基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接研究扶正感康丸治療新型冠狀病毒感染的作用機(jī)制*

張明利,符誠(chéng),潘曄,王欣

1.河南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,河南 鄭州 450004; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450046

扶正感康丸由《醫(yī)學(xué)入門》中的經(jīng)典名方御寒湯化裁而來(lái)[1],第四批全國(guó)老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師李發(fā)枝教授在肺系疾病的治療中善于應(yīng)用此方[2-3],根據(jù)患者不同的病情加減化裁,均能取得較好療效,筆者在繼承李教授學(xué)術(shù)思想的基礎(chǔ)上,結(jié)合自身豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),研制出扶正感康丸,治療新型冠狀病毒感染及轉(zhuǎn)陰后肺脾氣陰虧虛證患者具有不錯(cuò)的療效。但由于扶正感康丸的基礎(chǔ)藥理研究較少、具體作用機(jī)制尚不明晰等問(wèn)題,制約了其進(jìn)一步發(fā)展。本研究通過(guò)對(duì)扶正感康丸組方中12味中藥進(jìn)行功效分析,選擇原方中的君藥及臣藥(黃芪、蒼術(shù)、白芷、防風(fēng)、黃芩、升麻)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,進(jìn)一步探究扶正感康丸干預(yù)新型冠狀病毒感染的作用機(jī)制,為其臨床應(yīng)用及進(jìn)一步推廣提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 扶正感康丸有效作用成分及相關(guān)靶點(diǎn)的獲取采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)、草本組鑒(http://herb.ac.cn/,HERB)聯(lián)合檢索扶正感康丸6味核心藥物(黃芪、蒼術(shù)、白芷、防風(fēng)、黃芩、升麻)的化學(xué)成分及相關(guān)靶點(diǎn)。兩者均未能檢索出相關(guān)靶點(diǎn)的成分,通過(guò)HERB、PubChem查詢化學(xué)成分的SMILES,通過(guò)SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)、STITCH(http://stitch.embl.de/,STITCH)、Similarity ensemble approach (https://sea.bkslab.org/,SEA)、SuperPred(https://prediction.charite.de/subpages/target_prediction.php)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè),去掉重復(fù)靶點(diǎn),得到最終的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。通過(guò)Uniport將活性成分相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后,將6味核心藥物、活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建“核心藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),并采用Analyze Network功能分析活性成分相關(guān)靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系,以發(fā)現(xiàn)核心成分。

1.2 新型冠狀病毒感染疾病靶點(diǎn)的獲取及其與活性成分相關(guān)靶點(diǎn)交集靶點(diǎn)的獲取分別在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)、國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(National Center for Biotechnology Information,NCBI,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genome.jp/kegg/)中以“新冠肺炎”為關(guān)鍵詞獲取相關(guān)疾病靶點(diǎn)。刪除各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出來(lái)的重復(fù)靶點(diǎn),得到新型冠狀病毒感染最終疾病靶點(diǎn)。取活性成分相關(guān)靶點(diǎn)及新型冠狀病毒感染疾病靶點(diǎn)的交集,得到交集靶點(diǎn)。通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)建“核心藥物-疾病-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),再通過(guò)軟件計(jì)算節(jié)點(diǎn)度值等指標(biāo),找到核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建String數(shù)據(jù)庫(kù)可以檢索蛋白質(zhì)之間的相互作用,有簡(jiǎn)單的分析與聚類功能。本研究采用String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析,將結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)出,并采用Cytoscape軟件對(duì)節(jié)點(diǎn)的重新排列與屬性進(jìn)行分析,從而找出關(guān)鍵基因靶點(diǎn)。

1.4 基因本體富集分析及KEGG信號(hào)通路富集分析采用Metascape(http://metascape.org/gp/index.html)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析,其中選取的GO富集分析主要包含細(xì)胞組成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)和生物過(guò)程(biological process,BP)并進(jìn)行功能注釋。為了深入研究關(guān)鍵靶點(diǎn)治療新型冠狀病毒感染涉及的主要通路、組織分布及亞細(xì)胞定位,首先對(duì)關(guān)鍵通路進(jìn)行分析,并篩選關(guān)鍵通路涉及的靶點(diǎn),通過(guò)檢索BioGPS(http://biogps.org/)及Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)得到其組織分布及亞細(xì)胞定位數(shù)據(jù)。

