• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小鼠慢性酒精中毒性腦損傷模型的建立

    2023-12-13 04:53:24瑜王璐婉謝冬琳高大鵬
    關(guān)鍵詞:酒精中毒動(dòng)物模型腦損傷

    蔡 瑜王璐婉謝冬琳高大鵬*

    (1.浙江藥科職業(yè)大學(xué),浙江 寧波 315500;2.寧波大學(xué),浙江 寧波 315211;3.寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江 寧波 315020)

    酒是人類(lèi)社會(huì)流傳下來(lái)最古老的飲料之一。無(wú)論慶典、社交還是日常生活,酒都是必不可少之物。 但長(zhǎng)期過(guò)量飲酒會(huì)造成酒精濫用及依賴(lài),嚴(yán)重影響學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知等神經(jīng)功能,是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。 據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)表的全球酒精與健康報(bào)告指出,全球所有死亡人數(shù)的5.9%和全球疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的5.1%可歸因于過(guò)量飲酒[1]。 我國(guó)是一個(gè)酒類(lèi)生產(chǎn)和消費(fèi)的大國(guó),到2030 年中國(guó)成人的人均飲酒量將超過(guò)美國(guó),成為世界上最大的飲酒國(guó)家[1]。 酒精依賴(lài)患者由于長(zhǎng)期大量飲酒造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂、神經(jīng)損傷及神經(jīng)退行性病變,被稱(chēng)為慢性酒精中毒性腦病[2-3]。 該病臨床主要表現(xiàn)有認(rèn)知功能障礙,包括注意力不集中、記憶力下降和思維能力受損等,后期可出現(xiàn)酒精性癡呆、酒精性譫妄等[4-5]。 臨床病例研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期飲酒造成腦內(nèi)海馬和額葉區(qū)域的灰質(zhì)和白質(zhì)體積異常減少,提示這些區(qū)域有顯著的神經(jīng)元丟失[6]。 過(guò)量飲酒對(duì)個(gè)體、家庭及社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān),因此,為探究慢性酒精中毒性腦損傷的發(fā)病機(jī)制和治療藥物而構(gòu)建有效穩(wěn)定的動(dòng)物研究模型十分重要。

    目前,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的常見(jiàn)的動(dòng)物模型給酒方式包括口服、灌胃、腹腔注射和吸入。 通常,腹腔注射和灌胃方式用于急性飲酒模型,而口服和吸入方式用于慢性的酒精暴露方案[7]。 但是,以上任何一種單一的給酒方式均存在不足,無(wú)法滿(mǎn)足方便經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定可靠和盡可能模擬人類(lèi)飲酒的造模要求。因此探索多種給酒方式結(jié)合的造模方法可能是解決單一給酒方式局限性的有效途徑。 此外,已報(bào)道的慢性酒精中毒性腦損傷小鼠模型的評(píng)價(jià)尚有很多不足。 因此,探索建立多種給酒方式結(jié)合的慢性酒精中毒的動(dòng)物模型,并全面、客觀評(píng)價(jià)腦損傷動(dòng)物模型具有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠長(zhǎng)期飲用水中添加酒精結(jié)合酒精灌胃法,觀察小鼠的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)行為學(xué)改變以及檢測(cè)腦組織的形態(tài)學(xué)變化,構(gòu)建慢性小鼠酒精中毒性腦損傷模型,為后續(xù)慢性酒精中毒性腦病機(jī)制的研究和治療藥物的評(píng)價(jià)建立有效穩(wěn)定的動(dòng)物模型。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    40 只SPF 級(jí)C57BL/6J 雄性小鼠,體重(19±1.5)g,7 周齡,購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(浙)2019-0001]。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(浙)2019-0005]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(IACUC-NBU20230138),并在動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R 原則。 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,隨機(jī)分成對(duì)照組20 只和模型組20 只,開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

    1.2 主要試劑與儀器

    北京56°二鍋頭酒(北京京極酒業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):20210827);蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色試劑盒(Solarbio 北京索萊寶科技有限公司,G1120,生產(chǎn)批號(hào):20230217)和尼氏染色試劑盒(焦油紫法)(Solarbio 北京索萊寶科技有限公司,G1430,生產(chǎn)批號(hào):20220214)。 ANY-maze 行為學(xué)分析系統(tǒng)(美國(guó)stoelting 公司);徠卡RM2235 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司);光學(xué)顯微鏡(日本Nikon 公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 動(dòng)物模型的建立

