豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選分離及質(zhì)譜分析

莊思遠，周旭，李彥杰，劉春明，李賽男，張語遲

（長春師范大學(xué)中心實驗室，吉林長春 130032）

豬苓［Polyporus umbellatus(Pers.) Fries］在不同地區(qū)又有豬苓多孔菌、豬靈芝、豬茯苓、地烏桃等名稱，外觀呈不規(guī)則塊狀，是多孔菌科、多孔菌屬的藥用真菌[1]。其味甘、淡，性平，具有利水、滲濕功效[2]。臨床上常用于治療急性腎炎、全身浮腫等疾病[3]，現(xiàn)代研究表明，豬苓在增強免疫力[4]、抗腫瘤[6]、保肝[7]、抗氧化[8]等方面具有一定的藥理作用。豬苓中主要化學(xué)物質(zhì)為甾體類化合物和多糖，還包含少量的含氮類、酚類等化學(xué)成分，其中甾體類化合物為主要的有效成分，包括麥角甾醇、豬苓酮A、豬苓酮B等[9,10]。因此，豬苓作為甾體類化合物含量豐富的植物，開發(fā)利用價值較高。

常用的優(yōu)化方法的是正交實驗設(shè)計、因子設(shè)計、響應(yīng)面（Response Surface Methodology，RSM）實驗設(shè)計等，傳統(tǒng)的方法存在靈活性較差，對試驗點的選擇要求高，如果試驗點的選擇不當(dāng)，則得不到理想的優(yōu)化結(jié)果等缺點。遺傳算法是一種通過模擬自然界的生物進化過程來尋找最優(yōu)解法的優(yōu)化算法，在非線性優(yōu)化問題的處理上得到了廣泛的應(yīng)用[11,12]。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種基于誤差反向傳播算法的多層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，能夠通過軟件的學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，總結(jié)出實驗數(shù)據(jù)中的規(guī)律，它以實驗數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，不需要提前給出公式的形式，在優(yōu)化提取工藝的過程中具有獨到的優(yōu)勢，因此利用遺傳算法-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)學(xué)模型優(yōu)化豬苓中麥角甾醇的提取工藝，可以達到較好的預(yù)測和優(yōu)化效果[13,14]。

豬苓具有廣泛的生物活性，成為了發(fā)掘新藥先導(dǎo)化合物的重要源泉，但成分復(fù)雜，治療作用是通過抑制酶的活性來實現(xiàn)的。超濾質(zhì)譜技術(shù)（Ultrafiltration-MS）利用親和原理篩選酶抑制劑，是近年來常用于從天然藥物中篩選黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XOD）抑制劑的方法[15]，它具有操作簡單、分析速度快、高通量等特點。分子對接是一種理論模擬方法，研究配體和受體之間的相互作用，并預(yù)測其結(jié)合方式。在天然藥物研究領(lǐng)域，分子對接技術(shù)近年來已成為一項重要技術(shù)[16]。

從天然藥物中分離黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法有硅膠柱色譜、硅藻土、AB-8大孔吸附樹脂，這些常規(guī)方法存在耗時長、死吸附大的缺點，易造成樣品的損失，為了解決這些問題，本研究建立了高速逆流色譜分離純化豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法。高速逆流色譜（High Speed Counter Current Chromatography，HSCCC）是一種液-液分配色譜技術(shù)，區(qū)別于傳統(tǒng)的固-液色譜，它無需任何固體載體作為固定相，而是由兩種互不相溶的液體作為固定相和流動相，具有固定相成本低、易回收、分離過程靈活、效率高等優(yōu)點[17,18]，在天然藥物的分離制備領(lǐng)域，被廣泛應(yīng)用。

