基于代謝活性的ε-聚賴氨酸殺菌動(dòng)力學(xué)

劉振杰，黃培豪，陳述，容順，彭飛艇，陳玲，郭偉鵬

（廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測(cè)中心，華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物安全與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家衛(wèi)健委微生物食品營(yíng)養(yǎng)與安全科技創(chuàng)新平臺(tái)，廣東廣州 510070）

ε-聚賴氨酸（ε-Poly-L-Lysine）是放線菌合成的一種L-賴氨酸聚合物，最先由日本科學(xué)家于1977年發(fā)現(xiàn)[1]。ε-聚賴氨酸的單體分子間通過(guò)α-羧基與ε-氨基連接，與蛋白質(zhì)分子的肽鍵不同。ε-聚賴氨酸抑菌譜廣，對(duì)細(xì)菌、酵母菌、霉菌有抑菌作用[2]，對(duì)病毒也有抑制作用[3]。ε-聚賴氨酸易溶于水，耐熱性能好[4]。動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)ε-聚賴氨酸安全無(wú)毒、無(wú)體內(nèi)殘留、易生物降解以及無(wú)致畸變性[5]。因此，ε-聚賴氨酸是一種理想的天然食品防腐劑。2013年美國(guó)FDA批準(zhǔn)ε-聚賴氨酸GRAS（Generally Recognized as Safe）地位，已用于米飯、軟飲料、蛋類制品、沙拉、魚、奶酪、調(diào)味品等食品的防腐保鮮[4,6]。我國(guó)于2014年批準(zhǔn)ε-聚賴氨酸可用于果蔬汁類、焙烤食品和熟肉制品等食品的防腐。

目前，化學(xué)合成類防腐劑大量應(yīng)用于食品防腐，以延長(zhǎng)保質(zhì)期，但另一方面，隨著人們對(duì)其潛在危害的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，以及人們食品安全意識(shí)的提高，天然來(lái)源的防腐劑因其高安全性而受到人們的青睞，其替代化學(xué)防腐劑已成為必然趨勢(shì)。ε-聚賴氨酸作為一種微生物來(lái)源的天然食品防腐劑，市場(chǎng)需求大，商業(yè)開發(fā)價(jià)值高，因此，ε-聚賴氨酸研究一直受到研究人員的關(guān)注，包括生物合成機(jī)制[7]、高效發(fā)酵工藝開發(fā)[8,9]、及其在奶制品[10]、水產(chǎn)品[11]、水果[12]等食品中的應(yīng)用效果評(píng)價(jià)。

ε-聚賴氨酸主鏈含有多個(gè)-NH2基團(tuán)，pKa值約為9.0[4]，使得其在生理?xiàng)l件下呈多正電荷特性。已有研究報(bào)道均顯示ε-聚賴氨酸抑菌機(jī)制的研究較系統(tǒng)且深入[13-16]。目前，研究人員認(rèn)為ε-聚賴氨酸可經(jīng)靜電相互作用吸附至帶負(fù)電荷的微生物細(xì)胞膜，并破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致胞內(nèi)細(xì)胞物質(zhì)泄露，同時(shí)還可進(jìn)入胞內(nèi)與DNA結(jié)合，最終影響基因表達(dá)[15,17]。抑菌機(jī)制的闡明為ε-聚賴氨酸在食品工業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)，有利于設(shè)計(jì)與制定應(yīng)用方案。

