蟲草素對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷鐵死亡的影響*

羅進(jìn)輝,童運(yùn)濤,張慧,范倩倩,呂彬

1.武漢科技大學(xué)附屬漢口醫(yī)院,湖北 武漢 430012; 2.華潤武鋼總醫(yī)院,湖北 武漢 430080

腎缺血再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是臨床常見的急性損傷性疾病之一,腎移植、腎結(jié)石切除術(shù)、部分腎臟切除術(shù)等外科手術(shù)中腎臟血流量被阻斷均可引起RIRI[1],該病致死率較高,且增加了患慢性腎病和終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn),影響全球30%～80%的腎移植患者[2]。氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞因子釋放、活性氧生成和毒物積累均是導(dǎo)致RIRI發(fā)病的危險(xiǎn)因素,而這些病理生理反應(yīng)均會(huì)引起腎小管上皮細(xì)胞損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。最新的研究表明,鐵死亡等細(xì)胞程序性死亡參與RIRI的發(fā)生發(fā)展過程[4]。與常見的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬等過程不同,鐵死亡作為鐵離子依賴的細(xì)胞氧化性死亡方式,主要發(fā)生在線粒體中,影響細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化代謝功能[5]。蟲草素是從傳統(tǒng)中藥野生蛹蟲草中提取的天然活性物質(zhì),《新華本草綱要》記載:“蛹草性平,味甘,有補(bǔ)精髓,益肺腎,止咳化痰之功效?！毕x草素作為蟲草屬真菌的主要成分,現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)和腎臟保護(hù)等生物活性,在多種炎癥性疾病和氧化應(yīng)激損傷疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[6-7]。然而,目前尚不清楚蟲草素在RIRI鐵死亡中的作用和相關(guān)機(jī)制。基于此,本次研究采用蟲草素處理RIRI模型大鼠觀察其對(duì)大鼠腎臟組織損傷及鐵死亡的影響,探討其可能存在的機(jī)制,旨在為蟲草素應(yīng)用于RIRI疾病的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物24只雄性SD大鼠購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,均為6～8周齡,體質(zhì)量為180～220 g,飼養(yǎng)于空氣濕度為50%,相對(duì)溫度為23 ℃條件下,給予充足的飲用水和食物,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后。本研究經(jīng)武漢市漢口醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過,倫理編號(hào):hy11202114。

1.2 藥物與試劑蟲草素(上海懋康生物科技有限公司,貨號(hào):MS0075);鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1(美國selleck生物科技有限公司,貨號(hào):S7243);鐵離子比色法檢測試劑盒(Abcam公司,貨號(hào):ab83366);二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(dichlorodihydrofluorescein acetoacetate,DCFH-DA)培養(yǎng)液(西安百螢生物科技有限公司,貨號(hào):15204);谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、溶質(zhì)載體家族7成員11(recombinant solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、鐵蛋白重鏈(ferritin heavy chain 1,FTH1)、長鏈脂酰輔酶A合成酶4(long chain acyl CoA synthase 4,ACSL4)、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1,NOX1)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX2)一抗(山羊抗小鼠IgG抗體,美國Thermo Fisher Scientific公司,貨號(hào):MA5-32827、711589、701934、PA5-27137、PA5-27882、PA5-88606、MA5-14568)及相應(yīng)二抗(Abcam公司,山羊抗小鼠IgG抗體,美國Thermo Fisher Scientific公司,貨號(hào):MA5-32827、711589、701934、PA5-27137、PA5-27882、PA5-88606、MA5-14568);ECL顯色發(fā)光劑(福州奧研實(shí)驗(yàn)器材有限責(zé)任公司,CAS號(hào):BL523B)。

