四株益生菌對非酒精性脂肪性肝病的改善作用

孫怡蘭，蘇維敏，汪亦婷，張磊，劉島,，楊天心，張婉怡，陳姝丹，雷欣怡，周永芹,，劉朝奇,

（1.天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室(三峽大學(xué))，湖北省老年胃腸癌精準(zhǔn)防治臨床醫(yī)學(xué)研究中心，三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院，湖北宜昌 443002）（2.三峽大學(xué)人民醫(yī)院，湖北宜昌 443002）（3.腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室(三峽大學(xué))，湖北宜昌 443002）

隨著社會的發(fā)展，人們生活水平的不斷提高，長期高脂、高熱量飲食導(dǎo)致的超重、肥胖及一系列代謝相關(guān)疾病逐年上升[1]。肝臟作為人體最大的代謝器官，因其受累而引發(fā)的多種以代謝紊亂為特征的相關(guān)疾病已成為全球嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題[2]。

中國是一個典型的“肝炎”高發(fā)大國，除病毒性肝炎外，也常見多種非病毒性肝臟疾病，如脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎等。脂肪性肝炎根據(jù)病因不同可分為酒精性脂肪肝病及非酒精性脂肪肝?。∟onalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD），其中NAFLD已成為包括中國在內(nèi)的全球性常見肝臟疾病[3]。長期高脂和高糖飲食、年齡增長、肥胖、II型糖尿病、遺傳易感性、代謝綜合征、炎癥和腸道菌群紊亂等被鑒定為NAFLD常見的危險因素[1,4-7]。近來，有學(xué)者提出包括腸道菌群失調(diào)、腸源性內(nèi)毒素血癥和代謝性炎癥為主的“多重打擊學(xué)說”，該學(xué)說從不同角度解釋了NAFLD的部分發(fā)病機制[8,9]。

益生菌，指對宿主健康有益的活微生物，當(dāng)外源性給予一定劑量時能給宿主帶來健康益處[10]。益生菌種屬眾多，常見的主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、丙酸桿菌屬（Propionibacterium）等。研究表明，補充益生菌有助于平衡腸道菌群、調(diào)節(jié)免疫力等，有效預(yù)防和治療多種代謝、免疫相關(guān)疾病，如慢性炎癥性腸炎、NAFLD、哮喘，甚至腫瘤等[10]。益生菌的作用機制除了與病原微生物競爭粘附部位、產(chǎn)生短鏈脂肪酸、增強黏膜屏障和直接對抗病原體外，還具有調(diào)節(jié)宿主免疫功能等作用[9,11,12]。因此，補充益生菌有望成為糾正、改善受損的代謝和免疫功能的治療新方案[13,14]。益生菌的種屬、補充方式、劑量、使用者的狀態(tài)不同，所取得的效果不盡相同[10]?；诖?，本研究團(tuán)隊以不同種屬益生菌干預(yù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)的NAFLD動物模型，研究其對常見的代謝性疾病的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

丙二醛（MDA)測定試劑盒（TBA法）（A003-1-2）、總膽固醇（TC/TCH）測定試劑盒（GPO-PAP法）（A111-1-1）、甘油三酯（TG）測定試劑盒（GPO-PAP法）（A110-1-1）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶/ALT/GPT）測試盒（賴氏法）（C009-1-1）均購自南京建成生物工程研究所。磷酸二氫鉀（KH2PO4）（10017608）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）（10020318）、氯化鉀（KCl）（10016308）、氯化鈉（NaCl）（10019308）均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。MRS瓊脂和MRS肉湯培養(yǎng)基（青島海博生物）。一抗：小鼠白細(xì)胞介素6（Interleukin，IL-6）（Cat.#: 66146-1-Ig，Proteintech）；二抗：辣根過氧化物酶（Horse Radish Peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG2b（Cat.#:GB23301，Servicebio）。反轉(zhuǎn)錄試劑盒[HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)]（R312-02，Nanjing Vazyme Biotech Co. Ltd.）、定量PCR檢測試劑盒（ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，Q711-02，Nanjing Vazyme Biotech Co. Ltd.）。

