隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分子標(biāo)記技術(shù)在腸球菌分型中的應(yīng)用

付竹賢，關(guān)仁梅，王淑敏，陳偲，羅璠

（1.西南民族大學(xué)青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041）（2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041）

腸球菌是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中常見的菌株[1]，因其具有明顯益生作用，目前廣泛應(yīng)用于奶酪、泡菜、香腸等發(fā)酵食品以及動物飼料生產(chǎn)中[2]。腸球菌是一類來源廣泛、功能多樣而且又具有致病性的微生物種類，由于其抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，近年來常被作為益生菌用于飼料工業(yè)中，同種類和來源的腸球菌其功能、致病性和抗生素抗性就可能存在較大差異，因此腸球菌種的準(zhǔn)確鑒定就顯得尤為必要[3]。腸球菌種類豐富，不同種的腸球菌益生性及安全性也有明顯差異，近年來腸球菌異位感染現(xiàn)象增多，腸球菌使用的安全性受到質(zhì)疑，因此快速準(zhǔn)確區(qū)分種間腸球菌差異對于其合理使用及臨床治療都有重要意義[4]。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）是一種快速的基因分析鑒定法，自20世紀(jì)90年代問世以來，因其操作簡便快速、條帶豐富、容易分型等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于物種遺傳親緣關(guān)系分析、物種鑒定[5-8]等方面。該技術(shù)利用隨機(jī)引物對樣品進(jìn)行擴(kuò)增，事先不需要知道被測樣品的基因序列，擴(kuò)增的多態(tài)性條帶可用于樣品間親緣關(guān)系的分析[9-12]，且簡單靈敏、經(jīng)濟(jì)便捷，鑒于RAPD的明顯優(yōu)勢，目前在多種生物分型鑒定中廣泛被采用[13-19]。RAPD技術(shù)在細(xì)菌的基因分型研究中有深入地研究和應(yīng)用，如Eduardo等[20]利用RAPD-PCR分型技術(shù)對Malasseziaspp.進(jìn)行分析，可以得出不同來源的菌株彼此間的親緣關(guān)系，且發(fā)現(xiàn)特異性的擴(kuò)增帶能夠區(qū)分各菌株。Marisa等[21]利用RAPD技術(shù)對芽胞桿菌進(jìn)行分型鑒定，結(jié)果表明芽胞桿菌在屬內(nèi)存在很高的多態(tài)性。Christian等[22]比較了16S rDNA和RAPD-PCR技術(shù)檢測對171株乳酸菌分離株的鑒定結(jié)果，結(jié)果均為彎曲乳桿菌、桑弗朗西斯乳桿菌和腸球菌，兩者的鑒定結(jié)果相同。

在細(xì)菌分類學(xué)中可以使用幾種管家基因在種屬水平上進(jìn)行鑒定分析，因?yàn)樗狭思?xì)菌染色體周圍不同分子鐘的信息，除16S rDNA基因，管家基因rpoA（編碼RNA聚合酶α鏈）測序?qū)δc球菌屬的物種鑒定具有較高的鑒別力，也被用于腸球菌種水平鑒定[23]。腸球菌種間差異度小，常用的16S rDNA分析不能準(zhǔn)確區(qū)分種間腸球菌差異，目前常用于細(xì)菌基因分型的分子生物學(xué)方法，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)（RAPD）、脈沖場凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）等[24]，在腸球菌種間大規(guī)?？焖勹b定中的應(yīng)用還未見系統(tǒng)深入研究和相似度的分型標(biāo)準(zhǔn)。

因此，本研究通過構(gòu)建RAPD篩選體系和分型標(biāo)準(zhǔn)，為腸球菌菌群規(guī)?；焖勹b定提供可行的方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

已知菌株：屎腸球菌（Enterococcus faecium）B13、1003、999、1056、888、7’、106、166、1020、1018、1062、1208、1232、141、451、1074、1096；