1.3 儀器顯微鏡(北京瑞科中儀科技有限公司,型號(hào):Olympus CX33);全自動(dòng)生化儀(武漢宏康世紀(jì)科技發(fā)展有限公司,型號(hào):XR220);流式細(xì)胞儀(上海三崴醫(yī)療設(shè)備有限公司,型號(hào):FACSVia);微孔板閱讀器[賽默飛世爾科技(中國)有限公司,型號(hào):Varioskan LUX]。

2 方法

2.1 RIRI大鼠分組及模型構(gòu)建將24只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、蟲草素組和鐵死亡抑制劑組,每組各6只,除對(duì)照組外,其余3組大鼠均構(gòu)建RIRI模型。造模開始前,蟲草素組大鼠腹腔注射 8 mg·kg-1蟲草素,鐵死亡抑制劑組大鼠腹腔注射5 mg·kg-1Ferrostatin-1,對(duì)照組和模型組給予等劑量生理鹽水腹腔注射,連續(xù)注射7 d[8]。7 d后采用45 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射將大鼠麻醉,待麻醉生效后,去除大鼠背部皮毛并消毒,沿背部脊椎和肋骨下緣1 cm處剪開皮膚、肌肉,暴露腎臟,分離腎動(dòng)脈,使用動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)腎動(dòng)脈,缺血處理 1 h 后松開動(dòng)脈夾,恢復(fù)血流,當(dāng)觀察到腎臟動(dòng)脈充盈,顏色由暗紅變?yōu)轷r紅時(shí),表明RIRI模型構(gòu)建成功[9]。對(duì)照組大鼠僅切開暴露腎動(dòng)脈,不使用動(dòng)脈夾夾閉。所有大鼠均在確定無臟器損傷及出血后將腸管放至原位,使用5-0細(xì)線逐層縫合關(guān)腹,體積分?jǐn)?shù)75%酒精常規(guī)消毒后保持常規(guī)飼養(yǎng)。各組大鼠均未出現(xiàn)死亡,最終納入統(tǒng)計(jì)的每組大鼠均為6只。

2.2 腎臟病理損傷觀察術(shù)后24 h,取大鼠腎組織,切成5 mm3小塊,脫水透明封片后制成石蠟切片,采用過碘酸雪夫氏染色(periodic acid-schiff stain,PAS)觀察腎臟病理損傷情況。將石蠟切片用梯度酒精脫水后以0.5%過碘酸水溶液氧化 30 min,自來水沖洗15 min后加入schiff試劑浸染15 min,沖洗15 min后蘇木精染液復(fù)染5 min,沖洗15 min后加入鹽酸酒精處理1～3 s,自來水沖洗 10 min 后梯度酒精和二甲苯溶液脫水,明膠樹脂封片,顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織病理染色情況。

2.3 腎臟指標(biāo)檢測手術(shù)24 h后,采集各組大鼠頸總動(dòng)脈血,采用全自動(dòng)生化儀檢測各組大鼠頸總動(dòng)脈血中血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血肌酐(serum creatinine,Scr)含量。