1.5 分子對(duì)接結(jié)合“核心藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及“核心藥物-疾病-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)選取關(guān)鍵成分。根據(jù)成分分子的CAS號(hào)從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載SDF格式的3D結(jié)構(gòu),將結(jié)構(gòu)導(dǎo)入ChemBio3D Ultra 14.0 進(jìn)行能量最小化,將Minimum RMS Gradient設(shè)置為0.001,將小分子保存為mol2格式。將優(yōu)化好的小分子導(dǎo)入AutodockTools-1.5.6進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、分配電荷、設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵后保存為“pdbqt”格式。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)及通路分析結(jié)果中的靶點(diǎn)選取關(guān)鍵靶點(diǎn),從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的PDB ID,將蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Pymol 2.3.0去除蛋白結(jié)晶水、原始配體等,將蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDocktools進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、分配電荷、指定原子類型并保存為pdbqt格式。使用POCASA 1.1預(yù)測(cè)蛋白結(jié)合位點(diǎn),采用AutoDock Vina1.1.2進(jìn)行對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 扶正感康丸有效作用成分及靶點(diǎn)扶正感康丸6味核心藥物共含活性成分99個(gè),其中黃芪17個(gè),白芷20個(gè),蒼術(shù)4個(gè),防風(fēng)18個(gè),黃芩32個(gè),升麻8個(gè),經(jīng)過(guò)篩選去重后得到活性成分85個(gè)。通過(guò)Uniport將活性成分相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后得到226個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。將6味核心藥物、活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,構(gòu)建“核心藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),如圖1所示,該網(wǎng)絡(luò)由317個(gè)節(jié)點(diǎn)及 1 535 條邊組成,綠色圓形節(jié)點(diǎn)代表單味中藥,各色八角形節(jié)點(diǎn)代表相關(guān)活性成分,單味中藥節(jié)點(diǎn)位于活性成分組成的圓形的中心;多味中藥相連的成分是共有活性成分;黃色菱形節(jié)點(diǎn)代表活性成分相關(guān)靶點(diǎn),與各個(gè)成分相連,以方形排列。從網(wǎng)絡(luò)圖可以看出,扶正感康丸6味藥的有效成分之間有交集,而交叉成分與基因靶點(diǎn)有更多的關(guān)聯(lián),可能為扶正感康丸治療新型冠狀病毒感染的關(guān)鍵成分。對(duì)有效成分進(jìn)行梳理發(fā)現(xiàn),關(guān)鍵成分為槲皮素(quercetin,HQ17)、漢黃芩素(wogonin,CZFFHQIN1)、β-谷甾醇(beta-sitosterol,BZFFHQIN1)、豆甾醇(stigmasterol,BZHQINSM1)、1,7-二羥基-3,9-二甲氧基紫檀烯(1,7-dihydroxy-3,9-dimethoxy pterocarpene,HQ16)、FA(HQ14)、黃芩素(baicalein,HQIN3)、山柰酚(kaempferol,HQ13)、別歐前胡素(prangenidin,BZFF5)。

