2021年桂林市食源性沙門菌的同源性及耐藥特征分析

王春旭，王彥文，黃輝，鄧潔妤，賀漓漓，朱相丞

桂林市疾病預(yù)防控制中心檢驗科，廣西桂林 541001

沙門菌是一種自然界中最常見的人畜共患的病原微生物，屬腸桿菌科，在動物體內(nèi)可呈現(xiàn)顯性或隱性感染，而當(dāng)人食用感染和（或）污染的動物源性食品時，可引起人食物中毒，導(dǎo)致大量感染和死亡病例，對人類健康和社會經(jīng)濟造成重大負擔(dān)[1-3]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的調(diào)查結(jié)果，沙門菌感染占細菌性食物中毒的42.6%～60.0%，被列入重度和中度風(fēng)險食源性病原體名單，且沙門菌也被認為是導(dǎo)致食物中毒的第二大病因[4]。據(jù)估計，全世界每年由非傷寒沙門菌引起的病例達9380 萬例，并造成15.5 萬例死亡，其中食源性沙門菌所致病例約占86.0%[5]。在我國，每年因感染沙門菌而患病者約達上億例，占所有食源性疾病致病菌首位[6-8]。在桂林市，歷年的食源性風(fēng)險監(jiān)測結(jié)果顯示，沙門菌檢出率最高[9-10]。

沙門菌作為重要的食源性病原菌，給人和動物的生命健康均帶來較大威脅。人和動物在治療沙門菌疾病時，抗生素的不規(guī)則使用導(dǎo)致沙門菌耐藥問題不斷出現(xiàn)[11]。近年來，細菌耐藥性（antimicrobial resistance，AMR）成為一個高關(guān)注度的全球性問題[12]。眾多研究顯示，沙門菌的耐藥狀況較為嚴(yán)重，且存在多重耐藥，對食源性疾病的防控與治療帶來更多的困難[13]。因此，很有必要了解沙門菌的感染狀況、來源及其耐藥情況，為更有效地防控食源性沙門菌的感染及危害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年分離自豬肉、草魚魚生、燒鴨等食品樣品的104 株沙門菌，連同食源性疾病主動監(jiān)測哨點醫(yī)院提供的分離于自述攝取食品后腹瀉患者的糞便/肛拭子中的12 株沙門菌，共計116 株沙門菌。

1.2 試劑

沙門菌顯色培養(yǎng)基（法國科瑪嘉CHROMagar公司）；XLT4 培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；誘導(dǎo)培養(yǎng)基（法國科瑪嘉CHROMagar 公司）；沙門菌診斷血清（丹麥SSI 公司）；革蘭陰性致病菌藥敏檢測板（賽默飛公司）；蛋白酶K（德國Merck公司）；Seakem Gold 瓊脂糖（美國Cambrex 公司）；gelred 染液（美國Biotium 公司）；XbaI 限制性內(nèi)切酶（New England 公司）。

1.3 儀器

全自動生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（法國布魯克公司）；ATB Expression 全自動細菌鑒定儀（法國生物梅里埃公司）；全自動微生物鑒定和藥敏分析儀（美國THERMO 公司）；CHEF Mapper XA 脈沖場電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；Gel Doc XR＋全自動凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.4 方法

將分離到的沙門菌菌株使用丹麥沙門菌診斷血清進行玻片凝集試驗，并依據(jù)White-Kauffmann-LeMinor抗原表判定其血清型；用革蘭陰性致病菌藥敏檢測板和全自動微生物鑒定和藥敏分析儀進行15 種抗生素的藥物敏感性實驗，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，參照2020年美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)及試劑說明書，抗菌藥物敏感性分為敏感、中介、耐藥；參照國家食源性疾病溯源網(wǎng)絡(luò)（TraNet China）操作手冊，進行CHEF-mapper 脈沖場凝膠電泳（以沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株H9812 為分子量標(biāo)記），電泳結(jié)束后，GelRed 染色，凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像，將圖譜導(dǎo)入Bionumerics 6.6 軟件進行聚類分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，采用四格表或R×C 表χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沙門菌檢出情況