2.4 Fe2+、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和線粒體超氧化物水平檢測將各組大鼠腎組織以PBS緩沖液沖洗,加9倍量勻漿介質(zhì)研磨,4 000 r·min-1離心10 min(離心半徑10 cm),取上清液,采用鐵離子比色法測定腎組織中Fe2+含量。將組織勻漿上清液加入96孔板中,每孔加入裂解液 200 μL,搖床裂解2 h;將3 mmol·L-1標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為300 μmol·L-1、150 μmol·L-1、75 μmol·L-1、37.5 μmol·L-1、18.75 μmol·L-1、9.38 μmol·L-1、4.69 μmol·L-1,設(shè)定對(duì)照孔。將4.5%高錳酸鉀溶液與PBS按11混合配置為混合液,混合均勻后,60 ℃孵育60 min,冷卻室溫,加鐵離子檢測劑 30 μL,混勻,室溫孵育0.5 h,取200 μL加入96孔板培養(yǎng),多功能酶標(biāo)儀檢測吸光度(550 nm波長處),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得Fe2+含量。將腎組織置于預(yù)冷的50 mL離心管中,PBS沖洗3次后與ROS檢測試劑盒中25 μmol·L-1DCFH-DA培養(yǎng)液在37 ℃條件下避光培養(yǎng)30 min,30 min后PBS再次沖洗3次,常規(guī)消化后以 1 800 r·mim-1的轉(zhuǎn)速離心5 min,丟棄上清液,剩余部分于1 mL PBS緩沖液中懸浮,采用流式細(xì)胞儀檢測各組大鼠腎組織中的ROS水平,并于顯微鏡下觀察染色情況。此外,取各組大鼠腎組織,按照先前的方法分離出腎小管上皮細(xì)胞[10],使用Mitosox熒光探針檢測線粒體超氧化物水平,將細(xì)胞在Mitosox Red的hank緩沖液中培養(yǎng)30 min,PBS緩沖液清洗細(xì)胞,于波長 488 nm 和525 nm下檢測Mitosox熒光強(qiáng)度,并根據(jù)染色及未染色的細(xì)胞于吸收波長為488 nm下進(jìn)行Mitosox紅光閾值調(diào)整。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測取各組大鼠腎組織,采用 Percoll 密度梯度離心法[11]分離培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞,再采用Annexin V/7-amino-actinomycin D染色法[12]檢測細(xì)胞凋亡水平。將5×105個(gè)大鼠腎上皮細(xì)胞重懸于100 μL PBS緩沖液中,37 ℃避光條件下加入2.5 μL PE-Annexin V和2.5 μL 7-AAD,共同孵育15 min,再加入400 μL緩沖液,采用一次性管輕輕吹勻細(xì)胞后以流式細(xì)胞儀檢測各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率,設(shè)置FL1通道檢測Annexin V綠色熒光,FL3通道檢測AAD紅色熒光。

2.6 Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平采用Western Blot法檢測各組大鼠腎組織中GPX4、SLC7A11、FTH1、ACSL4、Nrf2、NOX1和COX2的蛋白表達(dá)水平,每組取3只,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用 RIPA 裂解液提取總蛋白,BCA法對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量檢測,12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至膜,室溫下采用5%脫脂奶粉封閉 2 h,4 ℃下與GPX4、SLC7A11、FTH1、ACSL4、Nrf2、NOX1、COX2一抗(稀釋比例均為11 000)避光孵育過夜,Tris磷酸鹽緩沖液清洗后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的熒光二抗(稀釋比例均為1500)37 ℃ 下孵育1 h。Tris磷酸鹽緩沖液清洗3次后,避光條件下采用ECL顯色發(fā)光劑進(jìn)行顯影,以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算各組蛋白灰度值。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠腎臟病理損傷對(duì)比PAS染色結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠腎小囊、腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)清晰,腎小管上皮細(xì)胞排列整齊,基底膜完整;模型組大鼠腎小囊囊腔、腎小管管腔擴(kuò)張明顯,腎小球萎縮,間隙增加,伴有間質(zhì)水腫等明顯損傷特征,腎小管基底膜不規(guī)則增厚;蟲草素組和鐵死亡抑制劑組相較于模型組腎小囊囊腔、腎小管管腔擴(kuò)張程度明顯減輕,腎小球體積相對(duì)正常,間隙增加和間質(zhì)水腫明顯改善,基底膜完整度更好,PAS陽性染色明顯減少。與對(duì)照組比較,模型組大鼠腎組織PAS陽性面積比例明顯升高(P<0.01);與模型組比較,蟲草素組和鐵死亡抑制劑組PAS陽性染色面積比例明顯降低(P<0.01),見圖1。

3.2 各組大鼠BUN、Scr含量對(duì)比與對(duì)照組比較,模型組BUN和Scr含量顯著升高(P<0.01),而與模型組比較,蟲草素組和鐵死亡抑制劑組BUN和Scr含量顯著降低(P<0.01),見圖2。