圖1 扶正感康丸“核心藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 新型冠狀病毒感染疾病靶點(diǎn)及其與活性成分相關(guān)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)檢索Genecards、NCBI及KEGG 3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù),并將獲得的靶點(diǎn)去重后得到新型冠狀病毒感染疾病靶點(diǎn)3 510個(gè)。與226個(gè)活性成分相關(guān)靶點(diǎn)取交集,得到86個(gè)交集靶點(diǎn),并構(gòu)建“核心藥物-疾病-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖2,左側(cè)中心位置綠色節(jié)點(diǎn)為6個(gè)主要藥物,周圍藍(lán)色方形節(jié)點(diǎn)為藥物對(duì)應(yīng)成分,右側(cè)紅色方形節(jié)點(diǎn)為新型冠狀病毒感染,外圈黃色方形為交集靶點(diǎn)。從網(wǎng)絡(luò)圖可以看出,核心藥物相關(guān)活性成分與多個(gè)交集靶點(diǎn)相連,其中與活性成分相關(guān)較多的靶點(diǎn)可能為扶正感康丸治療新型冠狀病毒感染的關(guān)鍵靶點(diǎn)。從圖中發(fā)現(xiàn),核心成分分別為異鼠李素(isorhamnetin)、刺芒柄花素(formononetin)、山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、漢黃芩素(wogonin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、黃芩素(baicalein);關(guān)鍵靶點(diǎn)為前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)、雄激素受體(androgen receptor,AR)、DPP4、熱休克蛋白90AA1(heat shock protein 90AA1,HSP90AA1)、PRKACA、F2等。

圖2 “核心藥物-疾病-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)包含86個(gè)節(jié)點(diǎn),1 297條邊,導(dǎo)出數(shù)據(jù)文件并通過(guò)Cytoscape軟件將節(jié)點(diǎn)大小與顏色深淺與度值對(duì)應(yīng),建立PPI網(wǎng)絡(luò)方形圖,見(jiàn)圖3。使用軟件的Analyze Network功能進(jìn)行拓?fù)浞治?節(jié)點(diǎn)度值中位數(shù)為30.5。以中位數(shù)的1.5倍,即度值46對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行篩選,得到的17個(gè)節(jié)點(diǎn),分別為白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、蛋白激酶Bα(protein kinase B α,AKT1)、IL-1β、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、IL-8(又稱CXCL8)、JUN、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、IL-10、缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF1α)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、FOS、一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3,NOS3)、熱休克蛋白90AA1(heat shock protein 90AA1,HSP90AA1)、NFKBIA、干擾素-α(interferon-α,IFN-α,IFNG)、血紅素加氧酶(heme oxygenase 1,HMOX1)。

2.4 基因本體富集分析及信號(hào)通路富集分析Metascape數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,GO富集分析中,CC主要集中在細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(transcription regulator complex)等;BP主要包括細(xì)胞因子反應(yīng)(response to cytokine)、細(xì)胞死亡的正調(diào)控(positive regulation of cell death)、細(xì)胞分化負(fù)調(diào)節(jié)(negative regulation of cell differentiation)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)、MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的正調(diào)節(jié)(regulation of MAPK cascade)、外源性凋亡信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控(negative regulation of extrinsic apoptotic signaling pathway)、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控(regulation of apoptotic signaling pathway);MF主要包括RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、蛋白質(zhì)同源二聚化活性(protein homodimerization activity)。見(jiàn)圖4。KEGG共富集得到191條信號(hào)通路,選取P值前14位的信號(hào)通路進(jìn)行可視化分析,見(jiàn)圖5,其中與扶正感康丸治療新型冠狀病毒感染密切相關(guān)的前6條通路分別為血脂和動(dòng)脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、腫瘤信號(hào)通路(pathways in cancer)、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)傳導(dǎo)途徑(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、MAPK 信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、化學(xué)致癌作用-活性氧通路(chemical carcinogenesis - reactive oxygen species)、NF-kappa B 信號(hào)通路(NF-kappa B signaling pathway)。

