miR-524-5p調(diào)控HEG1表達對食管癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

王婭菲，耿天祥，陳林林，李治國，李世朋

0 引言

食管癌（esophageal cancer, EC）是臨床上常見的遷移、侵襲能力很強的癌癥之一[1]，致病因素包括吸煙、飲酒、社會地位低下、生存環(huán)境不佳、微量元素缺乏等[2]。食管癌術(shù)后預后較差，化療是治療食管癌的主要手段，但長期使用化療藥物會產(chǎn)生耐藥性，導致治療效果不佳。目前，靶向療法在食管癌的臨床治療中已發(fā)揮了重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA及其靶基因在食管癌中與免疫浸潤、腫瘤微環(huán)境、癌癥干性特性和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）呈現(xiàn)不同程度的相關(guān)性[4]。研究表明多種miRNA通過調(diào)控其靶基因影響食管癌細胞的遷移、侵襲能力，如miR-493過表達靶向Wnt5a/PD-L1[5]、miR-2053過表達靶向KIF3C[6]等均可抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲，起抑癌作用。Starbase數(shù)據(jù)庫預測顯示miR-524-5p與具有EGF樣結(jié)構(gòu)域的心臟發(fā)育蛋白1（heart development protein with EGFlike domains 1, HEG1）有結(jié)合位點。已知HEG1在肝癌細胞中表達上調(diào)，并且可以促進肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移和EMT進程[7-8]。本研究擬探討miR-524-5p是否通過調(diào)節(jié)HEG1影響食管癌細胞的增殖、EMT和侵襲轉(zhuǎn)移并對此進行研究。

1 材料與方法

1.1 細胞

人食管癌細胞TE-1購自上海澤葉生物科技有限公司；人食管癌細胞KYSE30、KYSE150購自上海烜雅生物科技有限公司；人食管癌細胞NEC由上海生化細胞所提供；人正常食管上皮細胞HEEC購自上海研域生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基購自上海麥克林生化科技有限公司；miR-524-5p過表達（miR-524-5p mimic）或陰性對照（miR-524-5p NC）序列購自上海吉瑪制藥公司；胎牛血清（FBS）、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CCK-8試劑盒購自上海宏葉生物科技有限公司；雙熒光素酶試劑盒購自上海通蔚實業(yè)有限公司；一抗MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Snail和二抗均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；HEG1抗體購自美國Invitrogen公司。儀器：CO2恒溫培養(yǎng)箱購自德國艾本德公司；熒光倒置顯微鏡購自徠卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司；PCR儀購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將1.1中四種人食管癌細胞和人正常食管上皮細胞用RPMI1640培養(yǎng)基（含有10%FBS，青霉素100 u/ml，鏈霉素100 μg/ml），在5%CO2、 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)基，傳代培養(yǎng)至對數(shù)期用于后續(xù)實驗。調(diào)整培養(yǎng)的5種細胞濃度至每升1×107個，于6孔板每孔接入1 ml上述濃度細胞，培養(yǎng)24 h。

1.3.2 RT-qPCR檢測miR-524-5p及HEG1 mRNA表達 收集1.3.1中培養(yǎng)的細胞，加入TRIzol溶液提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行PCR擴增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，擴增條件為：95℃ 60 s, 95℃ 10 s, 60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。miR-524-5p以U6為內(nèi)參，HEG1以GAPDH為內(nèi)參。引物設(shè)計見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.3.3 HEG1在食管癌腫瘤組織和正常食管組織中的表達 利用GEPIA數(shù)據(jù)庫查詢HEG1在食管癌腫瘤組織和正常食管組織中的表達水平。