3.3 各組Fe2+、ROS 和線粒體超氧化物水平對(duì)比與對(duì)照組比較,模型組Fe2+、ROS和線粒體超氧化物水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,蟲草素組和鐵死亡抑制劑組Fe2+、ROS和線粒體超氧化物水平顯著降低(P<0.05),見圖3。

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖3 各組Fe2+、ROS 和線粒體超氧化物水平對(duì)比

3.4 各組細(xì)胞凋亡水平對(duì)比與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01);而與模型組比較,蟲草素組和鐵死亡抑制劑組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.01),見圖4。

注:與對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01。圖4 各組細(xì)胞凋亡水平對(duì)比

3.5 各組鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平對(duì)比與對(duì)照組比較,模型組GPX4、SLC7A11、FTH1和Keap1的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05),ACSL4、Nrf2、NOX1和COX2的蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05);而與模型組比較,蟲草素組和鐵死亡抑制劑組GPX4、SLC7A11、FTH1和 Keap1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05),ACSL4、Nrf2、NOX1和COX2的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05),見圖5。

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。圖5 各組鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平對(duì)比

4 討論

腎臟作為人體生成尿液、清除代謝產(chǎn)物、吸收有用物質(zhì)的關(guān)鍵器官之一,對(duì)于維持機(jī)體酸堿平衡、電解質(zhì)平衡和內(nèi)分泌穩(wěn)定具有重要意義,當(dāng)腎功能受損時(shí),不但影響腎臟自身功能,還會(huì)影響心臟、大腦等其他器官的穩(wěn)定。RIRI是腎移植、腎切除、大出血等外科手術(shù)中常見并發(fā)癥,也是慢性腎衰竭和終末期腎病的主要誘因之一[13]。隨著對(duì)RIRI的不斷探索,研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種生理病理在RIRI發(fā)病時(shí)被激活,參與介導(dǎo)RIRI的疾病進(jìn)展[14]。鐵死亡作為一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡過程,在多種癌癥疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病以及缺血再灌注損傷疾病中發(fā)揮重要作用[15]。研究表明,鐵死亡通過調(diào)控鐵積累、脂質(zhì)氧化及相關(guān)基因表達(dá)在RIRI的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。

本次研究通過構(gòu)建RIRI大鼠模型,探究中藥提取物蟲草素對(duì)RIRI大鼠鐵死亡的影響。RIRI模型是目前公認(rèn)的較為穩(wěn)定、適用于分析藥物作用的動(dòng)物模型之一[17],本次研究通過暴露大鼠腎動(dòng)脈,采用動(dòng)脈夾誘導(dǎo)缺血1 h后恢復(fù)供血的方式構(gòu)建RIRI模型,PAS染色觀察各組大鼠腎組織病理損傷情況,結(jié)果顯示模型組大鼠腎小囊囊腔、腎小管管腔擴(kuò)張明顯,腎小球萎縮,間隙增加,伴有間質(zhì)水腫等明顯損傷特征,且PAS陽性染色明顯增多,表明模型大鼠腎臟病理改變明顯,這也與譚微等[18]研究結(jié)論相符。Ferrostatin-1作為常用的鐵死亡抑制劑,在本次研究中作為天然活性物質(zhì)蟲草素的對(duì)照組,二者分別處理RIRI模型大鼠,結(jié)果顯示,鐵死亡抑制劑和蟲草素均可顯著改善RIRI大鼠腎臟病理損傷水平,顯著改善腎功能指標(biāo)BUN和Scr水平,對(duì)模型大鼠的腎功能有較好的保護(hù)作用。蟲草素是有著“黃金草”之稱的冬蟲夏草的主要活性成分,是第一個(gè)從真菌中分離出的核苷類抗生素,具有較好的安神和補(bǔ)腎功效[19]。蟲草素的獨(dú)特之處在于其即可補(bǔ)肺陰,又可補(bǔ)腎陽,對(duì)于調(diào)節(jié)陰陽平衡具有極高的價(jià)值?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究提示,蟲草素在保健、抗衰老、神經(jīng)保護(hù)、肺腎保護(hù)、抗腫瘤、抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)方面同樣表現(xiàn)優(yōu)異[20]。本次研究中蟲草素對(duì)RIRI大鼠腎功能的保護(hù)作用就在于其優(yōu)秀的抗炎、抗氧化生物特性,通過灌胃蟲草素減輕因缺血再灌注介導(dǎo)的氧自由基產(chǎn)生,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[21],使其免受缺血再灌注導(dǎo)致的腎臟損傷,保護(hù)腎功能[22]。