    根據(jù)美國(guó)國(guó)家酒精濫用與酒精中毒研究所(National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism,NIAAA)的定義,危險(xiǎn)飲酒(risky use)是指65 歲以下的男性,每天飲用超過(guò)4 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)杯乙醇。 為了模擬人類(lèi)酗酒者的每日酒精飲用量,經(jīng)過(guò)體表面積折算,每只小鼠每天的酒精使用量需達(dá)到10 g/kg 及以上。 造模過(guò)程使用的酒精濃度和實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)基于預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,具體動(dòng)物模型建立過(guò)程如下:將56°白酒稀釋成5%(v/v)和28%(v/v)兩個(gè)濃度,模型組小鼠除基礎(chǔ)飲用水中含終濃度為5%(v/v)的酒精外,同時(shí)灌胃28%(v/v)酒精,前兩周灌胃劑量呈梯度增長(zhǎng)(從0 逐漸增加至6 g/kg 體重),隨后4 周灌胃劑量維持在6 g/kg 體重,對(duì)照組飲用水中不添加酒精同時(shí)灌胃等量生理鹽水。 繼6 周的建模過(guò)程后,所有小鼠接受認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)包括Y 迷宮、Morris 水迷宮、爬桿實(shí)驗(yàn)和平衡木實(shí)驗(yàn),每個(gè)實(shí)驗(yàn)之間間隔1 ~3 d,使得動(dòng)物獲得充分的休息。 具體慢性酒精中毒性腦損傷的建模過(guò)程和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)間表見(jiàn)圖1。

    圖1 慢性酒精中毒性腦損傷的建模過(guò)程和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)間表Figure 1 Modeling process of chronic alcoholic brain injury and timeline for behavior experiments

    1.3.2 行為學(xué)測(cè)試方法

    (1)Y 迷宮實(shí)驗(yàn)

    Y 迷宮實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行并稍有改進(jìn)。 Y 迷宮裝置由三個(gè)等長(zhǎng)水平臂組成(每個(gè)臂長(zhǎng)40 cm,寬10 cm,高20 cm),彼此成120°角,從一個(gè)中心點(diǎn)向外輻射。 簡(jiǎn)要步驟如下:小鼠被放置在三個(gè)臂的中心,在8 min 的時(shí)間里,它們可以自由地出入所有的三個(gè)臂。 記錄進(jìn)入三個(gè)臂的總次數(shù)和進(jìn)入順序。交替百分比被定義為連續(xù)進(jìn)入三個(gè)不同臂的次數(shù)/(總次數(shù)-2)。 交替百分比可以作為動(dòng)物空間工作記憶的指標(biāo),而進(jìn)入三個(gè)臂的總次數(shù)可以作為動(dòng)物自發(fā)運(yùn)動(dòng)的指標(biāo)。

    (2)Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

    Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[9-10]進(jìn)行并稍有改進(jìn)。 水迷宮宮體直徑125 cm,高75 cm。 內(nèi)壁涂黑,宮體內(nèi)充滿(mǎn)自來(lái)水,水溫保持在(23±2)℃。 逃生平臺(tái)直徑9 cm,距離圓周30 cm,置于宮體內(nèi)坐標(biāo)位置的第一象限。 簡(jiǎn)要步驟如下:整個(gè)水迷宮實(shí)驗(yàn)包括1 d 的適應(yīng)環(huán)境,1 d 的尋找可見(jiàn)平臺(tái)定位航行,5 d的尋找隱藏平臺(tái)(平臺(tái)低于水面0.7 cm)定位航行和去除平臺(tái)后1 d 的空間探索。 在定位航行過(guò)程中,將自由活動(dòng)的小鼠分別從四個(gè)象限隨機(jī)放入水中,讓其在逃生中尋找平臺(tái),若90 s 后,小鼠仍未找到平臺(tái),則引導(dǎo)小鼠找到平臺(tái)上,并在平臺(tái)上待15 s,每天訓(xùn)練3 次;在空間探索過(guò)程中,將小鼠從迷宮的固定位置放入水中,讓其自由探索60 s。 小鼠活動(dòng)通過(guò)水池上方固定的攝像頭進(jìn)行圖像采集并用ANY-mazeTM軟件進(jìn)行處理。 主要觀察指標(biāo)有:定位航行實(shí)驗(yàn)中小鼠找到平臺(tái)的平均逃避潛伏期和平均游泳速度,空間探索實(shí)驗(yàn)中小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)、在平臺(tái)象限的停留時(shí)間和搜索路徑。 動(dòng)物在最后1 d 空間探索實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)可以用來(lái)全面評(píng)估小鼠的空間記憶能力。