殺菌動(dòng)力學(xué)的數(shù)學(xué)模型是研究殺菌技術(shù)的關(guān)鍵理論之一，對(duì)殺菌技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用具有理論指導(dǎo)意義。動(dòng)力學(xué)模型在熱殺菌技術(shù)如微波加熱[18]、射頻加熱[19]、脈沖強(qiáng)光[20]，以及非熱殺菌技術(shù)如超高壓[21]、高壓均質(zhì)[22]、紫外線[23]等的殺菌效果評(píng)價(jià)中得到應(yīng)用，并在強(qiáng)殺菌劑如焦炭酸二甲酯[24]、高濃度臭氧水[25]等殺菌效果的擬合中得到成功應(yīng)用。目前，盡管人們對(duì)ε-聚賴氨酸抑菌機(jī)制的研究較深入，但作為一種強(qiáng)殺菌劑，其殺菌動(dòng)力學(xué)研究迄今未見報(bào)道，因此，亟需對(duì)ε-聚賴氨酸的殺菌動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，將為其在食品防腐中的應(yīng)用以及為天然消毒劑開發(fā)提供極有價(jià)值的理論依據(jù)。

熒光探針5-氰基-2,3-二甲苯基氯化四唑（5-Cyano-2,3-Ditolyl Tetrazolium Chloride, CTC）是一種無(wú)色水溶性唑鹽，可被活性微生物細(xì)胞膜上的電子呼吸傳遞鏈中的脫氫酶還原為一種非水溶性的熒光物質(zhì)，沉積于細(xì)胞，在一定波長(zhǎng)激光激發(fā)下發(fā)射紅色熒光，活性細(xì)胞呈紅色，而死細(xì)胞無(wú)紅色熒光，熒光強(qiáng)度與呼吸活性有密切關(guān)系[26,27]。本研究以常見的食源性腐敗微生物大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為指示菌，利用細(xì)胞代謝活性檢測(cè)的熒光探針CTC檢測(cè)細(xì)胞代謝活性，基于殘活性率的對(duì)數(shù)值，利用Linear和Weibull模型擬合ε-聚賴氨酸殺菌的動(dòng)力學(xué)曲線。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑與儀器

BS02 CTC快速染色試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所；ε-聚賴氨酸，浙江銀象生物工程有限公司，分子量約3500～4000；二甲基亞砜為化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品；Ultrospec 6300 pro紫外可見分光光度計(jì)，美國(guó)Amershan Biosciences；5417臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。

1.1.2 菌株

大腸桿菌（E. coli）ATCC 8099和枯草芽孢桿菌（B. subtilis）ATCC 9372，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，1000 mL去離子水；營(yíng)養(yǎng)瓊脂：營(yíng)養(yǎng)肉湯按每升添加18～20 g瓊脂，即為營(yíng)養(yǎng)瓊脂。

1.2 菌液制備

活化后的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌接種至裝有30 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的150 mL三角瓶，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期?；跔I(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾注平板計(jì)數(shù)法測(cè)試菌體濃度。

吸取20 mL菌液，8000 r/min離心10 min，收集菌體，棄上清，用0.85%（m/m）無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，最后重懸至無(wú)菌生理鹽水，并調(diào)節(jié)菌體濃度約1×109CFU/mL。

1.3 殺菌處理

吸取5 mL菌液至10 mL離心管，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%ε-聚賴氨酸溶液（去離子水配制），使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%～0.025%，立即混勻，并開始計(jì)時(shí)120 min，每隔15 min或30 min取樣0.1 mL，取樣后即用無(wú)菌去離子水10倍稀釋至1 mL，立即測(cè)試細(xì)胞活性。每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個(gè)重復(fù)，未ε-聚賴氨酸處理的為對(duì)照。

1.4 代謝活性測(cè)定

染色步驟參照BacStain快速染色試劑盒（BS02）操作說(shuō)明。1 mL樣品中依次加入20 μL 50 mmol/L CTC溶液和5 μL增強(qiáng)劑，混勻，30 ℃染色30 min。CTC還原產(chǎn)物的提取參照文獻(xiàn)[25]。染色后的樣品8000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL二甲基亞砜，槍頭吸打?qū)⒓?xì)胞打散，以充分抽提還原產(chǎn)物，抽提時(shí)間10 min，期間吸打1～2次。8000 r/min離心10 min，上清470 nm處測(cè)吸光度值，二甲基亞砜為空白調(diào)零。處理前的樣品，假設(shè)菌體細(xì)胞的活性為100%，其余樣品依據(jù)吸光度值計(jì)算相對(duì)活性，以百分率表示。

