]等不良影響。

2.4 差異代謝物層次聚類分析

圖5為GSCK-GS1600組差異代謝物層次聚類熱圖，顯示不同種代謝物分類中具有生物活性的關(guān)鍵差異代謝物，直觀展示差異代謝物的含量變化。由層次聚類圖的右側(cè)可以看出，GS1600對(duì)比GSCK組中前10個(gè)差異代謝物的表達(dá)量顯著增高，多為雜環(huán)類化合物及含苯環(huán)化合物和酪胺葡萄糖醛酸類代謝物，說明Pb2+脅迫會(huì)使大麥籽粒中苯環(huán)類化合物和酪胺葡萄糖醛酸的表達(dá)量增加。

圖5 GSCK-GS1600組代謝物層次聚類熱圖Fig.5 GSCK-GS1600 group metabolites hierarchical clustering heat map

根據(jù)HMDB代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫，GSCK-GS1600組在陽離子和陰離子模式下共鑒定出38種差異代謝物，將其按化學(xué)類別分為8種脂質(zhì)和類脂分子、7種有機(jī)酸及衍生物、7種有機(jī)氧化合物、5種有機(jī)雜環(huán)化合物、苯環(huán)型化合物、4種苯丙素類和聚酮類化合物和2種類核苷、核苷酸類似物。與GSCK組相比，受到Pb2+脅迫的大麥籽粒GS1600組的差異代謝物有明顯的上調(diào)或下調(diào)，該結(jié)果與差異代謝物篩選火山圖中所得到的研究結(jié)果一致，7個(gè)分類中，各組中主要積累的代謝物為脂質(zhì)和類脂分子、有機(jī)酸及衍生物以及有機(jī)氧化合物，而積累的含氮有機(jī)化合物、生物堿及衍生物以及核苷、核苷酸和類似物較少。有研究表明，脂質(zhì)分子占大麥籽粒重量的18%[38]，其中甘油二酯、甘油磷脂等大麥中代表性脂質(zhì)及類脂分子含量變化顯著。在Pb2+的脅迫下，大麥根系會(huì)分有機(jī)酸化合物來減輕重金屬脅迫對(duì)大麥的影響[39]，抵御Pb2+對(duì)大麥生長過程及對(duì)大麥籽實(shí)產(chǎn)生的不良影響?？梢詫㈩愔肿?、有機(jī)酸和有機(jī)含氧化合物判斷為大麥生理健康的重要代謝物。

2.5 KEGG關(guān)鍵代謝通路分析

根據(jù)KEGG京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫來篩選關(guān)鍵代謝通路，以確定與差異代謝物相關(guān)聯(lián)最明顯代謝通路。由表3可知，KEGG共識(shí)別了16條代謝通路；其中，4條為關(guān)鍵代謝通路。GSCK-GS1600組的差異代謝物參與以下關(guān)鍵代謝通路，分別為苯丙烷代謝、檸檬酸循環(huán)、谷胱甘肽代謝、糖氧化物和二羧酸代謝、泛酸鹽和CoA生物合成、苯丙烷代謝、光合生物中的碳固定、氨基酸糖和核苷酸糖代謝、苯丙氨酸代謝、玉米素生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、泛醌和其他萜類醌生物合成、β-丙氨酸代謝、丙氨酸和天冬氨酸和谷氨酸代謝、色氨酸代謝、酪氨酸代謝。