圖4 GO富集分析條形圖

圖5 KEGG信號(hào)通路氣泡圖

2.5 通路關(guān)鍵靶點(diǎn)分析及其組織分布、亞細(xì)胞分布?xì)w屬為了進(jìn)一步挖掘扶正感康丸治療新型冠狀病毒感染各通路中的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)及相關(guān)分布信息,對(duì)6條關(guān)鍵通路涉及的59個(gè)靶點(diǎn)再次做PPI網(wǎng)絡(luò)分析。通過(guò)對(duì)59個(gè)靶點(diǎn)在通路中的出現(xiàn)次數(shù)及新PPI網(wǎng)絡(luò)度值進(jìn)行篩選(度值≥中位數(shù)),得到17個(gè)關(guān)鍵基因靶點(diǎn),如表1。在BioGPS數(shù)據(jù)庫(kù)檢索關(guān)鍵靶點(diǎn)的體內(nèi)組織分布情況并根據(jù)基因表達(dá)保留前5位數(shù)據(jù),繪制靶點(diǎn)-組織分布網(wǎng)絡(luò)分析圖,見(jiàn)圖6,中間位置紅色菱形節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵靶點(diǎn),周圍綠色橢圓形代表組織分布。通過(guò)軟件計(jì)算節(jié)點(diǎn)度值并排序,其中平滑肌(Smooth Muscle.1,degree=4;Smooth Muscle.2,degree=4)、肺(Lung.2,degree=4)可能為扶正感康丸治療新型冠狀病毒感染的靶器官。在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索靶點(diǎn)的基因定位信息,得到亞細(xì)胞分布數(shù)據(jù),并根據(jù)其置信度(confidence)值保留前五位,繪制靶點(diǎn)-亞細(xì)胞分布網(wǎng)絡(luò)分析圖,見(jiàn)圖7,其中紅色菱形代表關(guān)鍵靶點(diǎn),藍(lán)色六邊形代表亞細(xì)胞分布信息。結(jié)果顯示,關(guān)鍵靶點(diǎn)多分布于細(xì)胞核(nucleus,degree=17)、細(xì)胞膜(plasma membrane,degree=12)、細(xì)胞質(zhì)(cytosol,degree=12)、細(xì)胞外(extracellular,degree=10)、細(xì)胞骨架(cytoskeleton,degree=10)、線粒體(mitochondrion,degree=9)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,degree=7)等。

表1 關(guān)鍵靶點(diǎn)在關(guān)鍵通路出現(xiàn)次數(shù)及度值

圖6 關(guān)鍵靶點(diǎn)-組織分布網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 關(guān)鍵靶點(diǎn)-亞細(xì)胞分布網(wǎng)路圖

2.6 分子對(duì)接為了深入分析扶正感康丸治療新型冠狀病毒感染的關(guān)鍵分子機(jī)制,分別選取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前6位的靶點(diǎn)IL-6、TNF、AKT1、IL-1β、TP53、CXCL8為受體,以6個(gè)度值較大的核心成分槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、豆甾醇(stigmasterol)、漢黃芩素(wogonin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、黃芩素(baicalein)為配體,使用AutoDock Vina1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證,結(jié)合能矩陣如圖8所示。結(jié)合能越低說(shuō)明分子對(duì)接越穩(wěn)定,結(jié)合能小于0 kcal·mol-1說(shuō)明具有結(jié)合活性,結(jié)合能小于-7 kcal·mol-1說(shuō)明結(jié)合活性較好,結(jié)合能小于-9 kcal·mol-1說(shuō)明結(jié)合活性非常強(qiáng)。根據(jù)結(jié)合能矩陣發(fā)現(xiàn),扶正感康丸中有效成分與核心靶點(diǎn)之間的結(jié)合能力較好,TNF與所有小分子的結(jié)合能均低;與黃芩素對(duì)接最好的靶點(diǎn)是IL-1β;與 β-谷甾醇對(duì)接最好的靶點(diǎn)是IL-6;與槲皮素及山柰酚對(duì)接最好的靶點(diǎn)均均為TNF。利用Pymol 2.3.0對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化,見(jiàn)圖9。