1.3.4 細胞轉(zhuǎn)染與分組 KYSE30細胞以2×105個/孔的密度接種6孔板中，37℃恒溫CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜后，采用LipofectamineTM2000試劑轉(zhuǎn)染核酸序列，實驗分為四組：轉(zhuǎn)染miR-524-5p mimic（miR-524-5p mimic組）、miR-524-5p NC（miR-524-5p NC組）、共轉(zhuǎn)染miR-524-5p NC和pcDNA3.1（miR-524-5p mimic+pcDNA3.1組）和共轉(zhuǎn)染miR-524-5p NC和pcDNA3.1-HEG1（miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1組），另設(shè)置未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞為正常對照組（Control組）。轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)6 h，棄掉培養(yǎng)基，更換為1.3.1中使用的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.3.5 細胞增殖能力檢測 使用CCK-8試劑盒檢測KYSE30細胞增殖能力，細胞按照1.3.4中的方法轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，分別于24 、48和72 h三個時間段加入CCK-8溶液，培養(yǎng)2 h后，用酶標儀在450 nm下讀取吸光度值。

1.3.6 KYSE30細胞克隆形成實驗 按照1.3.4的方法轉(zhuǎn)染細胞后，培養(yǎng)24 h后收集KYSE30細胞，重新在培養(yǎng)皿中按照1×103個/皿接種KYSE30細胞，繼續(xù)培養(yǎng)2周后，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入固定液固定15 min，棄去固定液，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察并計數(shù)克隆細胞數(shù)目。

1.3.7 Western blot檢測蛋白表達 將細胞按照1.3.4的方式培養(yǎng)24 h后，收集細胞，裂解后提取總蛋白，測定蛋白濃度。隨后進行電泳、轉(zhuǎn)膜及5%脫脂牛奶室溫封閉等操作，封閉2 h后加入一抗MMP2、MMP9、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Snail、HEG1（1:1 000）培養(yǎng)過夜，PBS清洗后加入二抗（1:2 000）培養(yǎng)2 h，GAPDH（1:1 000）為內(nèi)參，加入ECL顯影，Image J軟件分析條帶灰度值，計算蛋白表達量。

1.3.8 KYSE30細胞遷移能力檢測 細胞劃痕實驗：將細胞按照1.3.4的方法培養(yǎng)至對數(shù)期后，用無菌10 μl移液槍槍頭尖在6孔板底部垂直劃線，PBS沖洗后加入無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，分別在培養(yǎng)的0和24 h時用顯微鏡觀察并拍照，計算劃痕愈合率。

1.3.9 KYSE30細胞侵襲能力檢測 Transwell實驗：將基質(zhì)膠用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋8倍后，每個小室加入50 μl，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱（37℃）培養(yǎng)30 min，將按照1.3.4的方法轉(zhuǎn)染細胞，消化重懸后，在小室的上室中接入200 μl濃度為1×105/ml的細胞懸液，下室為600 μl含血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，加入固定液固定，結(jié)晶紫染色，擦去上室細胞，倒置顯微鏡拍照并計數(shù)。1.3.10 雙熒光素酶報告基因檢測 利用Starbase數(shù)據(jù)庫（https://starbase.sysu.edu.cn/）預測miR-524-5p與HEG1的結(jié)合位點，構(gòu)建野生型（WT）和突變型（MUT）HEG1質(zhì)粒，利用LipofectamineTM2000試劑將miR-524-5p mimic或NC和HEG1野生或突變質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染KYSE30細胞，并且轉(zhuǎn)染海腎質(zhì)粒為內(nèi)參，轉(zhuǎn)染48 h后用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS26.0和GraphPad Prism 9軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準差（±s），多組比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-524-5p和HEG1在人食管癌細胞和正常食管上皮細胞中的表達

miR-524-5p在食管癌細胞TE-1、KYSE30、KYSE150、NEC中的表達均顯著降低，HEG1 mRNA相對表達量在各細胞系中均顯著上調(diào)（均P=0.000），見表2。說明在食管癌細胞中miR-524-5p為低表達，HEG1高表達。本實驗選擇miR-524-5p表達量最低的KYSE30細胞作為后續(xù)實驗細胞。