實驗以豬苓為研究對象，綜合利用遺傳算法-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)學(xué)模型、質(zhì)譜和色譜等技術(shù)，建立了快速篩選豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法。首先，利用響應(yīng)面結(jié)合遺傳算法-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，優(yōu)化了豬苓中麥角甾醇的提取工藝；其次，以黃嘌呤氧化酶為生物靶分子，應(yīng)用超濾質(zhì)譜技術(shù)，快速篩選豬苓中潛在的酶抑制劑，同時，應(yīng)用分子對接技術(shù)驗證超濾實驗的準(zhǔn)確性；最后，以活性篩選為導(dǎo)向，利用高速逆流色譜技術(shù)分離豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑。該方法快速、靈敏，為豬苓抗痛風(fēng)等藥理作用的進一步研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試儀器：超高效液相色譜-軌道肼高分辨質(zhì)譜儀UPLC-Q Exactive MS，美國Thermo Scientific公司；Waters 2695高效液相色譜儀；；DK-98-II型恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；D-37520型離心機，美國Sigma公司；TBE300A高速逆流色譜儀，中國上海同田生物技術(shù)有限公司。

供試試劑：黃嘌呤氧化酶（1001918117）購自Fluka；對照品麥角甾醇、豬苓酮B、豬苓酮A、麥角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮、麥角甾-7,22-二烯-3-酮均購自成都埃法生物科技有限公司；超濾離心管（30 kD）購自PALL；Tris-HCl緩沖溶液購自Bueke；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）購自Thermo Fisher公司；其它試劑為分析純購自北京化工廠；豬苓購自長春市北京同仁堂藥店。

1.2 方法

1.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計

稱取干燥豬苓粉1.0 g，分別考察麥角甾醇得率受乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間和提取次數(shù)的影響。參數(shù)考察區(qū)間分別為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、70%、80%、90%、100%；液料比5、10、15、20、25（mL/g）；提取時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h；提取次數(shù)1、2、3、4 次。除說明考察因素條件不同外，其他影響因素均設(shè)置為乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%、液料比為1:20（g/mL）、提取時間為1 h、提取次數(shù)為1次。

設(shè)計響應(yīng)面試驗，以單因素為基礎(chǔ)，將響應(yīng)值設(shè)定為豬苓中麥角甾醇得率，以單因素考察的4個因素為變量，進一步優(yōu)化豬苓中麥角甾醇的提取工藝。

1.2.2 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建

3層BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型是在響應(yīng)面試驗的基礎(chǔ)上創(chuàng)建的，該模型的4個輸入變量選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)，料液比，提取時間，提取次數(shù)，輸出變量為麥角甾醇得率。隱含層數(shù)為1，內(nèi)含隱含層節(jié)點數(shù)為15，其他參數(shù)為軟件默認(rèn)值，訓(xùn)練數(shù)據(jù)使用響應(yīng)面試驗的29組數(shù)據(jù)，根據(jù)圖1創(chuàng)建的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的流程結(jié)構(gòu)，利用Matlab軟件編寫程序。

圖1 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型流程結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Flow chart of BP neural network model

1.2.3 遺傳算法尋優(yōu)

基于1.2.2創(chuàng)建的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型與遺傳算法結(jié)合對豬苓中麥角甾醇的提取工藝進一部尋優(yōu)，設(shè)定試驗參數(shù)：種群大小為50，最大進化代數(shù)為200，利用Matlab軟件程序，得到每代種群平均適應(yīng)度及變化結(jié)果。

1.2.4 高效液相色譜條件

C18色譜柱（SunFireTM，250 nm×4.6 nm，Waters），以乙腈（A）和超純水（B）作為流動相，梯度程序為：0～5 min，2% A；5～15 min，2%～5% A，15～17 min，5% A，17～50 min，5%～15% A，50～80 min，15%～93%A，80～90 min，93%～100% A，90～100 min，100% A，流速：0.4 mL/min，進樣體積：5 μL；檢測波長：254 nm。