在422 份樣本中，有74 份樣品檢出沙門菌，總檢出率 17.54%；市售肉制品的沙門菌檢出率為51.67%（62/120）高于腹瀉患者的沙門菌檢出率[3.97%（12/302）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；在市售肉制品中，以生豬肉的沙門菌檢出率最高，為75.00%（60/80），其次為即食生鮮水產(chǎn)品[5%（1/20）]和熟肉制品[5%（1/20）]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。

表1 不同生物樣品沙門菌檢出結(jié)果

2.2 沙門菌的同源性分析

2.2.1 檢出的沙門菌菌株情況 在所檢測的樣本中共檢出沙門菌116 株，經(jīng)鑒定分屬17 個血清型；血清型分布廣泛，主要為里森沙門菌，占菌株總數(shù)的33.62%（39/116），其次是鼠傷寒沙門菌，占25.86%（30/116）。

在所檢出的116 株沙門菌中，12 株源自腹瀉患者，104 株源自市售肉制品，其中102 株源自生豬肉、1 株源自攝食的生鮮水產(chǎn)品、1 株源自熟肉制品，見表2。

表2 沙門菌血清型分布[n（%）]

2.2.2 沙門菌菌株同源性分析 ①鼠傷寒沙門菌同源性分析：在檢出的30 株鼠傷寒沙門菌中，選取14株（其中5 株來源于生豬肉，9 株來源于腹瀉患者）進行脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE），共獲得14 個指紋圖譜，分為12 個不同圖譜類型，其中指紋圖譜相似度為100%的菌株有3 株，均來自生豬肉碎。主要形成2 簇，1 簇的聚類相似度為82.8%～100.0%，來自生豬肉和腹瀉患者，另1簇的聚類相似度為87.0%～96.6%，來自腹瀉患者，表現(xiàn)較高的親緣性，聚類分析結(jié)果見圖1。②里森沙門菌同源性分析：在檢出的39 株里森沙門菌中，選取8 株（全部來源于生豬肉）進行PFGE，共獲得8個指紋圖譜，分為6 個不同圖譜類型，其中指紋圖譜相似度為100%的菌株有2 株；聚類相似度為88.3%～100.0%，表現(xiàn)為較近的親緣關(guān)系。聚類分析結(jié)果見圖2。③倫敦沙門菌同源性分析：在20 株倫敦沙門菌中，選取6 株（其中5 株來源于生豬肉、1株來源于腹瀉患者）進行PFGE，共獲得6 個指紋圖譜，分為6 個不同圖譜類型，指紋圖譜均不相同；聚類相似度為68.5%～96.3%，聚類分析結(jié)果見圖3。

圖1 鼠傷寒沙門菌PFGE 聚類分析圖

圖2 里森沙門菌PFGE 聚類分析圖

圖3 倫敦沙門菌PFGE 聚類分析圖

2.3 沙門菌的耐藥特征分析

檢出的116 株沙門菌對四環(huán)素的耐藥率最高，達80.17%，其次是氨芐西林（70.69%）和氯霉素（65.52%）。來自食品和腹瀉患者的菌株除對頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑林的耐藥性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）外，對其余抗生素的耐藥性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表3。

根據(jù)腸桿菌科藥敏試劑板說明書的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，116 株沙門菌對四環(huán)素、氨芐西林和氯霉素的耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）值大于最高限值32μg/ml的占比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表4。

表4 不同來源的沙門菌對四環(huán)素、氨芐西林和氯霉素的耐藥情況（%）

3 討論

沙門菌是較為常見的腸道致病菌，健康動物攜帶該菌后通過各種途徑由食物鏈傳遞給人類。沙門菌所導(dǎo)致的食源性疾病暴發(fā)與食用畜禽產(chǎn)品具有較高的關(guān)聯(lián)性，可引發(fā)腸胃炎、敗血癥等疾病，對人類健康和社會經(jīng)濟造成較大影響。本研究對桂林市2021年市售肉制品與食源性腹瀉患者樣本檢測的沙門菌總檢出率為17.54%；分類分析結(jié)果顯示，來源于腹瀉患者的沙門菌檢出率為3.97%，低于十堰市、上海市青浦區(qū)等地的沙門菌檢出率[13-14]；高于云南省和江蘇省等報道的沙門菌檢出率[15-16]。源自市售肉制品的沙門菌檢出率為51.67%，其中生豬肉的沙門菌檢出率最高（75.00%），表明2021年桂林市無論是熟肉制品還是生豬肉其沙門菌檢出率均居較高水平，高于深圳市福田區(qū)、宜春市、上海市浦東新區(qū)和廣西的市售肉制品沙門菌檢出率[17-20]。