耐久腸球菌（Enterococcus durans）15、130、426、22-2、1029、127、10’、178、1451；

海氏腸球菌（Enterococcus hirae）39、1019、1021、1041、1061、1065；

以上32株腸球菌使用16S rDNA結(jié)合rpoA管家基因鑒定。

未知腸球菌：1042、401、461、472、1231、1246、115、147、1004、1005、1009、1010、1011、1014、1016、1017、1024、1026、1027、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1037、1038、1044、1045、1049、1050、1051、1054、1055、1057、1059、1060、1064、1066、1069、1073、1082、1087、1099、1101、1008。

以上46株菌株均分離純化于農(nóng)家傳統(tǒng)泡菜，使用16S rDNA鑒定到屬水平。

1.2 主要儀器設(shè)備

立式自動壓力蒸汽滅菌器，廈門致微儀器有限公司；精密電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；微波爐，廣東美的廚房電器制造有限公司；高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；超凈工作臺，中國青島海爾有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津泰斯特設(shè)備有限公司；超微量核酸蛋白測定儀，上海學(xué)靜生物科技有限公司；智能凝膠化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，中國天能公司；PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；水平電泳儀，南京庚辰科學(xué)儀器有限公司。

1.3 主要試劑

2×Taq PCR Master Mix預(yù)混酶、Marker DL5000、Marker DL2000均購于生工生物工程（上海）股份有限公司；Agarose瓊脂糖、50×TAE電泳緩沖液和Gel RED核酸染料購于北京擎科生物科技有限公司；TE緩沖液（pH值8.0）、；PBS緩沖液（pH值7.4）、MRS液體培養(yǎng)基均購于成都欣億維有限公司；DP302型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 模板篩選

1.4.1.1 模板提取方法比對

從-20 ℃冰箱中取出保藏菌株，以1%的接種量接種于1 mL的MRS液體培養(yǎng)基，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)16 h。選用試劑盒法和微波提取法兩種方法提取基因組DNA，試劑盒提取方法按說明書操作步驟進(jìn)行，微波法提取DNA具體操作為：取細(xì)菌培養(yǎng)液1 mL，10000 r/min離心2 min，棄去上清液，用1 mL PBS溶液洗滌兩次、1 mL 1xTE溶液洗滌一次，用200 μL 1xTE溶液重懸，功率700 W的微波爐預(yù)熱1 min后，加熱2 min，13000 r/min離心5 min，收集上清液即為DNA。用超微量核酸蛋白測定儀測定2種提取方法獲得的基因組DNA OD260/OD280值和DNA的濃度，并電泳檢測基因組DNA條帶及RAPD條帶比較。

1.4.1.2 儲存時間對模板的影響

提取模板于-20 ℃分別存放0、30、50、60、70、80、90 d，電泳檢測基因組DNA的條帶及RAPD分型條帶，選取條帶清晰且重復(fù)性好的時間，作為模板保存時間。

1.4.2 單引物篩選

以基因組DNA為模板，選擇8條隨機(jī)引物，對模板DNA進(jìn)行單引物擴(kuò)增，選取條帶清晰且條帶較多的引物，用于后續(xù)試驗(yàn)。引物序列信息如表1所示。

表1 RAPD分型隨機(jī)引物序列信息Table 1 Oligonucleotide primers used to perform PCR reactions

1.4.3 RAPD雙引物反應(yīng)體系的優(yōu)化

參考劉剛[26]的多條引物擴(kuò)增條件以及擴(kuò)增體系略加修改，以屎腸球菌999為模板，隨機(jī)選用Primer1+Primer5引物分別對引物添加量、模板添加量進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.3.1 引物添加量篩選

引物添加量梯度設(shè)置為：0.1、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 μL。

1.4.3.2 模板添加量篩選

模板添加量梯度設(shè)置：0.5、1、1.5、2、2.5、3、4 μL。

1.4.4 雙引物篩選

1.4.4.1 初篩

將篩選到的多態(tài)性良好的單一隨機(jī)引物，進(jìn)行兩兩組合。在篩選得到的RAPD反應(yīng)條件下，選擇B13、1003、999、1056、15、130、178、39、1019、1021作為模板DNA，進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，篩選出特異性、穩(wěn)定性高的雙引物組合。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V，30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察后拍照留存。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4.2 復(fù)篩