所用儀器設(shè)備包括：干式恒溫箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、干熱消毒箱，中國上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；Olympus CX31雙目生物顯微鏡、全波長酶標(biāo)儀，Thermo Electron公司；Vortex-2 Genie渦旋振蕩混勻器、超薄切片機、攤片機、烤片機，德國Leica公司；AL-104分析天平、Cascade超純水儀、VS-1300L-U潔凈工作臺、79-3型磁力攪拌器，上海瀘西分析儀器廠；ND-2000NanoDrop核酸檢測儀，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA。

1.2 益生菌及降脂、抗氧化活性分析

河北一然生物科技有限公司生產(chǎn)的商品化冷凍干燥益生菌株：植物乳桿菌LP45（YMC1005）（Lactobacillus plantarum，LP）、嗜酸乳桿菌La28（Lactobacillus acidophilus，La）、鼠李糖乳桿菌LR519（Lactobacillus rhamnosus，LR）、乳雙歧桿菌BAL531（Bifidobacterium lactis，Bal）由安琪酵母股份有限公司（Angel Yeast Co. Ltd.）友情饋贈。四株益生菌分別以MRS肉湯（青島海博）在厭氧罐中初步活化，再以MRS固體瓊脂（青島海博）分離劃線，挑取單克隆進(jìn)行革蘭氏染色鑒定后使用。

益生菌的抗氧化活性檢測：參考文獻(xiàn)方法并略修改[15,16]，將新鮮傳代的LP、Bal、La、LR分別以4000 r/min離心5 min洗滌一次，MRS肉湯調(diào)整菌液濃度使成2×107CFU/mL，以每孔100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，三復(fù)孔，37 ℃溫箱中孵育3～6 h。取新鮮配制的0.00005、0.0005 mmol/L H2O2溶液，以每孔50 μL加入對應(yīng)細(xì)胞板孔，繼續(xù)培養(yǎng)16～20 h后測定菌液OD600吸光度值（A）。

益生菌的降脂活性分析：細(xì)菌同上法接種96孔板，再分別將不同濃度的膽固醇（Cholesterin，CHO）溶液（0、0.0625、0.125、0.25 g/L）以每孔100 μL加入對應(yīng)孔板中，37 ℃分別培養(yǎng)24、48 h。收集培養(yǎng)上清液，以商品化的試劑盒按照說明測定上清中CHO濃度。

1.3 實驗動物及處理

30只6周齡、雌雄各半SPF級昆明鼠，由三峽大學(xué)SPF級動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（鄂）2017-0012，動物實驗倫理審核編號2019020Y。小鼠隨機分成6組（5只/組）：正常對照組（N）、高脂飼料（High-Fat Diet，HFD）模型組（M）、HFD+益生菌實驗組：LP、Bal、La和LR共四組。其中N組給予普通飼料，其它組均給予HFD（以基礎(chǔ)飼料:豬油:果糖:膽酸鈉:膽固醇:食鹽:H2O=0.43:0.2:0.2:0.02:0.04:0.01:0.1按比例混合固定成型，輻照滅菌后備用）[17]，實驗周期21 d。此外，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，LP、Bal、La、LR組小鼠每天給予MRS肉湯厭氧條件下培養(yǎng)的200 μL 2×109CFU/mL的對應(yīng)菌液灌胃，N組和M組小鼠每天給予200 μL生理鹽水灌胃。整個實驗期間，連續(xù)監(jiān)測小鼠一般狀況和體質(zhì)量變化，并分別記錄每組小鼠的日均飲食、飲水量。