本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),蟲草素可顯著抑制模型大鼠腎臟組織內(nèi)Fe2+、ROS和線粒體超氧化物水平,抑制腎上皮細(xì)胞凋亡,上調(diào)鐵死亡相關(guān)蛋白GPX4、SLC7A11、FTH1和Keap1的表達(dá)水平,下調(diào)ACSL4、Nrf2、NOX1和COX2的表達(dá)水平,表明蟲草素通過調(diào)控鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,減少腎臟內(nèi)鐵積累,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體凋亡和鐵死亡過程,從而在腎臟保護(hù)中發(fā)揮重要作用,這也與Aydin等[23]研究結(jié)果基本一致。過氧化氫、單線態(tài)氧、超氧陰離子自由基和羥自由基是ROS的主要形式,ACSL4可催化長鏈脂肪酸和輔酶A形成脂酰輔酶A,抑制ACSL4可抑制硒蛋白GPX的表達(dá),下調(diào)SLC7A11、FTH1和Keap1等的表達(dá),特異性清除磷脂過氧化氫從而抑制鐵死亡[24]。鐵死亡作為鐵離子依賴的細(xì)胞氧化性死亡方式,下調(diào)GPX4、SLC7A11、FTH1和Keap1等的表達(dá)可使細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)氧化物無法通過這些分子進(jìn)行谷胱甘肽還原反應(yīng)[25],導(dǎo)致ROS的大量沉積,線粒體細(xì)胞膜斷裂,超氧化物水平增多,氧化還原失衡,細(xì)胞發(fā)生程序性死亡[26]。蟲草素作為冬蟲夏草和蛹蟲草等中草藥蟲草屬真菌的主要活性成分之一,具有降血脂、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化應(yīng)激、清除自由基、抑制微生物生長和調(diào)節(jié)免疫等藥理作用,在多種炎癥性疾病和惡性腫瘤疾病中發(fā)揮關(guān)鍵效應(yīng)[27-28]。最新研究發(fā)現(xiàn),蟲草素可通過改善腎缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài),抑制腎上皮細(xì)胞增殖和分化,改善腎小球?yàn)V過率[29]。在本次研究中,蟲草素可上調(diào)GPX4、SLC7A11等蛋白表達(dá)水平,下調(diào)ACSL4、Nrf2等蛋白表達(dá)水平,抑制Fe2+積累,使線粒體膜電位發(fā)生改變,影響線粒體膜通透性和電位去極化[30],抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累,加速脂質(zhì)代謝,維持氧化還原反應(yīng)平衡,抑制鐵死亡過程的發(fā)生,減少腎臟細(xì)胞凋亡水平,發(fā)揮保護(hù)模型大鼠腎功能的作用[31]。

綜上所述,蟲草素可調(diào)節(jié)鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá),抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、活性氧生成、Fe2+積累,降低鐵死亡和細(xì)胞凋亡,從而有效保護(hù)腎缺血再灌注損傷大鼠腎功能,本研究為蟲草素應(yīng)用于腎缺血再灌注損傷的治療提供了更多數(shù)據(jù)支持,值得臨床參考借鑒。