圖8 有效成分與靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接結(jié)合能熱圖

圖9 扶正感康丸核心化合物與蛋白分子對(duì)接示意圖

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),傳染性非典型肺炎冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)表面的刺突蛋白受體結(jié)合域與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)結(jié)合,并最終導(dǎo)致新型冠狀病毒感染的產(chǎn)生,而ACE2則廣泛分布于人體多種細(xì)胞類型中,包括口腔和鼻黏膜、肺、心臟、胃腸道、肝臟、腎、脾、大腦以及動(dòng)脈和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[4]。新型冠狀病毒感染常見(jiàn)發(fā)熱、咳嗽、呼吸急促以及疲勞、肌痛、惡心、嗅覺(jué)喪失等癥狀,多種并發(fā)癥出現(xiàn)可導(dǎo)致病情危重,包括肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、多器官損傷、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和敗血癥等[5],甚至出現(xiàn)死亡。中醫(yī)藥在新型冠狀病毒感染的防治中發(fā)揮了積極的作用,可有效改善患者癥狀及預(yù)后,且相對(duì)于西醫(yī)治療而言,中西醫(yī)結(jié)合治療有著更高的治愈率[6]。中醫(yī)學(xué)將新型冠狀病毒感染歸為“疫病”范疇,根據(jù)其具體疾病的特性可分為寒疫、濕疫、寒濕疫、溫疫、濕熱疫等[7]。目前,主流觀點(diǎn)認(rèn)為本病病位主要在肺衛(wèi)、其次在脾,大量臨床研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)[8-10]。而人體感受外界之“戾氣”為本病病因,疫癘之邪由外而內(nèi)侵犯人體,其傳染性強(qiáng)、傳變形式多、病變迅速。本病初起病在肺衛(wèi),寒濕或濕熱之邪犯衛(wèi),郁于肌表;后邪氣郁而化熱,熱邪閉肺;若正不勝邪,邪氣更進(jìn),致使疫毒閉肺甚至出現(xiàn)內(nèi)閉外脫之證[11]。目前,社會(huì)上對(duì)于新型冠狀病毒感染患者核酸轉(zhuǎn)陰后復(fù)陽(yáng)、抗體持續(xù)時(shí)間短、可重復(fù)感染等情況存在擔(dān)憂,研究者認(rèn)識(shí)到新型冠狀病毒對(duì)于人體的影響廣泛且持久,因此新型冠狀病毒感染恢復(fù)期的治療應(yīng)當(dāng)延長(zhǎng),可作為院外康復(fù)的一部分。國(guó)家診療指南提出新型冠狀病毒感染恢復(fù)期的中醫(yī)分型為肺脾氣虛、氣陰兩虛,其實(shí)二者常常并存,因“脾在體合肉”“肺者,氣之本”,疫病后期,熱毒、濕濁等邪損耗氣陰,勞困脾肺而致肺脾兩虛、氣陰兩傷,可出現(xiàn)乏力、氣短、口干、口渴、心悸、汗多、納差等一系列臨床表現(xiàn),故治療多從健脾益氣、養(yǎng)陰潤(rùn)肺入手。

扶正感康丸由御寒湯化裁而來(lái),原方包含12味中藥,關(guān)鍵藥物有6味,分別是黃芪、蒼術(shù)、白芷、防風(fēng)、黃芩、升麻。黃芪為本方中用量最大之品,為君藥,《神農(nóng)本草經(jīng)》謂其“補(bǔ)虛”“止痛”,黃芪氣味甘溫,溫之以氣,而補(bǔ)形之不及,益之以味,而壯精之不足,黃芪以補(bǔ)氣為長(zhǎng),可強(qiáng)五臟,故李中梓云:“黃芪之用,專能補(bǔ)表”。蒼術(shù)、白芷、防風(fēng)、黃芩、升麻以醒脾行氣,發(fā)表通里為主,此五者共為臣藥。蒼術(shù)辛溫、苦溫之性味,功善燥濕健脾,祛風(fēng)散寒,葉天士稱其“苦辛氣烈,能上行,除上濕,發(fā)汗功大”。濕邪內(nèi)生,蒼術(shù)可化脾家之濕,亦可醒脾,鼓動(dòng)脾氣運(yùn)行;防風(fēng)味辛、甘,性溫,《神農(nóng)本草經(jīng)》曰:“主大風(fēng),頭眩痛,惡風(fēng),風(fēng)邪。”功善解表,其常與黃芪相伍,既可益氣固表,又可祛邪而不傷陽(yáng),此乃散中寓補(bǔ)、補(bǔ)中兼疏之應(yīng)用;升麻味甘、辛,性微寒,善于發(fā)表散熱,兼以升陽(yáng),《神農(nóng)本草經(jīng)》曰:“辟溫疾?！崩顤|垣《脾胃論》記載其“引甘溫之藥上升……人參、黃芪,非此引之,不能上行”,由此可以看出升麻起到諸藥使者的作用,因肺臟位于上焦,居于高位,故諸藥借助升麻升發(fā)的特性上行到達(dá)病所;溫病后期,正氣損傷而余邪未凈,黃芩主入肺經(jīng),善清瀉肺火及上焦實(shí)熱,性味苦寒,亦能清熱燥濕,故常用于治療濕溫疫毒;白芷辛溫,黃元御在《玉楸藥解》中提到白芷“行經(jīng)發(fā)表,散風(fēng)瀉濕,治頭痛鼻淵”,黃芩與白芷寒溫并用,表里同治,共驅(qū)余邪外出。