在篩選得到的RAPD反應(yīng)條件下，用初篩得到的6對雙引物對32個腸球菌菌株DNA模板進(jìn)行種間RAPD分型研究。

1.4.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

1.4.5.1 擴(kuò)增批次內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

每個樣品在同個PCR儀上進(jìn)行3個RAPD-PCR平行實(shí)驗(yàn)，通過比較電泳圖譜判定RAPD-PCR的重復(fù)性。

1.4.5.2 擴(kuò)增批次間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

每個樣品，在同個RCR儀上分批擴(kuò)增3次，比較電泳圖譜判定擴(kuò)增批次間實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。

1.4.6 RAPD在腸球菌分型中的應(yīng)用和驗(yàn)證

1.4.6.1 RAPD分型

在篩選的RAPD反應(yīng)條件下，用1.4.4篩選出的最適RAPD雙引物對24株已知腸球菌和46株未知腸球菌進(jìn)行RAPD分型鑒定。

1.4.6.2 管家基因驗(yàn)證

使用rpoA基因序列分析RAPD分型中各個類別的代表菌株。

PCR反應(yīng)體系：基因組DNA 1 μL，2×Taq Master Mix預(yù)混酶12.5 μL，正反引物各1 μL，無菌雙蒸水9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，（95 ℃變性1 min，48 ℃退火1 min 15 s，72 ℃延伸1 min 15 s）3次循環(huán)，（95 ℃變性35 s，46 ℃退火1 min 15 s，72 ℃延伸1 min 15 s）30次循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。? μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物大小。對合格產(chǎn)物進(jìn)行序列測定。使用NCBI網(wǎng)站BLAST進(jìn)行在線比對，比對結(jié)果＞97%鑒定為同一菌種[27]。

1.4.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Gel RED核酸染料膠染法制膠，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于凝膠孔，電泳緩沖液為1×TAE，120 V恒壓電泳30 min后通過凝膠成像系統(tǒng)拍照。對RAPD標(biāo)記進(jìn)行處理，并按顯性標(biāo)記計數(shù)，將電泳圖上清晰的條帶標(biāo)記為“1”，而在同一位置沒有或不易區(qū)分的條帶標(biāo)記為“0”，并構(gòu)建原始數(shù)據(jù)矩陣，用NTsys進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建各菌株的遺傳距離聚類圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 模板篩選

2.1.1 模板提取方法的篩選

經(jīng)微量核酸檢測儀檢測，試劑盒法提取的DNA的OD260/280為1.8～2.0，DNA質(zhì)量濃度為123～353 μg/mL微波法所得到的DNA的OD260/280為1.9～2.1，DNA質(zhì)量濃度為106～308 μg/mL。從數(shù)據(jù)上，雖然試劑盒提取法較微波提取法好，但是微波提取法較為方便快捷，適合大規(guī)模提取，且RAPD分型效果與試劑盒結(jié)果無明顯差異，因此選擇使用微波法用于模板提取。

2.1.2 DNA模板穩(wěn)定性

模板穩(wěn)定性影響RAPD分型結(jié)果，研究結(jié)果顯示微波法提取的DNA模板在-20 ℃條件下90 d保存期間內(nèi)擴(kuò)增出的RAPD圖譜無明顯變化，說明經(jīng)由微波法提取的DNA模板在-20 ℃條件下在90 d內(nèi)均可用于RAPD-PCR分型研究。

2.2 單引物篩選結(jié)果

如圖1所示，屎腸球菌999的在8條隨機(jī)引物擴(kuò)增下Primer 1～7均可獲得多態(tài)性條帶（泳道1～7），而Primer 8沒有擴(kuò)增出條帶。因此選用Primer 1～7作為后續(xù)雙引物篩選試驗(yàn)的引物。

圖1 不同單引物的RAPD-PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 RAPD-PCR amplification by different single primer

2.3 RAPD雙引物反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.3.1 最適引物添加量

如圖2所示，引物添加量在0.1～1 μL范圍內(nèi)，隨著引物添加量的增加，擴(kuò)增結(jié)果條帶的數(shù)量和亮度均有增加，即引物添加量影響擴(kuò)增帶型的多態(tài)性，當(dāng)引物添加量大于1 μL時，無特異性條帶增加，故確定最適的引物添加量是1 μL。