1.4 肝臟指數(shù)及附睪脂肪測定

實驗結(jié)束，小鼠稱體質(zhì)量后斷頸處死，完整摘取肝臟及附睪脂肪等內(nèi)臟組織，分別稱質(zhì)量，并按公式（1）計算肝臟指數(shù)。一部分肝臟組織置于包埋盒后4%（m/V）多聚甲醛固定，待后續(xù)組織切片；余下部分于1.5 mL EP管中迅速置于干冰中，后轉(zhuǎn)置-80 ℃超低溫冰箱儲存待用。

式中：

HI——小鼠的肝臟指數(shù)，%；

W1——小鼠的肝臟質(zhì)量，g；

W0——小鼠的體質(zhì)量，g。

1.5 肝臟組織病理及免疫組織化學(xué)分析

將多聚甲醛固定24 h的肝組織用常規(guī)方法以梯度酒精進(jìn)行程序化脫水22 h、石蠟包埋、切片（厚度4 μm）、HE染色，以單盲法由專業(yè)病理人員在顯微鏡（奧林巴斯）下觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)行病理分析并取圖。

免疫組織化學(xué)分析切片經(jīng)脫蠟至水，冷卻后以φ=3% H2O2室溫孵育5～10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min后進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加小鼠IL-6一抗（1:200）工作液，4 ℃過夜。次日PBS洗滌3次，每次5 min，滴加二抗（1:500）工作液，37 ℃孵育30 min。同前PBS洗滌3次，以DAB顯色劑顯色，鏡下觀察并及時終止，蘇木素染色后封片、鏡檢。

1.6 肝組織勻漿生化指標(biāo)檢測

稱取-80 ℃冰箱凍存的新鮮肝臟組織50 mg兩份，冰上置于組織勻漿器中，加入1 mL無水乙醇備后續(xù)總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、丙二醛（MDA）測定，或1 mL PBS用于丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）含量檢測。肝組織以3000 r/min離心，每次10 s的條件進(jìn)行勻漿。將充分研磨后的組織液轉(zhuǎn)移至無菌1.5 mL EP管中，以5000 r/min離心5 min收集上清抽提液，根據(jù)試劑盒說明書分別進(jìn)行上述肝臟生化指標(biāo)檢測。

1.7 RT-PCR檢測肝組織中炎癥因子的表達(dá)

稱取凍存小鼠肝組織50 mg，以Trizol法提取肝組織總RNA。經(jīng)1%（m/V）瓊脂糖凝膠電泳（100 V，100 mA，20 min）檢測RNA的完整性；NanoDrop分析所提RNA純度和濃度。以反轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明書操作獲得cDNA；再以通用型高靈敏度染料法定量PCR檢測試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴增目的基因。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL：10 μL PCR Master mix（2×），加入E74樣ETS轉(zhuǎn)錄因子3（E74 Like ETS Transcription Factor 3，ELF3，又名ESE1、ERT和ESX）和腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factorα，TNF-α）上下游引物各0.4 μL，加入cDNA模板1 μL，DEPC水補齊終體積至20 μL，β-actin作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39個循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，60 ℃ 15 s，共35個循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCT進(jìn)行定量分析，參照β-actin計算目的基因的mRNA相對表達(dá)量。所用引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-PCR

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)值均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。所有數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 8.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 益生菌抗氧化活性

體外培養(yǎng)結(jié)果顯示，四株益生菌La、Bal、LR和LP在與不同濃度H2O2共孵育16～20 h后，呈現(xiàn)出不同生長濁度，提示其具有一定的抗氧化活性[15]。其中Bal抗氧化能力最強，對0.00005 mmol/L的H2O2抗氧化活性達(dá)18.61%，當(dāng)H2O2為0.0005 mmol/L時，抗氧化活性為11.67%；其余三種益生菌的抗氧化活性依次分別為LR＞La＞LP（圖1a）。