1.2.5 超濾條件

參考文獻[19]，30 μL豬苓樣品溶液（100 mg/mL）分別與90 μL不同活度的黃嘌呤氧化酶（0.2、0.5、1.0 U/mL）混合，分別加入100 μL Tris-HCl緩沖溶液，在37 ℃水浴鍋中孵育30 min，通過30 ku超濾膜將未結(jié)合的小分子與結(jié)合的大分子進行分離。用100 μL 50%甲醇水沖洗超濾膜上大分子，離心（11000×g）10 min，若膜上還殘留有結(jié)合的大分子則重復(fù)沖洗離心?？瞻捉M加入90 μL的Tris-HCl緩沖溶液代替酶，其他條件保持不變，之后在1.2.4條件下進行檢測。樣品與酶的結(jié)合強度按下式計算：

式中：

S——樣品與酶的結(jié)合強度，%；

A1——化合物與黃嘌呤氧化酶結(jié)合后的峰面積；

A2——化合物未與黃嘌呤氧化酶結(jié)合的峰面積。

1.2.6 液質(zhì)條件

以超純水（A）和乙腈（B）作為流動相，梯度程序：0～2 min，5% B，2～15 min，5%～15% B，15～60 min，15～100% B；流速：0.2 mL/min；樣品進樣量為5.0 μL；檢測波長：254 nm。質(zhì)譜離子源：電噴霧離子源；掃描范圍m/z：100～1000；在正離子分析模式；離子源噴霧電壓4.0 kV，輔助氣為10 psi，離子肼壓力3.1×107Pa；毛細(xì)管溫度320 ℃。

1.2.7 分子對接模擬條件

為了進一步明確豬苓治療痛風(fēng)的化合物和靶點的可靠性，對豬苓治療痛風(fēng)的化合物進行分子對接，以評估其之間的結(jié)合情況。在數(shù)據(jù)庫中下載復(fù)合物。隨后，使用Autodock vina軟件對4個有效成分與黃嘌呤氧化酶進行分子對接。

1.2.8 高速逆流色譜條件

按V乙酸乙酯:V甲醇:V水=5:2:4配制溶劑系統(tǒng)，在分液漏斗中充分混合后，分出上下兩相，上相作為固定相，下相作為流動相。分別取4 mL的固定相和流動相，將400mg的豬苓粗提物溶于兩相中。

在使用固定相和流動相之前，將兩相進行超聲脫氣，將超聲脫氣后的固定相（上相）泵入高速逆流色譜儀的螺旋管中，設(shè)轉(zhuǎn)速為800 r/min，當(dāng)固定相（上相）充滿螺旋管后，以1.2 mL/min的流速泵入流動相（下相），當(dāng)流動相從出口處流出時，兩相達到平衡，從進樣圈中注入豬苓樣品溶液，在254 nm的波長下，收集餾分。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計分析在 Office Excel 2010軟件上進行，響應(yīng)面試驗結(jié)果分析在 Design Expert 11.0軟件上進行；分子對接在Autodock vina軟件上進行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬苓中麥角甾醇提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

杰克領(lǐng)美國父母走進來，蘇穆武和老伴忙迎上去。杰克介紹：這是我父親安格斯蓋爾，我母親安德莉亞。蘇穆武點頭：都姓安，中國姓。杰克又轉(zhuǎn)過身：這是我中國爸，中國媽。杰克父母上前同蘇穆武和老伴擁抱：中國巴好，中國馬好！蘇穆武說：中美友誼好，中美貿(mào)易好，都好都好！

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用軟件設(shè)計四因素三水平試驗，對豬苓中麥角甾醇的工藝條件進行優(yōu)化，試驗設(shè)計結(jié)果如表1所示。

表1 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 1 Design scheme and test results

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表1的數(shù)據(jù)進行分析，得到以麥角甾醇得率的多元二次回歸方程為：