人類沙門菌的感染主要取決于其身體狀況與沙門菌的血清型，而廣泛分布于自然界的沙門菌血清型眾多。在我國積極監(jiān)測的散發(fā)性沙門菌感染中，鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌是最常見的血清型[21]；本研究檢測桂林市2021年與人類食源性中毒相關(guān)的沙門菌常見血清型，共檢出沙門菌116 株，分屬17個血清型，優(yōu)勢血清型為里森沙門菌，其次是鼠傷寒沙門菌。從不同樣本來源角度分析，市售肉制品與腹瀉患者的優(yōu)勢沙門菌血清型具有較大差異，其中腹瀉患者主要以鼠傷寒沙門菌為主，其次為倫敦沙門菌；來自腹瀉患者的結(jié)果與其他地區(qū)基本一致[16,22-24]；而源自市售肉制品中的生豬肉則主要以里森沙門菌為主，其次是鼠傷寒沙門菌，與河北省廊坊市的報道結(jié)果相似，但與廣西的既往調(diào)查結(jié)果有差異[20,25-26]。在生豬肉分離出的102 株沙門菌中，32 份生豬肉樣品同時檢出2～4 種不同血清型沙門菌，最多的混合4 種血清型。結(jié)果提示桂林市生豬的沙門菌攜帶率處于較高水平或生豬宰殺、銷售場所的沙門菌污染情況較嚴(yán)重，需要對生豬包括飼養(yǎng)、宰殺、銷售等所有環(huán)節(jié)的沙門菌污染情況及生豬肉的沙門菌攜帶情況加大防控力度，以保障廣大人民群眾的身體健康。

PFGE 被視為細菌基因分型方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”，該技術(shù)是通過限制性內(nèi)切酶切割細菌DNA，凝膠電泳成像后，在酶切圖譜上展現(xiàn)基因的序列差異，由軟件聚類分析和比對后，確定菌株間的親緣關(guān)系，實現(xiàn)細菌溯源和進化分析[27-28]。本研究對2021年檢出的鼠傷寒沙門菌、里森沙門菌、倫敦沙門菌進行聚類分析，結(jié)果提示桂林市售豬肉和腹瀉患者的鼠傷寒沙門菌和里森沙門菌具有較高的親緣性，很可能為同一傳染源；腹瀉患者體內(nèi)的鼠傷寒沙門菌很可能源自豬肉通過染色體水平轉(zhuǎn)移方式傳遞，因此，加大市售肉制品特別是生豬肉的病原體防控可有效降低食源性沙門菌食物中毒的發(fā)生。

防治沙門菌感染主要依賴抗生素的使用，但細菌耐藥性日益升高，食源性沙門菌感染的治療與控制存在一定難度。本研究的藥敏結(jié)果顯示，116 株沙門菌對四環(huán)素的耐藥率最高，其次是氨芐西林，與武漢地區(qū)、十堰市報道的結(jié)果相似[13,29]。本研究結(jié)果提示，桂林市食源性沙門菌耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，且呈現(xiàn)多重耐藥，歸因于兩方面：①細菌和其他病原體不斷進化，可抵抗大部分臨床醫(yī)學(xué)所用抗生素藥物；②發(fā)現(xiàn)新抗菌藥物的速度大幅放緩，而人和動物的抗生素使用率在不斷上升[12]；同時促成耐藥基因的傳播，且這些耐藥菌株還可通過食物鏈傳播，從而威脅公共安全，嚴(yán)重影響人類健康[30]。

綜上，桂林市食源性沙門菌檢出率較高，患者以鼠傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清型，而市售肉制品特別是生豬肉以里森沙門菌為優(yōu)勢血清型。無論來自患者還是來自市售肉制品的沙門菌耐藥率均較高，且具有多重耐藥性；四環(huán)素、氨芐西林和氯霉素是其主要耐受抗生素。市售肉制品特別是生豬肉和腹瀉患者的沙門菌有交叉感染現(xiàn)象，應(yīng)加大力度控制肉制品特別是生豬肉的沙門菌感染，同時根據(jù)本地區(qū)沙門菌的耐藥特征，制定有針對性的診療方案和預(yù)防控制措施。