在Pb2+脅迫大麥生長過程中，檸檬酸循環(huán)、谷胱甘肽代謝、糖氧化物和二羧酸代謝、苯丙烷代謝主要產(chǎn)生特定差異代謝物。而Pb2+作為農(nóng)作物非必需元素，農(nóng)作物會(huì)建立防御機(jī)制，來減少Pb2+所帶來的危害[40]。大量研究表明，重金屬脅迫作物生長，利用合成谷胱甘肽、有機(jī)酸、苯丙烷、可溶性糖等物質(zhì)從而將重金屬絡(luò)合形成其他化合物[41]。檸檬酸循環(huán)、谷胱甘肽代謝、糖氧化物和二羧酸代謝及苯丙烷代謝的顯著途徑變化支持了這些結(jié)果，同時(shí)光合生物的固碳作用、β-丙氨酸代謝、玉米素生物合成、泛酸鹽和CoA生物合成、丙酮酸代謝、丙氨酸和天冬氨酸和谷氨酸代謝在Pb2+脅迫實(shí)驗(yàn)中也受到了很大的影響。此外，一些有生物合成途徑產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物受到Pb2+脅迫生長過程的影響，如檸檬酸循環(huán)、谷胱甘肽代謝、糖氧化物和二羧酸代謝、苯丙烷代謝主要產(chǎn)生特定差異代謝物，并影響了一些代謝物的變化，包括檸檬酸、蘋果酸、甲氧基肉桂醛、對(duì)羥基丙烯酸、γ-谷氨酰胺-半胱氨酸、谷胱甘肽。

谷胱甘肽代謝通路中共有兩種差異代謝產(chǎn)物隨著Pb2+含量的增加而增加，由雙-γ-谷氨酰胱氨酸經(jīng)雙-γ-谷氨酰胱氨酸還原酶還原生成γ-谷氨酰胺-半胱氨酸，由谷胱甘肽合酶合成谷胱甘肽，Pb2+脅迫谷胱甘肽代謝通路中的雙-γ-谷氨酰胱氨（谷胱甘肽前體）含量增加，大量生成γ-谷氨酰胺-半胱氨酸并促使Pb2+脅迫大麥籽粒組中谷胱甘肽含量增加，從而調(diào)節(jié)因添加Pb2+而被破壞的氧化還原系統(tǒng)。檸檬酸循環(huán)與糖氧化物和二羧酸代謝，共同含有兩種相同的差異代謝產(chǎn)物，隨Pb2+含量的增加而減少，由順烏頭酸經(jīng)烏頭酸水合酶催化生成異檸檬酸，經(jīng)裂解縮合生成蘋果酸脫氫生成草酰乙酸，Pb2+脅迫大麥籽粒使其持水率降低，使大麥氣孔調(diào)節(jié)能力下降，影響呼吸作用，檸檬酸循環(huán)中檸檬酸和蘋果酸生成受到影響，從而影響大麥果實(shí)中糖類、脂類、氨基酸類物質(zhì)的合成，使大麥生長過程中，無法達(dá)到基礎(chǔ)生長過程所需的能量供給要求，產(chǎn)生不良影響，使大麥中營養(yǎng)物質(zhì)流失。苯丙烷代謝通路中含有甲氧基肉桂醛及對(duì)羥基丙烯酸兩個(gè)差異代謝物含量增加，由苯丙氨酸解氨酶依次反應(yīng)生成甲氧基肉桂醛、對(duì)羥基丙烯酸，隨重金屬鉛含量的增加苯丙烷代謝中的關(guān)鍵酶的生成量增加[42]，使苯丙烷代謝分泌更多次級(jí)代謝產(chǎn)物到大麥根系周圍土壤中，來增加大麥的非生物脅迫能力[43]，使大麥增強(qiáng)重金屬鉛污染環(huán)境下的耐受能力。