圖2 不同引物添加量對菌株999的RAPD擴(kuò)增圖譜Fig.2 Influence of primer additive volume on RAPD profiles of strains 999

2.3.2 最適模板DNA添加量

由圖3所示，不同模板DNA添加量對反應(yīng)影響顯著，在0.5～1 μL范圍內(nèi)，隨著添加量的增加，帶型豐度增加，模板DNA在添加量為1 μL時擴(kuò)增的譜帶最為清晰，多態(tài)性較好；當(dāng)引物添加量高于1 μL時，擴(kuò)增的出的500 bp以下的3條帶亮度減弱，并出現(xiàn)背景彌散。這是因?yàn)楸驹囼?yàn)提取的DNA沒有經(jīng)過純化，添加量過多時會抑制RAPD-PCR的進(jìn)行，故確定最適的模板DNA添加量是1 μL。

圖3 不同DNA添加量對菌株999的RAPD擴(kuò)增圖譜Fig.3 Influence of DNA additive volume on RAPD profiles of strains 999

綜上所述，經(jīng)過單因素試驗(yàn)確定最適反應(yīng)體系為：2×PCR Taq Mix12.5 μL，模板DNA1 μL，引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。

2.4 雙引物篩選結(jié)果

將7個單引物隨機(jī)兩兩組合獲得21種組合方式，在RAPD反應(yīng)條件下分別使用21對雙引物對10株腸球菌DNA模板進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，如圖4所示，篩選得到了6對多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的雙引物組合，即Primer 1+Primer 2、Primer 1+Primer 3、Primer 1+Primer 5、Primer 2+Primer 4、Primer 3+Primer 4、Primer 3+Primer 5。

圖4 不同雙引物對菌株999的RAPD-PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.4 RAPD-PCR amplification of strain 999 by different double primers

在相同條件下，分別使用6對雙引物對已知32株腸球菌進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示使用Primer 1+Primer 3、Primer 1+Primer 5和Primer 2+Primer 4組合均可獲得豐富的多態(tài)性帶型，可擴(kuò)增出2～5個條帶；而Primer 1+Primer 2、Primer 3+Primer 5進(jìn)行RAPD-PCR時均有部分樣品沒有擴(kuò)增出條帶，Primer 3+Primer 4進(jìn)行RAPD-PCR時屎腸球菌（1096）與耐久腸球菌（130、15、426、1029、127、178、1451）無法分開，相似度100%。

目前應(yīng)用RAPD技術(shù)對乳酸菌屬間分型研究中，是在75%～88%的相似度下做到屬間分型[7,22]，目前未見RAPD技術(shù)對腸球菌種間的相似度分型標(biāo)準(zhǔn)，三種組合均能明顯找出各種間的差異，分別在86%、80%、86%的相似度下將腸球菌在種間區(qū)分。其中，從區(qū)分度來看，Primer 1+Primer 5組合分辨力最高，可作為腸球菌種間分型的最佳雙引物對。

Primer 1+Primer 3組合RAPD-PCR擴(kuò)增時發(fā)現(xiàn)在500 bp位置出現(xiàn)海氏腸球菌的特征條帶，可以作為海氏腸球菌的鑒定指標(biāo)，由圖5所示。研究發(fā)現(xiàn)，海氏腸球菌是一種低感染性的腸球菌[28]，已被國家微生物資源平臺收錄并定義為一種潛在的益生菌。有研究者從山羊奶中分離出一株具有抑菌性、耐高溫、耐酸堿，對常見抗生素敏感，無毒力基因的海氏腸球菌，經(jīng)選擇培養(yǎng)基初篩后，進(jìn)行細(xì)菌的分離純化，并采用形態(tài)學(xué)、生化試驗(yàn)及16S rDNA基因擴(kuò)增測序?qū)Ψ蛛x菌株進(jìn)行鑒定，最后鑒定結(jié)果為海氏腸球菌[29]，鑒定方法較為繁瑣，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在Primer 1+Primer 3組合進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增時發(fā)現(xiàn)500 bp位置的條帶是海氏腸球菌的特征條帶，可以作為海氏腸球菌的鑒定指標(biāo)。