通過(guò)復(fù)方成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn),扶正感康丸6個(gè)主要藥物具有多成分多靶點(diǎn)的特性;另外通過(guò)與新型冠狀病毒感染疾病靶點(diǎn)取交集構(gòu)建的復(fù)方-疾病-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn),扶正感康丸治療新型冠狀病毒感染發(fā)揮主要作用的藥物成分為異鼠李素、芒柄花黃素、山柰酚、槲皮素、漢黃芩素、黃芩素、β-谷甾醇。扶正感康丸的活性成分具有相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)化協(xié)同作用,可調(diào)節(jié)宿主生理活動(dòng),包括對(duì)炎癥反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞死亡的正調(diào)控等,與中醫(yī)之正邪理論有異曲同工之妙。研究發(fā)現(xiàn),山柰酚通過(guò)其抗炎、抗氧化、抗凋亡及神經(jīng)保護(hù)作用,能夠有效改善腦缺血/再灌注大鼠的腦損傷,另外也具有抗腫瘤、抑菌等作用。槲皮素同樣具有抗炎作用,還可以抑制纖維化、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)腸道菌群,在保護(hù)肺臟、腎臟等方面發(fā)揮重要作用。最新的研究表明,槲皮素可以有效改善新型冠狀病毒感染患者的癥狀,且接受槲皮素治療的患者相對(duì)于接受標(biāo)準(zhǔn)治療方案患者的C反應(yīng)蛋白和鐵蛋白水平更低[12];另有研究表明,山柰酚和槲皮素可以通過(guò)顯著減少促炎介質(zhì)TNF-α以及IL-1β的產(chǎn)生來(lái)降低新型冠狀病毒感染癥狀的嚴(yán)重程度[13-14]。蒼術(shù)和黃芩中均含有漢黃芩素、黃芩素,這兩種成分均有抗動(dòng)脈硬化、腎臟保護(hù)、降低關(guān)節(jié)炎癥、促進(jìn)眼部血管新生等作用。有研究表明,黃芩素可有效抑制RNA聚合酶以控制新型冠狀病毒感染病毒感染[15];同時(shí),黃芩素以mPTP依賴性方式干擾線粒體OXPHOS,并抑制SARS-CoV-2/VSV的復(fù)制[16]。β-谷甾醇可以有效止咳、祛痰、調(diào)節(jié)免疫。β-谷甾醇和β-谷甾醇-O-葡萄糖苷通過(guò)阻斷血凝素表面蛋白的活性結(jié)合位點(diǎn)表現(xiàn)出抗病毒活性,還可通過(guò)與流感神經(jīng)氨酸酶活性結(jié)合和阻斷M2質(zhì)子通道活性的活性位點(diǎn)顯示出對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用[17];另外,β-谷甾醇也可通過(guò)降低中性粒細(xì)胞趨化作用以發(fā)揮抗炎作用[18]。異鼠李素、芒柄花黃素為黃芪中發(fā)現(xiàn)的黃酮類物質(zhì),這兩種成分均有顯著的抗腫瘤作用,多項(xiàng)研究表明異鼠李素還具有抗炎、抗病毒等多種生物學(xué)功能,在流感、急性肺損傷、心肌炎、肺動(dòng)脈高壓等呼吸系統(tǒng)疾病中均具有抗炎作用,其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)及活性氧的產(chǎn)生等有關(guān)。異鼠李素可以通過(guò)阻斷RIG-I/JNK和p1 MAPK信號(hào)通路抗流感病毒活性,同時(shí)異鼠李素可以通過(guò)抑制RIG-I/JNK途徑來(lái)減少IFN擴(kuò)增的流感病毒介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[19]。