1.5 數(shù)學(xué)模型

1.5.1 一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型

該模型假設(shè)同一種群細(xì)菌具有相同的抗逆性，致死動(dòng)力學(xué)可用Linear模型來(lái)描述[20]，即細(xì)菌下降的對(duì)數(shù)值隨時(shí)間的變化呈線性變化，用式（1）表示。

式中：

N0——?dú)⒕幚砬皹悠泛械木淇倲?shù)；

N——處理后樣品含有的菌落總數(shù)；

t——處理時(shí)間，min；

D——指數(shù)遞減時(shí)間，即殺滅90%的微生物所用的時(shí)間，min。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)式（1）略作修改。

式中：

A0——起始樣品的CTC還原產(chǎn)物的吸光度值；

A——?dú)⒕幚砗蟮奈舛戎担?/p>

t和D——同式（1）。

1.5.2 Weibull模型

該模型廣泛應(yīng)用于非熱加工過(guò)程的微生物失活動(dòng)力學(xué)分析，假設(shè)同一種群中的細(xì)菌具有不同的抗逆性[22]，其模型方程用式（3）表示。

式中：

N0、N、t——同式（1）；

b——比例因子，即動(dòng)力學(xué)模型中時(shí)間t對(duì)殺菌動(dòng)力反應(yīng)所占比例大??；

n——形狀因子，n的大小決定了曲線形狀，n＞1時(shí)曲線向上凸，n=1時(shí)曲線為一直線，n＜1時(shí)曲線向下凹。

本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的方程式。

式中：

A0、A——同式（2）；

b、n——同式（3）。

1.6 模型的驗(yàn)證和評(píng)價(jià)

采用均方根誤差RMSE、決定系數(shù)R2、精確因子Af和偏差因子Bf4個(gè)參數(shù)評(píng)判Weibull模型擬合度的優(yōu)劣[25,28,29]。計(jì)算公式如下：

式中：

C——均方根誤差（RMSE）；

p——預(yù)測(cè)值；

a——實(shí)際值；

n——實(shí)驗(yàn)次數(shù)；

Af——精確因子；

Bf——偏差因子。

Af反映了預(yù)測(cè)值與實(shí)際值偏離的程度，其值越接近1，表明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值相差越小，模型越精確。Bf為偏差因子，Bf＞1時(shí)表示模型預(yù)測(cè)值高于實(shí)測(cè)值，Bf＜1時(shí)表示模型預(yù)測(cè)值低于實(shí)測(cè)值，Bf越接近1，模型擬合度越高。決定系數(shù)R2和RMSE表示模型的精確度、可靠度，R2越接近1，RMSE越小，模型擬合度越高。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本文所有實(shí)驗(yàn)均平行3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。Excel 2003和Origin 8.0軟件用于數(shù)據(jù)繪圖和模型擬合。

2 結(jié)果和討論

2.1 不同ε-聚賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌活性的影響

CTC是一種常規(guī)的細(xì)菌活性檢測(cè)探針，廣泛應(yīng)用于土壤、水體等樣品的微生物檢測(cè)[30-32]。ε-聚賴氨酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%）與大腸桿菌作用30 min，CTC染色結(jié)果如圖1所示。ε-聚賴氨酸處理后的大腸桿菌CTC染色呈微弱紅色，表明其代謝活性低，而未處理的對(duì)照，細(xì)胞發(fā)射出強(qiáng)烈紅色熒光，由此可見，ε-聚賴氨酸對(duì)微生物細(xì)胞的破壞作用極為迅速，原因在于其經(jīng)靜電相互作用迅速吸附至大腸桿菌細(xì)胞表面并破壞細(xì)胞膜。進(jìn)一步提高ε-聚賴氨酸的作用質(zhì)量分?jǐn)?shù)，菌體細(xì)胞紅色則變得更為微弱。ε-聚賴氨酸對(duì)枯草芽孢桿菌的作用與大腸桿菌相近。