表2 miR-524-5p和HEG1在幾種食管細胞系中的相對表達量Table 2 Relative expression of miR-524-5p and HEG1 in several esophageal cell lines

2.2 HEG1在食管癌組織和正常食管組織中的表達

在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，HEG1在食管癌組織中表達顯著高于正常食管組織（P<0.05），見圖1。

圖1 HEG1在食管癌組織和正常食管組織中的表達Figure 1 Expression of HEG1 in esophageal cancer tissues and normal esophageal tissues

2.3 KYSE30細胞增殖能力

在24、48、72h時，miR-524-5p NC組和Control組的KYSE30細胞增殖能力比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05），在24 h時，與miR-524-5p NC組比較，miR-524-5p mimic組KYSE30細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與m i m i c+p c D N A 3.1 組比較，m i R-5 2 4-5 p mimic+pcDNA3.1-HEG1組KYSE30細胞增殖能力明顯增強（P=0.000）；在48 h和72 h時，與miR-524-5p NC組比較，miR-524-5p mimic組KYSE30細胞增殖能力明顯降低（均P=0.000），與miR-524-5p mimic+pcDNA3.1組比較，miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1組KYSE30細胞增殖能力明顯增強（均P=0.000），見表3。

表3 miR-524-5p對KYSE30細胞增殖能力的影響Table 3 Effect of miR-524-5p on the proliferative capacity of KYSE30 cells

2.4 KYSE30細胞克隆形成率

miR-524-5p NC組（385.13±17.12）和Control組細胞克隆形成數(shù)（387.88±16.04）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與miR-524-5p NC組比較，miR-524-5p mimic組的KYSE30細胞克隆形成數(shù)（143.22±10.85）明顯降低（P=0.000），與miR-524-5p mimic+pcDNA3.1組（152.25±11.34）比較，miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1組KYSE30細胞克隆形成數(shù)（293.10±13.74）明顯上升（P=0.000），見圖2。

圖2 各轉(zhuǎn)染組KYSE30細胞平板克隆形成情況Figure 2 Plate clone formation of KYSE30 cells in each transfection group

2.5 KYSE30細胞中EMT、HEG1和miR-524-5p的表達

miR-524-5p NC組和Control組上皮標志蛋白E-cadherin、間質(zhì)標志蛋白Vimentin、N-cadherin、Snail以及HEG1蛋白、miR-524-5p表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與miR-524-5p NC組比較，miR-524-5p mimic組上皮標志蛋白E-cadherin、miR-524-5p表達明顯上調(diào)，間質(zhì)標志蛋白Vimentin、N-cadherin、Snail及HEG1蛋白表達明顯下調(diào)（均P=0.000），與miR-524-5p mimic+pcDNA3.1組比較，miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1組上皮標志蛋白E-cadherin、miR-524-5p表達明顯下調(diào)，間質(zhì)標志蛋白Vimentin、N-cadherin、Snail及HEG1蛋白表達明顯上調(diào)（均P=0.000），見圖3、表4。

圖3 不同轉(zhuǎn)染組中EMT相關(guān)蛋白和HEG1蛋白表達量Figure 3 EMT-related protein and HEG1 protein expression in different transfection groups

表4 不同轉(zhuǎn)染組中EMT相關(guān)蛋白和HEG1蛋白表達量Table 4 EMT-related protein and HEG1 protein expression in different transfection groups

2.6 KYSE30細胞遷移能力

miR-524-5p NC組細胞劃痕愈合率（（42.59±2.33）%）和Control組（（43.28±3.51）%）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與miR-524-5p NC組比較，miR-524-5p mimic組KYSE30細胞劃痕愈合率（（21.68±1.65）%）明顯降低（P=0.000）；與miR-524-5p mimic+pcDNA3.1組（（22.15±1.44）%）比較，miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1組KYSE30細胞劃痕愈合率（（34.25±1.65）%）明顯升高（P=0.000），見圖4。