Y=2.26+0.049A+0.035B+0.026C+0.069D-6.875×10-3AB-1.875×10-3AC+5.625×10-3AD-0.011BC+0.014BD-0.023CD-0.32A2-0.066B2-0.018C2-0.14D2。對多項式模型進行方差分析結(jié)果表明，模型的F值為71.55，P＜0.0001，失擬項的F值為4.74，P為0.0735，說明該模型擬合較好，有統(tǒng)計學(xué)意義。對各因素進行分析，得出4個因素對麥角甾醇得率的影響最大為提取次數(shù)（D），其次為乙醇體積分?jǐn)?shù)（A），液料比（B），提取時間（C）是影響豬苓中麥角甾醇得率最小的因素。

2.1.2 各因素間的交互作用分析

響應(yīng)面的3D圖能夠較為直觀的體現(xiàn)出各因素的交互作用對麥角甾醇得率的影響。曲面越陡峭，表明其對應(yīng)的對響應(yīng)值（麥角甾醇得率）的影響越顯著，得率也越大[20]。根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖。

由圖2所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間之間的曲線最陡，表明對應(yīng)因素之間的交互作用最顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的等高線圖最圓，表明對應(yīng)因素之間的交互作用對響應(yīng)值（麥角甾醇得率）的影響最不顯著。增大乙醇體積分?jǐn)?shù)可以促使細(xì)胞溶脹，有利于提取劑向細(xì)胞內(nèi)部的滲透，從而提高了麥角甾醇得率。但乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，導(dǎo)致溶液體系的極性下降，使細(xì)胞中的醇溶性與脂溶性雜質(zhì)競爭溶劑，導(dǎo)致得率呈現(xiàn)出下降的趨勢。不同交互因素之間均存在穩(wěn)定的極值，且3D圖均為開口向下的凸曲面，表明響應(yīng)值Y（麥角甾醇得率）有最大值，對麥角甾醇得率的回歸方程求極值，得到最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80.66%、液料比為16.78 mL/g、提取時間為1.56 h、提取次數(shù)為3.21次。在此條件下，麥角甾醇得率通過響應(yīng)面預(yù)測為2.28%。工藝條件根據(jù)實際操作修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)81%，液料比17 mL/g，提取時間1.60 h，提取次數(shù)3次，豬苓中麥角甾醇在此條件下提取，實測值2.31%，相對誤差1.32%。

2.1.3 遺傳算法-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和訓(xùn)練

在響應(yīng)面分析的基礎(chǔ)上，采用BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對麥角甾醇的提取工藝進行進一步優(yōu)化，采用29組試驗數(shù)據(jù)進行訓(xùn)練，經(jīng)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行訓(xùn)練，其訓(xùn)練集、驗證集、測試集和全部集結(jié)果如圖3所示。

圖3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練模型適配Fig.3 BP neural network training model adaptation

由圖3結(jié)果顯示，經(jīng)過訓(xùn)練的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測值與試驗值擬合較好，表明建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型性能可靠。圖中有一條實線和一條虛線，實線為標(biāo)準(zhǔn)值，虛線為預(yù)測值，預(yù)測輸出曲線基本與測試樣本曲線趨勢一致。訓(xùn)練集、驗證集、測試集和全部集的R2在0.8～1范圍內(nèi)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。將經(jīng)過訓(xùn)練的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)作為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)，通過選擇、交叉和變異3個步驟，尋找優(yōu)秀個體，當(dāng)個體的適應(yīng)度趨于穩(wěn)定，達到最優(yōu)狀態(tài)。