3 討論

Pb是目前污染土壤情況最嚴(yán)重的重金屬之一。由于其不是植物生長的必需元素，如果土壤含Pb量超標(biāo)，會(huì)很難去除，從而使一些不能“選擇性自主移動(dòng)”的農(nóng)作物不可避免地受到Pb污染的毒害[44]。有研究表明，Pb能夠抑制種子萌發(fā)，降低種子活力，抑制植株生長，并積累在植株體內(nèi)[45,46]。過量的Pb2+進(jìn)入人體會(huì)損傷腸胃健康、毒害腎臟、損害神經(jīng)，導(dǎo)致高血壓、鉛性貧血，影響人的智力發(fā)育，降低人體免疫力。本研究通過大麥種植實(shí)驗(yàn)，對(duì)在Pb2+脅迫的環(huán)境下成熟的大麥籽粒進(jìn)行LC-MS代謝組學(xué)分析，以此探究大麥籽粒受到Pb2+脅迫后的內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)及可能產(chǎn)生毒害物質(zhì)的代謝機(jī)理。Pb2+脅迫對(duì)大麥籽粒的影響最直觀的體現(xiàn)在關(guān)鍵差異代謝物和關(guān)鍵代謝通路上。通過層次聚類熱力圖可以看出對(duì)含量發(fā)生變化的關(guān)鍵代謝物產(chǎn)生的影響，其中大麥籽粒受到Pb2+脅迫后，主要累積的代謝物為脂類代謝物和有機(jī)酸類代謝物。脂類代謝物主要是為大麥籽粒的生長提供能量，其積累可以證明大麥籽粒受到脅迫后其呼吸作用受到抑制，生命活動(dòng)減弱，會(huì)對(duì)大麥籽粒的品質(zhì)造成影響；而有機(jī)酸類代謝物的累積則是大麥籽粒抵御外界脅迫的一種防御手段，當(dāng)大麥籽粒感受到Pb2+脅迫時(shí)，其根系就會(huì)不斷的分泌有機(jī)酸與之進(jìn)行螯合，形成重金屬-有機(jī)酸螯合物，阻止其進(jìn)入大麥籽粒內(nèi)部，以減輕對(duì)大麥籽粒的危害。

通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，Pb2+脅迫會(huì)主要對(duì)大麥籽粒中檸檬酸循環(huán)和氨基酸代謝有顯著影響。Pb2+脅迫大麥籽粒會(huì)使其持水率降低，使大麥氣孔調(diào)節(jié)能力下降，影響呼吸作用，導(dǎo)致檸檬酸循環(huán)受到影響，從而影響大麥果實(shí)中糖類代謝物、脂類代謝物和氨基酸類代謝物的合成，使大麥籽粒無法達(dá)到基礎(chǔ)生長過程所需的能量供給要求；大麥籽粒的持水率降低也會(huì)影響大麥籽粒的口感，最終影響大麥籽粒的品質(zhì)。同時(shí)氨基酸合成的減少也會(huì)導(dǎo)致其中營養(yǎng)物質(zhì)的流失和。但經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，受到Pb2+脅迫后的大麥籽粒內(nèi)部未產(chǎn)生有害物質(zhì)，如發(fā)生意外食用的情況，不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不良影響。

4 結(jié)論

本研究以模擬Pb污染大麥種植區(qū)，添加土壤中外源Pb2+的方式，來模擬Pb2+污染環(huán)境下的大麥盆栽實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過一個(gè)完整的大麥生長周期后，應(yīng)用LC-MS非靶向代謝組學(xué)探究Pb2+脅迫大麥籽粒的代謝機(jī)理。研究結(jié)果表明，Pb2+脅迫組大麥籽粒（GS1600）與對(duì)照組大麥籽粒（GSCK）中有38種代謝產(chǎn)物，其中多數(shù)為脂質(zhì)和類脂分子、有機(jī)酸及衍生物及有機(jī)氧化合物。根據(jù)Pearson相關(guān)分析顯示，含有羧基及羥基的雜環(huán)類化合物多與其他代謝產(chǎn)物呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。通過差異代謝物層次聚類熱力圖表明，大麥籽粒中的有機(jī)雜環(huán)化合物、有機(jī)含氧化合物、脂質(zhì)及類脂分子以及有機(jī)酸類化合物發(fā)生了顯著變化。在鉛脅迫條件下，差異代謝物的化學(xué)類別豐富，基于KEGG關(guān)鍵通路分析，共篩選出16條代謝通路，其中主要產(chǎn)生特定差異代謝物的關(guān)鍵代謝通路共4條：谷胱甘肽代謝，檸檬酸循環(huán)，糖氧化物和二羧酸代謝，苯丙烷代謝。關(guān)鍵差異代謝物為檸檬酸，蘋果酸，γ-谷氨酰胺-半胱氨酸，谷胱甘肽，甲氧基肉桂醛，對(duì)羥基丙烯酸。因此，可進(jìn)一步探究Pb2+脅迫下大麥結(jié)構(gòu)之間的相互作用及變化，為受污染大麥的回收利用提供理論依據(jù)，增加受污染大麥的回收利用率，減少食物浪費(fèi)，以減輕糧食安全問題。