    (3)平衡木實(shí)驗(yàn)

    參照Drucker-Colín 等[11]報(bào)道的平衡木實(shí)驗(yàn)方法并稍有改進(jìn),簡(jiǎn)要步驟如下:取100 cm 長(zhǎng)、直徑1.8 cm 的圓木棒作為平衡木,平放于地面,兩端各一木架支撐(高60 cm)。 其中一端置一黑色塑料籠,為每次實(shí)驗(yàn)小鼠的終點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)前,訓(xùn)練小鼠從平衡木一端爬行至另一端的塑料籠里,并在籠里待15 s,每只小鼠訓(xùn)練6 次。 訓(xùn)練完畢進(jìn)行平衡木爬行時(shí)間測(cè)定,記錄每只小鼠在整根平衡木爬行的總時(shí)間,作為動(dòng)物運(yùn)動(dòng)和平衡能力的指標(biāo)。

    (4)爬桿實(shí)驗(yàn)

    參照Arai 等[12]報(bào)道的爬桿實(shí)驗(yàn)方法并稍有改進(jìn)。 簡(jiǎn)要步驟如下:將小鼠放在長(zhǎng)50 cm,直徑1.2 cm,45°固定的圓木棒上,使肌肉處于靜力緊張狀態(tài)。 先引導(dǎo)動(dòng)物在15 s 內(nèi)由桿頂爬至桿底,每只訓(xùn)練4 次,訓(xùn)練完畢進(jìn)行爬桿時(shí)間測(cè)定,記錄每只小鼠的爬桿時(shí)間,作為動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的指標(biāo)。

    1.3.3 腦組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法

    將小鼠麻醉后,開(kāi)胸,左心室插入灌注針頭,先灌注生理鹽水50 mL,再灌注4%多聚甲醛溶液50 mL,待小鼠全身僵直后,斷頭處死,冰上取全腦,4%多聚甲醛溶液固定18 h,石蠟包埋,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)漂洗,梯度乙醇脫水,石蠟包埋,切片,片厚8 μm,HE 及尼氏染色,光鏡觀察皮層及海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(xˉ±sxˉ)表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,Morris水迷宮隱藏平臺(tái)測(cè)試期采用two-way ANOVA 進(jìn)行分析。 所有統(tǒng)計(jì)分析及作圖均使用GraphPad Prism 9.5.0 軟件進(jìn)行。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組小鼠認(rèn)知功能比較

    在建立慢性酒精中毒性腦損傷模型小鼠的過(guò)程中,模型組小鼠體重增長(zhǎng)顯著低于對(duì)照組,從第2周開(kāi)始直至第6 周,模型組小鼠的體重明顯低于同齡的對(duì)照組小鼠(圖2)。 為了揭示酒精暴露小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷,每只小鼠都接受了Y 迷宮測(cè)試和Morris 水迷宮測(cè)試。 在Y 迷宮測(cè)試中,對(duì)照組和模型組小鼠進(jìn)入三臂的總次數(shù)沒(méi)有差異,這表明動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)不受長(zhǎng)期酒精暴露的影響。 在Y 迷宮測(cè)試中,模型組小鼠的自發(fā)交替率低于對(duì)照組(P<0.01),提示慢性乙醇處理可誘發(fā)小鼠短期空間工作記憶障礙(圖2)。