圖1 大腸桿菌在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01% ε-聚賴氨酸處理前后的CTC染色結(jié)果Fig.1 CTC staining results of E. coli samples after ε-PL treatment at a mass concentration of 0.01%

報(bào)道顯示，ε-聚賴氨酸對(duì)細(xì)菌的抑菌活性強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為1～12.5、1和4～12.5 μg/mL[2,14]。不同ε-聚賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和處理時(shí)間對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌活性的影響見圖2。未處理的對(duì)照，菌體細(xì)胞在測(cè)試時(shí)間內(nèi)的活性基本保持不變，而ε-聚賴氨酸處理大腸桿菌和枯草芽孢桿菌15 min，活性發(fā)生顯著下降，提高處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)活性下降也更明顯，作用時(shí)間超過(guò)15 min后代謝活性呈緩慢下降，由此可知，液體體系下ε-聚賴氨酸對(duì)微生物細(xì)胞的破壞作用迅速。

圖2 不同ε-聚賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的活性變化Fig.2 Change curves of metabolic activity of E. coli and B. subtilis exposed to various concentrations of ε-PL

大腸桿菌與質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.005%ε-聚賴氨酸作用15 min，活性下降較少，為起始活性的86.33%，作用120 min時(shí)下降至73.44%；高質(zhì)量分?jǐn)?shù)ε-聚賴氨酸（0.025%）作用15 min，活性僅為起始的21.06%，作用時(shí)間120 min時(shí)活性下降至僅3.61%。ε-聚賴氨酸處理枯草芽孢桿菌，0.005%ε-聚賴氨酸作用15 min時(shí)，菌體細(xì)胞活性仍較高，為起始活性的88.54%，作用120 min時(shí)為70.84%；提高ε-聚賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)至0.025%，處理15 min時(shí)活性僅為起始活性的16.45%，作用120 min僅為2.58%。基于ε-聚賴氨酸作用質(zhì)量分?jǐn)?shù)和時(shí)間對(duì)代謝活性的影響程度，可知ε-聚賴氨酸對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的殺菌效果相近，與文獻(xiàn)報(bào)道相近[16]。

2.2 ε-聚賴氨酸對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌殺菌效果的Linear模型擬合

殺菌動(dòng)力學(xué)的研究是通過(guò)數(shù)學(xué)模型來(lái)描述殺菌技術(shù)對(duì)微生物的殺滅過(guò)程，是評(píng)價(jià)滅菌技術(shù)殺菌效果的重要方法，對(duì)殺菌技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。目前，常見的殺菌動(dòng)力學(xué)模型有Log-logistic模型、Weibull模型、Dose-response模型及一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型Linear模型[25,29,33]。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)ε-聚賴氨酸殺菌效果的Linear模型擬合結(jié)果見圖3。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)ε-聚賴氨酸處理大腸桿菌和枯草芽孢桿菌時(shí)，部分實(shí)際值與擬合曲線有較大偏離，尤其是ε-聚賴氨酸作用質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，即0.02%和0.025%，作用15 min與30 min時(shí)的實(shí)測(cè)值與擬合曲線的偏離程度較大，由此可見在ε-聚賴氨酸作用質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的條件下，Linear模型擬合效果差。

圖3 不同ε-聚賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.005%～0.025%）處理下大腸桿菌及枯草芽孢桿菌線型模型擬合曲線Fig.3 Fitting curves of linear model for E. coli and B. subtilis under different ε-PL concentrations (0.005%～0.025%)