圖5 Primer 1+Primer 3引物擴(kuò)增32株腸球菌指紋圖譜Fig.5 Finger print of 32 Enterococcus was amplified with Primer 1+Primer 3

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

使用Primer 1+Primer 5對10個基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖6、7，顯示在批次內(nèi)及批次間，獲得的樣品多態(tài)性圖譜結(jié)果一致，說明在優(yōu)化后的體系條件下，具有較高的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

圖6 RAPD擴(kuò)增批次內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)Fig.6 RAPD patterns of repeat test in a batch

圖7 RAPD擴(kuò)增批次間重復(fù)性試驗(yàn)Fig.7 RAPD patterns of repeat test among a batch

2.6 RAPD在腸球菌分型中的應(yīng)用和驗(yàn)證

用Primer 1+Primer 5組合對24株已知腸球菌和46株未知分離株基因組DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。由圖8可知，46株未知腸球菌和24株已知腸球菌在80%的相似度下，可以分為13個亞型。除401、461、472單獨(dú)聚在亞型11，其他43株未知菌株均與已知菌株聚類，分別是33株屎腸球菌、8株耐久腸球菌、2株海氏腸球菌；將所有菌株進(jìn)行管家基因rpoA基因序列分析，43株未知菌株的rpoA結(jié)果和RAPD結(jié)果一致，401、461、472均為耐久腸球菌，說明RAPD應(yīng)用于腸球菌鑒定結(jié)果具有可靠性。

圖8 Primer1+Primer5引物擴(kuò)增70株腸球菌的聚類樹狀圖Fig.8 Clustering tree of 70 Enterococcus was amplified with Primer1+Primer5

3 結(jié)論

本研究以分離自傳統(tǒng)自然發(fā)酵食品中的腸球菌為研究對象，從優(yōu)化RAPD體系入手，并應(yīng)用RAPD技術(shù)來對腸球菌分型。首先，高質(zhì)量的DNA是進(jìn)行PCR、基因克隆、測序和指紋圖譜等分子生物學(xué)方法的基礎(chǔ)，采用試劑盒法和微波法提取腸球菌DNA，篩選出微波法為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的提取方法；其次，研究表明，退火溫度、PCR Taq Mix酶的添加量、引物添加量、模板添加量均會影響擴(kuò)增效果。本試驗(yàn)通過對RAPD反應(yīng)條件中引物添加量、DNA模板添加量的優(yōu)化，確定RAPD最適反應(yīng)體系為：2×PCR Taq Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL；最后，RAPD-PCR存在的主要問題是很難在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室之間得到重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在保證模板樣品、在同一臺PCR儀的前提下，無論是批次內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)還是批次間驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，獲得的樣品多態(tài)性圖譜結(jié)果一致，故說明在最適的反應(yīng)體系條件下，實(shí)驗(yàn)具有很高的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

本試驗(yàn)通過引物的預(yù)篩選，得到3對多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的引物組合，即Primer 1+Primer 3、Primer 1+Primer 5和Primer 2+Primer 4組合。三種組合都可獲得穩(wěn)定性高的多態(tài)性帶型，分別在86%、80%、86%的相似度下將腸球菌在種水平上分型。Primer 1+Primer 5組合的分辨率最高，因此推薦應(yīng)用在腸球菌種間的分型中。此外，在Primer 1+Primer 3組合進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增時發(fā)現(xiàn)500 bp位置的條帶是海氏腸球菌的特征條帶，可以作為海氏腸球菌的鑒定指標(biāo)。

通過RAPD和rpoA基因序列分析對腸球菌分離株進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)RAPD結(jié)果和rpoA鑒定結(jié)果一致，說明腸球菌RAPD分型結(jié)果具有可靠性。綜合比較結(jié)果考慮，RAPD技術(shù)在腸球菌分類鑒定中有一定的應(yīng)用價值，同時它有操作簡單快速、屬間和種間區(qū)分效率高、費(fèi)用低的優(yōu)勢，與其他表型和基因型方法相結(jié)合，可提高菌種鑒定效率和準(zhǔn)確性。