    注:A:小鼠體重變化;B:Y 迷宮實(shí)驗(yàn)。 與對(duì)照組相比, *P<0.05, **P<0.01。圖2 小鼠體重和Y 迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Note.A, Body weight changes of mice.B, Y maze test.Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.Figure 2 Comparison of body weights and the performance in Y maze between two groups

    在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,平臺(tái)測(cè)試中兩組的逃避潛伏期和平均游泳速度均無(wú)顯著差異(圖3)。 在隱藏平臺(tái)試驗(yàn)測(cè)試中,對(duì)于兩組小鼠在連續(xù)4 d 訓(xùn)練的逃避潛伏期數(shù)據(jù)進(jìn)行two-way ANOVA 分析(針對(duì)組別和訓(xùn)練天數(shù)這兩個(gè)因素),所得的分析結(jié)果說(shuō)明,無(wú)論是組別因素,還是訓(xùn)練天數(shù)因素,均對(duì)最終的逃避潛伏期有顯著影響(分別是P<0.05 和P<0.001),但上述兩個(gè)因素沒(méi)有交叉影響(P=0.9313)。

    注:A:可見(jiàn)平臺(tái)測(cè)試;B:隱藏平臺(tái)測(cè)試;C:空間探索測(cè)試。 與對(duì)照組相比, *P<0.05。圖3 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Note.A, Visible platform trial.B, Hidden platform trial.C, Probe trial.Compared with the control group, *P<0.05.Figure 3 Comparison of the results of water maze between two groups

    這些分析結(jié)果表明,在隱藏平臺(tái)試驗(yàn)測(cè)試中,兩組小鼠隨訓(xùn)練天數(shù)的增加,逃避潛伏期逐漸降低,結(jié)果有顯著性差異;并且相對(duì)于對(duì)照組,模型組的逃避潛伏期維持較長(zhǎng)時(shí)間,結(jié)果有顯著性差異。此外,對(duì)于隱藏平臺(tái)試驗(yàn)測(cè)試的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),兩組小鼠隱藏平臺(tái)測(cè)試第1 天逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與對(duì)照組相比,模型組在第2 ~4 天逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)。 在空間探索測(cè)試中,長(zhǎng)期暴露于酒精的小鼠與對(duì)照組小鼠相比,穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05)以及在平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比顯著降低(P<0.05)。 在搜索策略方面,模型組小鼠的路徑軌跡不太集中于平臺(tái)所在象限。 綜上,與對(duì)照組相比,長(zhǎng)期酒精暴露導(dǎo)致小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷。

    2.2 兩組小鼠運(yùn)動(dòng)功能比較

    在平衡木實(shí)驗(yàn)中,模型組小鼠通過(guò)平衡木的總時(shí)間顯著大于對(duì)照組(P<0.01),見(jiàn)圖4。 在爬桿實(shí)驗(yàn)中,模型組小鼠的爬桿時(shí)間與對(duì)照組相比顯著延長(zhǎng)(P<0.05),見(jiàn)圖4。 綜上,與對(duì)照組相比,慢性酒精暴露導(dǎo)致小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力明顯降低。

    注:A:平衡木實(shí)驗(yàn);B:爬桿實(shí)驗(yàn)。 與對(duì)照組相比, *P <0.05, **P<0.01。圖4 平衡木和爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Note.A, beam balance experiment.B, pole test.Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.Figure 4 Comparison of the results of beam balance experiment and pole test between two groups

    2.3 兩組小鼠腦組織形態(tài)學(xué)比較

    HE 染色顯示對(duì)照組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列清晰,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、輪廓清晰,而模型組小鼠神經(jīng)元表型明顯收縮變形(圖5A),并且,在長(zhǎng)期乙醇暴露后,小鼠海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。 尼氏染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了兩組神經(jīng)元的這些病理改變(圖5B)。 即對(duì)照組海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)輪廓清晰,而模型組小鼠神經(jīng)元萎縮,形態(tài)破壞。 并且,經(jīng)長(zhǎng)期乙醇暴露后,小鼠海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。 兩組小鼠腦組織病理染色結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,長(zhǎng)期乙醇暴露導(dǎo)致小鼠海馬區(qū)形態(tài)損傷和細(xì)胞壞死。