由PPI網(wǎng)絡(luò)分析可以得出,扶正感康膠囊是通過(guò)作用于IL-1β、IL-6、TNF、EGFR、AKT1、TP53、CXCL8等多個(gè)核心靶點(diǎn),并通過(guò)各靶點(diǎn)之間的協(xié)同作用治療新型冠狀病毒感染。IL-6是一種可溶性介質(zhì),在免疫系統(tǒng)中具有多種功能,包括控制免疫細(xì)胞的分化和遷移、靶細(xì)胞的凋亡以及C反應(yīng)蛋白、結(jié)合珠蛋白和纖維蛋白原等急性期蛋白的合成[20]。以 IL-6 為核心的靶向細(xì)胞因子釋放綜合征被認(rèn)為是新型冠狀病毒感染患者出現(xiàn)凝血紊亂的關(guān)鍵機(jī)制[21-22]。研究表明,IL-6的水平與新型冠狀病毒感染病情的嚴(yán)重程度高度相關(guān),阻斷IL-6對(duì)嚴(yán)重病例有益,并可能降低死亡率[23]。TNF-α是管理宿主防御機(jī)制的最重要細(xì)胞因子之一,可能在新型冠狀病毒感染患者的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用,其與IL-6、IL-1β等都和細(xì)胞因子風(fēng)暴密切相關(guān),是導(dǎo)致新型冠狀病毒感染惡化的關(guān)鍵因素[24]。與此同時(shí),有研究表明,新型冠狀病毒感染的急性后遺癥與IL-1β、IL-6和TNF血漿水平升高有關(guān),這些細(xì)胞因子在新型冠狀病毒感染肺部促炎巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo),從而形成自我維持的反饋回路[25]。另外,一些炎癥因子(如IL-6、TNF-α)可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞表面組織因子表達(dá)再次激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng),使凝血-免疫功能紊亂形成惡性循環(huán),進(jìn)一步加速了疾病進(jìn)展[26]。AKT在免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)中也起著至關(guān)重要的作用,可以調(diào)節(jié)先天免疫細(xì)胞的發(fā)育和功能,如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。同時(shí),AKT是調(diào)節(jié)新陳代謝和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的信號(hào)通路中的核心參與者,其通過(guò)激活一系列不同的下游信號(hào)分子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和腫瘤相關(guān)疾病[27]。AKT信號(hào)在免疫細(xì)胞分化、增殖和遷移中起著關(guān)鍵作用,這涉及全身和局部炎癥的形成。然而,病毒感染期間AKT的過(guò)度激活可導(dǎo)致終末分化效應(yīng)CD8 T細(xì)胞升高,隨后衰老CD8 T細(xì)胞升高。免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能迅速導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭,并顯著增加感染SARS-CoV-2的患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[28]。趨化因子可由多種細(xì)胞迅速分泌,以響應(yīng)病毒或微生物感染。趨化因子CXCL8在病毒感染的背景下參與炎癥和免疫細(xì)胞運(yùn)輸[29]。CXCL8對(duì)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞具有趨化活性,在呼吸道感染的初始控制中起主要作用[30];另有研究表明,CXCL8是重癥新型冠狀病毒感染患者支氣管肺泡灌洗液中檢測(cè)到的最豐富的細(xì)胞因子[31]。