由圖4可知，經(jīng)過30代后達到最佳適應(yīng)度，此后適應(yīng)度曲線趨于穩(wěn)定，表明麥角甾醇得率達到最大。經(jīng)遺傳算法-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對豬苓中麥角甾醇的提取工藝進行優(yōu)化，得豬苓中麥角甾醇的最佳提取工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80.23%、液料比為15.84 mL/g、提取時間為1.43 h、提取次數(shù)為3.06次，在此條件下，麥角甾醇得率通過遺傳算法-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)學(xué)模型預(yù)測為2.30%。工藝條件根據(jù)實際操作修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、液料比為16 mL/g、提取時間1.4 h、提取次數(shù)3次，在此條件下，對豬苓中麥角甾醇進行提取，其得率實測值為2.31%，相對誤差為0.43%。通過遺傳算法-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)獲得的最佳工藝優(yōu)化條件參數(shù)與響應(yīng)面得到的最優(yōu)參數(shù)相近，且預(yù)測含量要高于響應(yīng)面優(yōu)化中得到的最佳含量，具有一定的準(zhǔn)確性。并且，遺傳算法-BP人神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的擬合度和預(yù)測精度都優(yōu)于傳統(tǒng)的響應(yīng)面方法。證實了該理論模型的可行性，模型預(yù)測性能良好，由此得到的麥角甾醇提取條件具有實際應(yīng)用價值。

圖4 遺傳算法的適應(yīng)度曲線Fig.4 Fitness curve of genetic algorithm

2.2 豬苓中的有效成分化學(xué)成分與黃嘌呤氧化酶生物親和作用

30 μL豬苓樣品溶液（100 mg/mL）與黃嘌呤氧化酶未結(jié)合的對照組以及分別與90 μL不同活度黃嘌呤氧化酶（0.2、0.5、1.0 U/mL）結(jié)合的實驗組的液相色譜圖如圖5所示。

圖5 豬苓提取物與黃嘌呤氧化酶結(jié)合的液相色譜圖Fig.5 Liquid chromatogram of the combination of Polyporus umbellatus extract and xanthine oxidase

由圖5可知，豬苓中化合物1、2、3和4與具有生物親和能力，其對應(yīng)的峰面積均大于空白組的峰面積，這表明，這4個化合物能夠抑制黃嘌呤氧化酶，具有潛在的抗痛風(fēng)的活性。豬苓化合物與不同活度黃嘌呤氧化酶的結(jié)合強度如表2所示。

表2 豬苓提取物與黃嘌呤氧化酶結(jié)合強度表Table 2 Binding strength of Polyporus umbellatus extract and xanthine oxidase

結(jié)果表明，化合物豬苓酮B（1）、豬苓酮A（2）與黃嘌呤氧化酶的結(jié)合強度明顯高于化合物麥角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮（3）、麥角甾-7,22-二烯-3-酮（4），其對黃嘌呤氧化酶有較強的抑制作用，化合物麥角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮（3）、麥角甾-7,22-二烯-3-酮（4）對黃嘌呤氧化酶的抑制效果不明顯，其中4個化合物對1.0 U/mL黃嘌呤氧化酶的抑制效果最強，對0.2 U/mL黃嘌呤氧化酶的抑制效果最弱。

綜上，從豬苓提取物中篩選得到4個黃嘌呤氧化酶抑制劑，均具有生物親和能力，具有潛在的抗痛風(fēng)活性。各化合物與黃嘌呤氧化酶的結(jié)合強度分別為40.77%、59.22%、17.53%、15.17%，因此抑制效果強弱順序為豬苓酮A（2）＞豬苓酮B（1）＞麥角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮（3）＞麥角甾-7,22-二烯-3-酮（4）。

2.3 豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑的液-質(zhì)分析結(jié)果

采用“1.2.4”項高效液相色譜條件分離豬苓粗提物，能夠較好的分離豬苓提取物中的化合物，液相色譜圖如圖8a所示，采用“1.2.6”項液質(zhì)條件對豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行了分析，并與標(biāo)準(zhǔn)品進行比對，結(jié)果如表3所示。

表3 豬苓粗提物中有效成分的液質(zhì)聯(lián)用分析數(shù)據(jù)Table 3 Analytical data of effective components in crude extract of Polyporus umbellatus by LC-MS