    注:A:海馬組織HE 染色;B:海馬組織尼氏染色。圖5 海馬組織HE 和尼氏染色結(jié)果比較Note.A, HE staining of hippocampus.B, Nissl staining of hippocampus.Figure 5 Comparison of the results of HE staining and Nissl staining of hippocampus

    3 討論

    酒精使用障礙是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見(jiàn)的神經(jīng)和精神疾病之一,影響全球數(shù)百萬(wàn)人[13]。 隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,慢性酒精中毒性腦病的發(fā)病率逐年上升,但目前尚未得到足夠的重視。 為了進(jìn)一步對(duì)長(zhǎng)期過(guò)量酗酒所致的腦損傷的病理變化和發(fā)病機(jī)制有更好的研究,探索建立合適的動(dòng)物模型至關(guān)重要。

    國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的慢性酒精中毒性肝損傷模型和慢性飲酒成癮/戒斷模型及評(píng)價(jià)已較成熟,而慢性酒精誘導(dǎo)的腦損傷動(dòng)物模型及評(píng)價(jià)尚未完善。對(duì)于建立慢性酒精中毒性腦損傷動(dòng)物模型,有一些重要的造模因素需考慮并優(yōu)化,包括選取的動(dòng)物種類(lèi)品系、給予動(dòng)物酒精的方式、給予酒精的濃度、動(dòng)物酒精暴露的時(shí)間和劑量等。 本研究均通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)上述各因素進(jìn)行確定并優(yōu)化,以期得到一種盡可能模擬人類(lèi)慢性飲酒過(guò)程、穩(wěn)定可靠且造模時(shí)間短的腦損傷模型,這也是本研究對(duì)于目前已有造模方法的改進(jìn)創(chuàng)新之處。 具體模型建立過(guò)程中,首先,本實(shí)驗(yàn)選取了C57BL/6J 品系的小鼠作為建立模型的對(duì)象,這向該品系小鼠有較高的自愿飲酒量以及對(duì)酒精的生理反應(yīng)與人類(lèi)非常相似等特征有關(guān)[14]。 盡管?chē)?guó)內(nèi)外文獻(xiàn)也選用過(guò)BALB/c、ICR 及昆明小鼠作為造模對(duì)象[15-17],但總體而言,C57BL/6J 小鼠是目前研究酒精誘導(dǎo)的器官損傷最常用的動(dòng)物之一。 此外,建立模型過(guò)程中,如何給予動(dòng)物酒精的方式也是需要考慮并優(yōu)化的。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道常見(jiàn)的給酒方式包括口服(含酒精的流質(zhì)飲食或飲用水)、灌胃、腹腔注射和吸入(暴露于酒精蒸氣)。 通常,急性飲酒模型采用的是腹腔注射和灌胃方式,而慢性的動(dòng)物酒精暴露方案采用口服和吸入方式[7]。 含酒精的流質(zhì)飲食最早是由Lieber 和DeCarli 開(kāi)發(fā)的,在造模過(guò)程中,該飲食作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物唯一的食物和水來(lái)源[18-19]。 Lieber-DeCarli 模型雖然造模簡(jiǎn)便但未模仿人類(lèi)飲酒。 并且,還存在造模耗時(shí)長(zhǎng)、飲食種類(lèi)受限、營(yíng)養(yǎng)情況與正常飲食時(shí)不同等不足。 Tsukamoto-French 模型是通過(guò)動(dòng)物胃內(nèi)植入導(dǎo)管的方式給予酒精[20],造模過(guò)程需要特殊的設(shè)備技術(shù)和持續(xù)的動(dòng)物監(jiān)測(cè)、成本高,不便于廣泛應(yīng)用。 飲用水中添加酒精的模型是長(zhǎng)期乙醇暴露的更實(shí)用的解決方案,該模型已用于多種物種,包括小鼠、大鼠和豚鼠[21-22]。 該模型優(yōu)點(diǎn)是模擬人類(lèi)飲酒的生理過(guò)程、建模方便便宜,可長(zhǎng)期給酒(8 個(gè)月以上),但存在造模時(shí)間長(zhǎng),并且可能無(wú)法模擬人類(lèi)酒精疾病的晚期階段等不足[23]。de Witte 等[24]開(kāi)發(fā)了一種稱(chēng)為“肺酒精化”的酒精吸入模型,可以長(zhǎng)期達(dá)到較高的(200 mg/dL)血液酒精水平,適合酒精成癮方面的研究,但吸入酒精畢竟不同于飲用酒精,不能完全模擬真實(shí)情況。 綜合考量上述給酒方式的優(yōu)缺點(diǎn),此次模型采用飲水中添加酒精+灌胃法,避免單一給酒方式的局限性,使動(dòng)物模型盡可能模擬人類(lèi)慢性飲酒過(guò)程并縮短造模時(shí)間。 更值得一提的是,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),小鼠灌胃時(shí)能耐受的酒精濃度需低于30%(v/v),因此56°的白酒原液需稀釋1 倍后使用并1 d 中分兩次灌胃。 陳翠桃等[16]采用白酒原液灌胃前30 min給予小鼠灌胃蒸餾水的方法,這些都是為了減少高度酒精灌胃引起的小鼠中毒癥狀甚至死亡。 并且,造模前兩周采用酒精劑量梯度提升,提高小鼠耐受性和存活率。 最后,動(dòng)物暴露酒精的時(shí)間長(zhǎng)短也是建立模型時(shí)需要考慮的問(wèn)題。 通常研究人員會(huì)將1個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間地給予酒精視為慢性酒精暴露[23]。酒精引起的慢性疾病,如慢性酒精中毒性腦病,是一個(gè)多步驟的疾病過(guò)程,研究者感興趣的多步驟多進(jìn)程的哪個(gè)階段將決定酒精的給藥持續(xù)時(shí)間[23]。 本研究對(duì)慢性酒精中毒性腦病的早期癥狀尤其是認(rèn)知功能障礙和運(yùn)動(dòng)功能障礙最為關(guān)注,結(jié)合前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最終將小鼠慢性酒精暴露的時(shí)間優(yōu)化為6 周,相比目前報(bào)道的造模方法,既縮短了造模時(shí)間,又可以獲得穩(wěn)定的慢性酒精中毒性腦損傷模型。