圖4 劃痕實驗檢測各組KYSE30細胞遷移能力Figure 4 Scratch assay of the migration ability of KYSE30 cells in each group

2.7 KYSE30細胞侵襲能力

miR-524-5p NC組（212.48±9.12）和Control組細胞侵襲數(shù)目（208.26±7.48）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與miR-524-5p NC組比較，miR-524-5p mimic組KYSE30細胞侵襲數(shù)目（89.35±6.95）明顯降低（P=0.000），與miR-524-5p mimic+pcDNA3.1組（91.02±7.05）比較，miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1組KYSE30細胞侵襲數(shù)目（149.75±8.47）明顯升高（P=0.000），見圖5。

圖5 Transwell實驗檢測KYSE30細胞侵襲能力Figure 5 Invasion ability of KYSE30 cells detected by Transwell assay

2.8 侵襲遷移相關(guān)蛋白MMP2、MMP9表達

miR-524-5p NC組和Control組細胞MMP2、M M P 9 蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與miR-524-5p NC組比較，miR-524-5p mimic組KYSE30細胞侵襲遷移相關(guān)蛋白MMP2、MMP9表達明顯降低（均P=0.000），與miR-524-5p mimic+pcDNA3.1組比較，miR-524-5p mimic+pcDNA3.1-HEG1組KYSE30細胞侵襲遷移相關(guān)蛋白MMP2、MMP9表達明顯升高（均P=0.000），見圖6、表5。

圖6 侵襲遷移相關(guān)蛋白表達量Figure 6 Expression of invasive- and migration-related proteins

表5 各組KYSE30細胞中侵襲遷移相關(guān)蛋白表達量比較Table 5 Comparison of expression levels of invasionand migration-related proteins in KYSE30 cells among all groups

2.9 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

miR-524-5p可以靶向結(jié)合HEG1的3'UTR區(qū)域，見圖7。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果，miR-524-5p mimic組與WT-HEG1共轉(zhuǎn)染組細胞熒光素酶活性顯著低于miR-524-5p NC組與WT-HEG1共轉(zhuǎn)染組（P=0.000），miR-524-5p mimic組與MUTHEG1共轉(zhuǎn)染組的細胞熒光素酶活性與miR-524-5p NC組與MUT-HEG1共轉(zhuǎn)染組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），Control組、miR-524-5p NC組之間與WT-HEG1共轉(zhuǎn)染和與MUT-HEG1共轉(zhuǎn)染差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表6。說明miR-524-5p可與HEG1的3'UTR區(qū)結(jié)合。

圖7 miR-524-5p與HEG1 3'UTR結(jié)合位點Figure 7 Binding site of miR-524-5p to HEG1 3 UTR

表6 miR-524-5p靶基因驗證Table 6 Validation of miR-524-5p target gene

3 討論

食管癌是致命性的惡性腫瘤之一，已發(fā)現(xiàn)多種miRNA可以通過靶向不同靶標來調(diào)節(jié)食管癌進展，如miR-33a-5p靶向DKK1抑制食管癌進展[9]；miR-375通過阻斷ERBB2/VEGFA通路抑制食管癌發(fā)展[10]等。miR-524-5p已被發(fā)現(xiàn)對多種腫瘤細胞的耐藥性、遷移侵襲、EMT進展有抑制作用[11-13]。但尚未見miR-524-5p對食管癌細胞調(diào)節(jié)作用的相關(guān)性研究報道。本研究中首先通過miR-524-5p在食管癌四種不同細胞系和正常食管上皮細胞中的表達，確定了其在食管癌細胞中呈低表達。隨后設(shè)置miR-524-5p過表達組探討miR-524-5p對食管癌細胞增殖、遷移侵襲和EMT進程的影響。結(jié)果顯示通過過表達miR-524-5p可以顯著降低食管癌細胞的增殖能力和克隆形成，與以往研究的上調(diào)miR-524-5p可抑制胃癌細胞增殖具有一致性[14]，證明了過表達miR-524-5p可抑制食管癌細胞的增殖。