化合物1的液相保留時間為79.14 min，一級質(zhì)譜出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+（m/z476.32），經(jīng)裂解產(chǎn)生的碎片離子m/z363，m/z345，其中m/z363是母離子失去一個C7H13O產(chǎn)生的，m/z345是母離子失去一個C7H13O和一個H2O產(chǎn)生的，這些碎片結(jié)果與文獻報道豬苓酮B的主要質(zhì)譜碎片一致，其保留時間與豬苓酮B標(biāo)品一致，故推測為豬苓酮B[21]。利用上述相同的方法，推測化合物2、3和4分別為豬苓酮A、麥角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮和麥角甾-7,22-二烯-3-酮[22-24]。

2.4 豬苓中有效成分與黃嘌呤氧化酶的分子對接結(jié)果分析

采用Autodock vina將4個有效成分與黃嘌呤氧化酶進行分子對接，并預(yù)測其結(jié)合能（Binding Energy，kJ/mol）。結(jié)合能越低，對接物構(gòu)象越穩(wěn)定，活性成分與蛋白結(jié)合越牢固，親和力越好[25]。最佳結(jié)合模式如圖6所示。

圖6 不同化合物與黃嘌呤氧化酶結(jié)合的分子對接圖Fig.6 Molecular docking diagram of different compounds binding to xanthine oxidase

圖6表明，豬苓酮B與Glu263(B)形成一條氫鍵，鍵長2.91 nm、與Asp360(B)形成一條氫鍵，鍵長2.70 nm、與Lys422(B)形成兩條氫鍵，鍵長2.95和2.98 nm；豬苓酮A與Ser425(B)形成一條氫鍵，鍵長2.84 nm、與Ala424(B)形成一條氫鍵，鍵長3.14 nm、與Ile431(B)形成兩條氫鍵，鍵長2.90和3.05 nm；麥角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮與Ser425(B)形成一條氫鍵，鍵長2.94 nm；麥角甾-7,22-二烯-3-酮與Thr345(B)形成一條氫鍵，鍵長2.81 nm。此外，在周圍觀察到了疏水作用，多個力可以增加形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性。4個化合物在黃嘌呤氧化酶的活性位點均表現(xiàn)出良好的結(jié)合，因此具有潛在的抗痛風(fēng)應(yīng)用。4個化合物與黃嘌呤氧化酶的對接結(jié)合能分別為-8.6、-8.7、-8.1、-7.8 kcal/mol，結(jié)果與超濾實驗結(jié)果一致。

2.5 利用高速逆流色譜分離豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑

在高速逆流色譜中，分離的關(guān)鍵是選擇合適的溶劑系統(tǒng)，最適合的K值范圍是0.5～2.0[26]。根據(jù)化合物的特性，本研究考察了豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑在表4所列溶劑系統(tǒng)的分配系數(shù)。

表4 豬苓中有效成分在不同溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)(K)Table 4 Partition coefficient of effective components in Polyporus umbellatus in different solvent systems

從表4中可以看出，在正己烷-甲醇-水及正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水中，化合物3和化合物4的K值均大于2，采用這兩個溶劑系統(tǒng)會導(dǎo)致分離時間過長、分離效率低。在石油醚-乙腈-水中，化合物1的K值不存在，難以達到很好的分離效果。當(dāng)溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯-甲醇-水（5:2:4，V/V/V）時，4個化合物的K值分別為0.51、0.78、1.23、2.31，可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)對豬苓粗提物的分離純化，并且一次就可以得到4個化合物。實驗中還考察了流動相的流速對分離效果的影響。若流速太慢，則浪費時間；若流速太快，則分離效果不好。最終選擇流量為1.2 mL/min。

在溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯-甲醇-水（5:2:4，V/V/V），流速為1.2 mL/min，波長為254 nm，進樣體積為5 mL（樣品質(zhì)量濃度為50 mg/mL）的條件下，分離豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑，結(jié)果如圖7所示。體系固定相保留率為63%，60 min左右出溶劑峰，色譜分離出4個峰，分離時間200 min。分別收集這4個組分，蒸干后，用甲醇溶解，在1.2.4條件下采用HPLC對其純度進行檢測。

圖7 豬苓高速逆流色譜分離圖Fig.7 High speed countercurrent chromatographic separation diagram of Polyporus umbellatus

2.6 豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑分離純化結(jié)果

采用“1.2.8”項高速逆流色譜條件，采用HPLC對經(jīng)HSCCC分離得到的4個組分進行液相色譜檢測分析，其結(jié)果如圖8所示。

圖8 高速逆流色譜分離得到化合物的液相色譜圖Fig.8 Liquid chromatograms of compounds obtained by high speed countercurrent chromatography

由圖8可知，高速逆流色譜對豬苓粗提物中黃嘌呤氧化酶抑制劑有較好分離效果，與標(biāo)準(zhǔn)品進行比對，根據(jù)4個化合物在液相色譜中的保留時間，確定分離得到4個單體化合物分別為豬苓酮B、豬苓酮A、麥角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮和麥角甾-7,22-二烯-3-酮，根據(jù)面積歸一化法計算4個化合物的純度，分別為94.6%、95.2%、98.3%和96.2%。結(jié)果表明，高速逆流色譜能夠大量分離制備豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑。

3 結(jié)論

在響應(yīng)面分析的基礎(chǔ)上，經(jīng)遺傳算法-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)學(xué)模型對豬苓中麥角甾醇的提取工藝進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、液料比16 mL/g、提取時間1.4 h、提取次數(shù)3次，在此條件下，麥角甾醇得率為2.31%。建立的遺傳算法-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)學(xué)模型性能良好，可以更好的預(yù)測豬苓中麥角甾醇得率。

通過超濾質(zhì)譜法研究豬苓對黃嘌呤氧化酶的抑制作用，驗證了超濾質(zhì)譜法是一種研究配體與酶的相互作用快速靈敏有效的分析方法。從豬苓粗提物中篩選出4個黃嘌呤氧化酶抑制劑。以液-質(zhì)作為研究方法，根據(jù)正離子模式下的質(zhì)譜數(shù)據(jù)對其進行結(jié)構(gòu)解析，成功鑒定出4個化學(xué)成分，4個化合物對黃嘌呤氧化酶抑制效果大小順序為豬苓酮A（2）＞豬苓酮B（1）＞麥角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮（3）＞麥角甾-7,22-二烯-3-酮（4）。分子對接結(jié)果表明，4個化合物與黃嘌呤氧化酶的主要結(jié)合作用力為氫鍵，對接結(jié)合能分別為-8.6、-8.7、-8.1、-7.8 kcal/mol，與超濾實驗結(jié)果一致，進一步驗證了超濾實驗的準(zhǔn)確性。

高速逆流色譜法分離純化豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑具有制備量大、純化效果好、操作高效、快速的特點。選用乙酸乙酯-甲醇-水（5:2:4，V/V/V）為溶劑系統(tǒng)，在流速為1.2 mL/min，波長為254 nm，進樣體積為5 mL的分離條件，固定相保留率為63%，成功從豬苓粗提物中分離純化豬苓酮B、豬苓酮A、麥角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮、麥角甾-7,22-二烯-3-酮（純度依次為94.6%、95.2%、98.3%和96.2%），純度均達到90.0%以上。結(jié)果顯示溶劑體系選擇合理，利用該條件對豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑進行分離的效果較佳。

結(jié)果表明，利用遺傳算法-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)學(xué)模型、質(zhì)譜和色譜等技術(shù)，能夠快速篩選豬苓中黃嘌呤氧化酶抑制劑，該方法快速、靈敏，為豬苓抗痛風(fēng)等藥理作用的進一步研究提供了一定的理論依據(jù)。