    采用動(dòng)物模型效度對(duì)本研究所建立的小鼠動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。 動(dòng)物模型效度是動(dòng)物模型的綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),即評(píng)價(jià)所建立的動(dòng)物模型在多大程度上模擬了臨床該種疾病。 動(dòng)物模型效度主要由表面效度、結(jié)構(gòu)效度和預(yù)測(cè)效度組成,其中表面效度指動(dòng)物模型與臨床疾病癥狀和體征的相似性,結(jié)構(gòu)效度指動(dòng)物造模過(guò)程與臨床疾病的致病過(guò)程和病理機(jī)制的相似性,預(yù)測(cè)效度指動(dòng)物模型與臨床患者對(duì)治療藥物反應(yīng)的相似性。 首先,從表面效度看,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,模型組體重增長(zhǎng)幅度顯著降低,日常活動(dòng)易被噪聲驚嚇、動(dòng)作刻板;在認(rèn)知行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中,模型組在Y 迷宮測(cè)試中的自發(fā)交替率顯著降低,在水迷宮空間探索階段的穿越平臺(tái)次數(shù)和在平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比顯著降低;在運(yùn)動(dòng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中,長(zhǎng)期酒精暴露會(huì)導(dǎo)致小鼠通過(guò)平衡木的總時(shí)間和爬桿時(shí)間顯著延長(zhǎng);并且,模型組小鼠腦組織HE 染色和尼氏染色均顯示出海馬區(qū)形態(tài)損傷和細(xì)胞壞死。 這些與臨床上觀察到的患者在病理及病理生理方面的變化極為相似。 例如,慢性酒精中毒性腦病的患者早期常有焦慮不安、頭痛、失眠、乏力、注意力不集中等,逐漸出現(xiàn)智能障礙和精神異常,表現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、注意力不集中、記憶力下降,常伴有虛構(gòu)、思維能力受損,有的出現(xiàn)眼肌麻痹、共濟(jì)失調(diào)和影像學(xué)改變等。 與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)已報(bào)道的慢性酒精中毒性腦損傷模型評(píng)價(jià)相比,本研究對(duì)模型小鼠的認(rèn)識(shí)功能、運(yùn)動(dòng)功能以及海馬區(qū)病理?yè)p傷都采用兩種經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果相互佐證。 其次,從結(jié)構(gòu)效度看,慢性飲酒是酒精中毒性腦病的重要誘因,據(jù)此,建立小鼠長(zhǎng)時(shí)間酒精暴露可以認(rèn)為是一種具有良好效度的疾病模型。最后,從預(yù)測(cè)維度看,目前臨床尚無(wú)藥物治療該疾病,因此無(wú)從驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)效度。 綜上所述,本實(shí)驗(yàn)所建立的小鼠慢性酒精中毒性腦損傷模型在動(dòng)物模型的表面和結(jié)構(gòu)效度上是非常有優(yōu)勢(shì)的,基本模擬了人類(lèi)長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致的早期神經(jīng)病理和行為學(xué)改變。 此外,本實(shí)驗(yàn)造模方法簡(jiǎn)單方便、飼養(yǎng)成本較低、動(dòng)物存活率高、時(shí)間短,在6 周內(nèi)可初步建立小鼠慢性酒精中毒性腦損傷模型。 本研究的局限性在于,僅從動(dòng)物行為學(xué)和腦組織形態(tài)學(xué)兩方面評(píng)價(jià)了慢性酒精對(duì)小鼠腦組織所造成的損傷。在接下來(lái)的研究工作中,我們將進(jìn)一步探討慢性酒精所致的認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制以及潛在藥物的治療作用。