完整的EMT癌細胞狀態(tài)主要集中在復發(fā)癌組織中[15]。EMT是癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的根源，其發(fā)生過程主要表現(xiàn)為上皮標志蛋白E-cadherin下調(diào)，間質(zhì)標志蛋白N-cadherin、Vimentin、Snail等上調(diào)[16-17]。EMT與惡性腫瘤的遷移、侵襲、化學耐藥性相關(guān)[18]。因此，抑制癌細胞的EMT進程對于預防惡性腫瘤復發(fā)具有重大意義。miRNA可抑制惡性腫瘤的EMT進程，如miR-451抑制膠質(zhì)瘤細胞的EMT和轉(zhuǎn)移[19]；miRNA-10a-5p抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移[20]。本研究結(jié)果顯示，過表達miR-524-5p明顯提升了KYSE30細胞的上皮標志蛋白E-cadherin表達水平，下調(diào)了間質(zhì)標志蛋白N-cadherin、Vimentin、Snail的表達水平，表明過表達miR-524-5p抑制了KYSE30細胞EMT進程。癌細胞轉(zhuǎn)移擴散是癌癥患者死亡的主要原因，miR-524-5p過表達已被證明可以抑制乳腺癌細胞的侵襲和遷移[13]。MMP2、MMP9是與癌細胞侵襲和遷移密切相關(guān)的蛋白，抑制其表達可有效抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移擴散進程[21]。本研究劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果均顯示過表達miR-524-5p后，KYSE30細胞侵襲遷移能力減弱，且MMP2、MMP9蛋白表達下調(diào)，說明miR-524-5p過表達可抑制KYSE30細胞的侵襲遷移。

HEG1是一種新型黏蛋白樣膜蛋白，與血管生成、胚胎發(fā)育及細胞-細胞連接密切相關(guān)，在促進腫瘤進展中發(fā)揮著重要作用。已有報道顯示，HEG1在惡性間皮瘤[22]、肝細胞癌[7]、肺腺癌[23]中高表達，可作為腫瘤的診斷和治療靶點。本研究通過GEPIA數(shù)據(jù)庫對HEG1在EC中的表達進行分析發(fā)現(xiàn)HEG1在食管癌腫瘤組織中表達水平顯著高于正常組織；進一步分析顯示，HEG1在四種不同食管癌細胞系中的表達均高于正常食管上皮細胞，提示HEG1可能在食管癌中充當促癌基因。使用Stabase數(shù)據(jù)庫對miR-524-5p的潛在靶基因進行預測，發(fā)現(xiàn)HEG1與miR-524-5p存在互補的結(jié)合位點，可能為miR-524-5p的下游靶基因。雙熒光素酶報告基因檢測證實，miR-524-5p可與HEG1的3'UTR區(qū)結(jié)合；qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，過表達miR-524-5p可下調(diào)HEG1表達，表明miR-524-5p可負向調(diào)控HEG1表達。因此本研究推測，HEG1可能為miR-524-5p調(diào)節(jié)KYSE30細胞惡性生物學行為的重要靶蛋白。為了驗證此推測，本研究在過表達miR-524-5p的基礎(chǔ)上采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)HEG1表達，結(jié)果顯示上調(diào)HEG1表達可明顯減弱過表達miR-524-5p對KYSE30細胞惡性生物學行為的抑制作用，提示過表達miR-524-5p可能通過下調(diào)HEG1抑制KYSE30細胞的增殖、EMT進程和侵襲遷移。

綜上所述，miR-524-5p在食管癌細胞和組織中低表達，過表達miR-524-5p可以負向調(diào)節(jié)HEG1在食管癌細胞系KYSE30細胞中的表達，減輕KYSE30細胞的增殖、EMT進程和侵襲遷移能力。然而本研究僅開展了細胞實驗，隨后將在動物實驗中進行驗證，以期明確miR-524-5p在食管癌進展中的作用。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。