Linear模型的擬合參數(shù)見表1。不論是大腸桿菌還是枯草芽孢桿菌，D值ε-聚賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低，顯示ε-聚賴氨酸的殺菌效果隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增強(qiáng)。ε-聚賴氨酸作用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.005%時(shí)，決定系數(shù)R2值略高，即大腸桿菌R2=0.46和枯草芽孢桿菌R2=0.68，作用質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至0.01%和0.015%時(shí)變小，后又呈變大趨勢(shì)。由此可見在ε-聚賴氨酸測(cè)試質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，Linear模型擬合度低。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ε-聚賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，短時(shí)間內(nèi)就可導(dǎo)致菌體細(xì)胞的活性顯著下降；在較低作用質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，活性變化則較為緩慢。推測(cè)ε-聚賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)（＜0.005%），Linear模型或可取得較高擬合程度的曲線，作用質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，為獲得理想的擬合效果，應(yīng)增加檢測(cè)點(diǎn)和縮短作用時(shí)間。

表1 不同ε-聚賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理下大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的線性模型的擬合參數(shù)Table 1 Fitting parameters of linear model for E. coli and B. subtilis under different ε-PL concentrations

2.3 ε-聚賴氨酸對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌殺菌效果的Weibull模型擬合

Weibull是一種廣泛應(yīng)用于殺菌動(dòng)力學(xué)模擬的數(shù)學(xué)模型[28,29,33]。圖4為不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)ε-聚賴氨酸殺滅大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的Weibull模型擬合曲線。不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)ε-聚賴氨酸處理對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的殺菌效果，Weibull模型的擬合程度高，只有少數(shù)實(shí)測(cè)點(diǎn)與擬合曲線發(fā)生一定偏離，因此，Weibull模型可準(zhǔn)確擬合ε-聚賴氨酸的殺菌動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

圖4 不同ε-聚賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.005%～0.025%）殺滅大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的Weibull模型擬合曲線Fig.4 Fitting curves of Weibull model for E. coli and B. sublitis under different ε-PL concentrations (0.005%～0.025%)

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)ε-聚賴氨酸殺滅大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的Weibull模型參數(shù)見表2。測(cè)試質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，無(wú)論作用于大腸桿菌還是枯草芽孢桿菌，模型的決定系數(shù)R2均大于0.97，Af和Bf因子均接近1，RMSE值極低，因此，Weibull模型可以精確擬合ε-聚賴氨酸殺菌動(dòng)力學(xué)過(guò)程，可用于ε-聚賴氨酸的殺菌效果擬合。

表2 不同ε-聚賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的Weibull模型參數(shù)Table 2 Fitting parameters of Weibull model for E. coli and B. subtilis under different ε-PL concentrations

殺菌動(dòng)力學(xué)研究中，研究人員大都基于培養(yǎng)法的平板計(jì)數(shù)法分析殺菌處理前后的活菌數(shù)，基于殘活率的對(duì)數(shù)值lg(N/N0)進(jìn)行擬合[18,19,22]。因此，本研究基于代謝活性進(jìn)行殺菌動(dòng)力學(xué)曲線的擬合，有一定創(chuàng)新性。

3 結(jié)論

殺菌動(dòng)力學(xué)研究是科學(xué)評(píng)價(jià)滅菌技術(shù)的一種重要手段。本文采用細(xì)胞代謝活性作為殺菌效果評(píng)價(jià)指標(biāo)，殘代謝活性百分率的對(duì)數(shù)值代替基于菌落數(shù)殘活率的對(duì)數(shù)值用于ε-聚賴氨酸殺菌效果的擬合。ε-聚賴氨酸作用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.005%時(shí)，對(duì)大腸桿菌及枯草桿菌代謝活性有一定影響，隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，活性顯著下降，0.025%ε-聚賴氨酸作用15 min后，菌體細(xì)胞僅顯示微弱活性。動(dòng)力學(xué)分析顯示Linear模型擬合度較低，R2值小于0.7，Weibull模型擬合度高，R2值大于0.97。基于代謝活性的指標(biāo)，Weibull數(shù)學(xué)模型可用于ε-聚賴氨酸殺菌效果的準(zhǔn)確擬合。