圖1 益生菌體外降脂活性Fig.1 Lipid-lowering activity of probiotics in vitro

2.2 益生菌降脂活性

膽固醇含量測定結(jié)果表明，四株益生菌體外均具有較強的降脂活性，其中La在CHO質(zhì)量濃度為0.0625 g/L 24 h的降脂率最高可達(dá)46.4%，其次是LP（45.75%）；當(dāng)延長培養(yǎng)時間至48 h時，Bal降脂能力表現(xiàn)相對最強，0.25 g/L的CHO可被有效降脂35.64%，其余三株菌體外降脂活性也基本達(dá)到20%及以上（圖1b、c）。大量體外和體內(nèi)研究表明，益生菌可降低膽固醇水平[18,19]。因此，在本研究中，HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠被用來進(jìn)一步探究四株益生菌的體內(nèi)相應(yīng)生物學(xué)功能。

2.3 益生菌改善HFD小鼠一般狀態(tài)

通過飲食干預(yù)以NAFLD為主的代謝相關(guān)性疾病，已成為近年科學(xué)研究中的新熱點。研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌可通過增強細(xì)胞免疫、體液免疫，改善巨噬細(xì)胞以及NK細(xì)胞活性等方式提高機體免疫功能[20]；鼠李糖乳桿菌具有調(diào)節(jié)腸道微生物群和抑制病原體、增強免疫應(yīng)答等功能[21]。為進(jìn)一步探究益生菌對代謝性疾病的影響，在本研究中，我們評估了四株益生菌對HFD誘導(dǎo)的小鼠NAFLD的緩解作用。

實驗期間小鼠一般狀態(tài)觀察，N組小鼠毛發(fā)順滑，有光澤，活動迅速；M組小鼠飲食量增加明顯，但毛發(fā)并不如N組光澤性好，活動也不如N組多；益生菌干預(yù)組小鼠飲食量低于M組，活動較多，毛發(fā)較M組順滑有光澤。其中N組攝食量為2.51 g/d，M組攝食量最高，達(dá)8.74 g/d，與N組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；益生菌干預(yù)組小鼠攝食量均較M組低，Bal、La、LR、LP組分別為6.96、7.12、5.94、6.59 g/d，與M組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2a）。同時，干預(yù)組小鼠體質(zhì)量雖有降低但并不都很顯著，說明食物攝入量減少與體質(zhì)量減輕無嚴(yán)格對應(yīng)關(guān)系，與Wang研究團(tuán)隊[9]的結(jié)果一致。

實驗期間連續(xù)監(jiān)測小鼠體質(zhì)量，結(jié)果顯示M組小鼠體質(zhì)量增長明顯，與N組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。益生菌干預(yù)組小鼠體質(zhì)量較M組有降低，其中Bal組差異顯著（圖2b）。

肝臟指數(shù)分析顯示，M組小鼠肝指數(shù)（5.10）高于N組小鼠肝指數(shù)（4.64），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；給予益生菌Bal、La、LR、LP干預(yù)組的小鼠肝指數(shù)分別為4.33、4.00、5.49、5.51，其中Bal、La組較M組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2c）。

內(nèi)臟脂肪與肥胖的關(guān)系密切[22,23]，體內(nèi)脂肪過度沉積是導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性甚至發(fā)展為脂肪性肝炎的重要病因[24]。結(jié)果顯示，N組內(nèi)臟脂肪含量最低（0.25 g），M組最高（0.71 g），差異具有顯著性（P＜0.01）；益生菌干預(yù)組小鼠的內(nèi)臟脂肪質(zhì)量相較M組均有降低趨勢，Bal、La、LR、LP組分別為0.42、0.40、0.27、0.36 g，差異顯著（圖2d）。