    猜你喜歡
    酒精中毒動(dòng)物模型腦損傷
    肥胖中醫(yī)證候動(dòng)物模型研究進(jìn)展
    MRI,CT檢查診斷酒依賴(lài)致慢性酒精中毒性腦病的效果對(duì)比
    急性酒精中毒的內(nèi)科急診治療分析
    胃癌前病變動(dòng)物模型復(fù)制實(shí)驗(yàn)進(jìn)展
    潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型研究進(jìn)展
    腦損傷 與其逃避不如面對(duì)
    幸福(2019年21期)2019-08-20 05:39:10
    急性酒精中毒患者發(fā)生急性并發(fā)癥特點(diǎn)分析
    糖尿病性視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型研究進(jìn)展
    院前急救中急性酒精中毒患者的救治體會(huì)
    認(rèn)知行為療法治療創(chuàng)傷性腦損傷后抑郁
    天堂动漫精品| 成年人午夜在线观看视频| 色综合婷婷激情| 久久香蕉精品热| 男女午夜视频在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 女警被强在线播放| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一本综合久久免费| 亚洲美女黄片视频| 国产男女超爽视频在线观看| 操美女的视频在线观看| 美女福利国产在线| 亚洲精品中文字幕在线视频| 深夜精品福利| 一区在线观看完整版| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 9色porny在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 99re6热这里在线精品视频| 久久精品91无色码中文字幕| 搡老乐熟女国产| 9191精品国产免费久久| 757午夜福利合集在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 老司机福利观看| 国产高清videossex| 午夜91福利影院| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲伊人色综图| av视频免费观看在线观看| 岛国毛片在线播放| 亚洲精华国产精华精| 夜夜爽天天搞| 日本wwww免费看| 高清在线国产一区| 久久精品国产综合久久久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲全国av大片| 另类亚洲欧美激情| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美成人免费av一区二区三区 | 又黄又粗又硬又大视频| 香蕉久久夜色| 亚洲 国产 在线| 国产不卡av网站在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 夜夜爽天天搞| 国产极品粉嫩免费观看在线| av天堂久久9| 成人精品一区二区免费| 曰老女人黄片| 亚洲色图综合在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 精品国内亚洲2022精品成人 | 丰满迷人的少妇在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产区一区二久久| 一区在线观看完整版| 夜夜爽天天搞| 久久午夜亚洲精品久久| 成年人黄色毛片网站| 久久这里只有精品19| a级毛片在线看网站| 老司机影院毛片| 一级a爱片免费观看的视频| 久久久久久人人人人人| 亚洲全国av大片| 久久亚洲精品不卡| 国产午夜精品久久久久久| 久久中文看片网| 亚洲欧美一区二区三区久久| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲在线自拍视频| 亚洲免费av在线视频| 极品人妻少妇av视频| bbb黄色大片| 久久精品成人免费网站| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产免费av片在线观看野外av| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 老司机靠b影院| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 91字幕亚洲| 99精品欧美一区二区三区四区| 欧美精品一区二区免费开放| 国精品久久久久久国模美| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产精品国产高清国产av | 亚洲 欧美一区二区三区| ponron亚洲| videosex国产| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲熟女毛片儿| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 操出白浆在线播放| 不卡av一区二区三区| 国产精品久久久av美女十八| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲成国产人片在线观看| netflix在线观看网站| 91字幕亚洲| 91av网站免费观看| 制服人妻中文乱码| 欧美日韩亚洲高清精品| 免费观看人在逋| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 午夜免费观看网址| 人人妻人人澡人人看| 亚洲国产欧美网| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲av片天天在线观看| av欧美777| 久久久久国内视频| 