KEGG通路結(jié)果涵蓋了NF-κB信號(hào)通路、MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路等。新型冠狀病毒感染依賴性炎癥被認(rèn)為是RAGE細(xì)胞因子產(chǎn)生增加和過(guò)度活躍而發(fā)生的,其涉及AGEs和RAGE受體的途徑改變新陳代謝并誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子[32];病毒蛋白改變了糖酵解途徑,導(dǎo)致糖酵解中間體增加,丙酮酸降低,隨著糖酵解功能的失調(diào),AGEs不斷積累,并隨之與其受體RAGE結(jié)合,最終激活了 NF-κB 信號(hào)通路,導(dǎo)致促炎基因的激活,如 IL-1β 和IL-6,從而增加缺氧并誘導(dǎo)衰老[33-34]。MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路可調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程,是介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化及應(yīng)激、凋亡等基本過(guò)程的中心信號(hào)通路[35-36]。MAPK通路響應(yīng)并控制潛在有害促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。幾種致病性病毒感染誘導(dǎo)p38 MAPK信號(hào)通路,并表現(xiàn)出不受控制的正反饋調(diào)節(jié),導(dǎo)致與嚴(yán)重疾病相關(guān)的過(guò)度炎癥[37]。有研究顯示,新冠病毒感染促進(jìn)了酪蛋白激酶p38 MAPK活化,產(chǎn)生多種細(xì)胞因子并導(dǎo)致有絲分裂激酶失活,導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯[38]。MAPK的激活可歸因于肺細(xì)胞中的ACE2信號(hào)傳導(dǎo),MAPK在ACE2下游被激活,研究發(fā)現(xiàn),MAPK磷酸化通過(guò)激活血小板中的cPLA2來(lái)促進(jìn)血栓素的生成,而MAPK抑制劑可以逆轉(zhuǎn)新冠病毒誘導(dǎo)的血小板活化,從而改善由新冠病毒引發(fā)的不受控制的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)和隨之帶來(lái)的肺損傷[39-40]。NF-κB是經(jīng)典的調(diào)控病毒或多種炎癥細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,可增加活性氧的產(chǎn)生,導(dǎo)致許多疾病和病毒感染中各種組織中的細(xì)胞凋亡[41]。新型冠狀病毒感染本身通過(guò)模式識(shí)別受體激活NF-κB,積累的AngⅡ通過(guò)崩解素和金屬蛋白酶6誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子,包括TNF-α和IL-17可溶性受體IL-17R,然后激活I(lǐng)L-6放大器(IL-6 AMP)[42];同時(shí),新冠病毒激活NF-κB增加晚期新型冠狀病毒感染患者的循環(huán)細(xì)胞因子和趨化因子水平來(lái)傳播急性全身炎癥。細(xì)胞因子水平升高伴有肺積液、肺泡破壞、毛細(xì)血管滲漏和繼發(fā)性器官功能障礙,從而導(dǎo)致危及生命的細(xì)胞因子風(fēng)暴綜合征[43]。心血管系統(tǒng)是新冠病毒的第二大常見(jiàn)靶標(biāo),可導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥,包括急性心肌損傷、心肌炎、心律失常和靜脈血栓栓塞,以及由于直接內(nèi)皮損傷和過(guò)度全身炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致的其他主要血栓形成事件[44]。新型冠狀病毒感染患者出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴會(huì)導(dǎo)致ARDS或多器官功能障礙,包括斑塊破裂和直接心肌損傷(即心肌炎)的風(fēng)險(xiǎn)增加,從而導(dǎo)致高病死率[45]。

分子對(duì)接結(jié)果顯示,扶正感康丸中的核心活性成分與核心靶點(diǎn)有很強(qiáng)的結(jié)合活性。本研究結(jié)果表明,扶正感康丸可能通過(guò)槲皮素、漢黃芩素、山柰酚和β-谷甾醇等主要活性成分作用于IL-6、IL-1β和TNF等核心靶點(diǎn),達(dá)到治療新型冠狀病毒感染的目的。但是,扶正感康丸治療新型冠狀病毒感染的作用機(jī)制還需要通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確。