2.4 益生菌調(diào)節(jié)HFD小鼠的肝臟脂肪代謝

益生菌作為腸道微生物菌群的重要組成部分，近年來吸引了大量科技工作者的研究興趣。肝細(xì)胞受損時ALT水平顯著升高[25]。TG、CHO[26]以及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物MDA[27]都與體內(nèi)脂肪代謝密切相關(guān)，其含量改變提示脂質(zhì)沉積和代謝異常。高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥是肝脂肪變性患者中最常見的脂質(zhì)代謝紊亂指標(biāo)[28]。實驗結(jié)果顯示M組小鼠肝臟組織勻漿中ALT水平（48.79 U/L）顯著高于N組（29.92 U/L），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。此外，M組的CHO（0.54 mmol/L）、MDA（14.35 mmol/L）和TG（2.39 mmol/L）含量也都明顯升高，差異具有顯著性（P＜0.01）。給予益生菌干預(yù)組小鼠的ALT均顯著低于M組（P＜0.05），提示肝功能受損狀態(tài)有所緩解。與之類似，Bal、La和LR組的CHO、MDA及TG含量相較于M組均顯著降低（P＜0.01），而LP組的CHO含量與M組相比差異不具顯著性（圖3）。

圖3 ALT、MDA、TG和CHO含量測定Fig.3 ALT, MDA, TG and CHO contents in mice

2.5 益生菌有效緩解肥胖小鼠的肝組織病理損傷

肝細(xì)胞受損、廣泛的肝臟炎癥是NAFLD患者另一重要臨床表現(xiàn)[29]。肝組織切片HE染色結(jié)果顯示，N組小鼠肝細(xì)胞大小均一，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝索沿中央靜脈放射狀整齊排列；而M組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)不均一，且肝細(xì)胞中出現(xiàn)了明顯空泡，肝索結(jié)構(gòu)破壞、排列紊亂，說明NAFLD小鼠疾病模型造模成功[30]。給予益生菌干預(yù)組小鼠的肝組織病理變化得到有效改善，肝細(xì)胞空泡數(shù)量明顯減少，肝索、肝小葉結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，提示脂肪變性緩解。上述結(jié)果共同說明益生菌可有效改善NAFLD小鼠的肝臟脂肪變性，提供肝臟保護(hù)作用（圖4）。

2.6 益生菌降低NAFLD小鼠肝臟炎癥反應(yīng)

與炎癥相關(guān)的重要細(xì)胞因子TNF-α和IL-6被認(rèn)為是促成脂肪性肝炎的因素[33]。TNF-α介導(dǎo)了脂肪肝疾病的早期以及向晚期肝病的過渡，并進(jìn)一步刺激IL-6等炎性細(xì)胞因子的釋放、招募炎癥細(xì)胞、破壞肝細(xì)胞并啟動愈合反應(yīng)，包括纖維生成等[31]。ELF3是ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與炎癥、上皮分化和腫瘤發(fā)生等多種生理、病理過程[32]。有研究結(jié)果顯示，益生菌可改善肥胖人群的體質(zhì)量和健康問題，可降低患者體內(nèi)的血脂和炎癥水平等[33-35]。在本研究中，基因表達(dá)水平分析顯示，M組小鼠肝組織中炎癥相關(guān)因子ELF3和TNF-α均顯著高于正常對照組，提示NAFLD小鼠肝臟呈現(xiàn)炎癥反應(yīng)狀態(tài)。與之相反，益生菌干預(yù)組Bal、LP的ELF3明顯降低（P＜0.05）；La、LR和LP的TNF-α顯著下調(diào)，差異具有顯著性（P＜0.05）（圖5a、b）。與之類似，肝臟切片免疫組織化學(xué)分析顯示，炎癥細(xì)胞因子IL-6在M組顯著升高，益生菌干預(yù)組呈現(xiàn)不同程度的降低，其中以Bal組下降最為明顯，LP組次之（圖5c）。

圖5 肝臟炎癥因子的表達(dá)Fig.5 Expressions of hepatic inflammatory factors at mRNA level

3 結(jié)論

綜上所述，四株益生菌Bal、La、LP、LR可有效保護(hù)HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的肝組織損傷，其機制與抗氧化、降脂、調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂肪代謝、抗炎和肝臟保護(hù)等活性相關(guān)；提示益生菌在未來新藥和食品研發(fā)中的潛在應(yīng)用價值。因此，基于益生菌的飲食干預(yù)有望成為NAFLD管理中的一種富有前景的新方法。