一级毛片高清免费大全| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产精品亚洲一级av第二区| 久久久国产精品麻豆| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 日韩有码中文字幕| 成人精品一区二区免费| 在线永久观看黄色视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美乱色亚洲激情| 午夜福利,免费看| 男人操女人黄网站| 看黄色毛片网站| av天堂在线播放| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久人妻av系列| 老汉色∧v一级毛片| 成在线人永久免费视频| 国产片内射在线| 亚洲精品中文字幕在线视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 成人国产一区最新在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产人伦9x9x在线观看| 男女午夜视频在线观看| 国产色视频综合| 成人精品一区二区免费| 丰满的人妻完整版| 久久这里只有精品19| 精品卡一卡二卡四卡免费| 99久久人妻综合| 人妻一区二区av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久午夜综合久久蜜桃| netflix在线观看网站| 老熟女久久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 咕卡用的链子| 国产亚洲精品一区二区www | www日本在线高清视频| 久久国产精品影院| 亚洲精品一二三| 欧美日韩视频精品一区| 国产在线精品亚洲第一网站| 免费日韩欧美在线观看| 一区二区三区激情视频| 国产一区在线观看成人免费| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久久国产成人精品二区 | 日日夜夜操网爽| 欧美性长视频在线观看| 好男人电影高清在线观看| 91精品三级在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 国产成人精品久久二区二区91| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜福利免费观看在线| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产麻豆69| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久久久久久国产电影| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲国产中文字幕在线视频| 在线观看www视频免费| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 9色porny在线观看| 午夜91福利影院| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜福利一区二区在线看| 国产精品久久视频播放| 久久精品亚洲av国产电影网| 中文字幕av电影在线播放| a级毛片黄视频| 丰满的人妻完整版| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产97色在线日韩免费| 精品第一国产精品| netflix在线观看网站| 国产精品1区2区在线观看. | 久久久精品免费免费高清| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品久久久久久精品古装| 99re在线观看精品视频| а√天堂www在线а√下载 | 搡老岳熟女国产| 大型av网站在线播放| 欧美成人免费av一区二区三区 | 国产精品.久久久| 最新在线观看一区二区三区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | av在线播放免费不卡| 亚洲男人天堂网一区| 久久中文字幕人妻熟女| 99riav亚洲国产免费| 国产人伦9x9x在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 精品人妻在线不人妻| 青草久久国产| 亚洲情色 制服丝袜| 午夜两性在线视频| 亚洲av成人av| 黄色片一级片一级黄色片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲avbb在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产又爽黄色视频| 黄频高清免费视频| 亚洲免费av在线视频| 精品国产国语对白av| 身体一侧抽搐| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产一区二区三区视频了| 中出人妻视频一区二区| 老司机亚洲免费影院| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲av日韩在线播放| 成人18禁在线播放| 国产精品98久久久久久宅男小说| 热99久久久久精品小说推荐| 狠狠狠狠99中文字幕| e午夜精品久久久久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 一级a爱片免费观看的视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 人人澡人人妻人| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 午夜两性在线视频| 久热这里只有精品99| 成年人免费黄色播放视频| 欧美在线一区亚洲| 欧美日韩成人在线一区二区| 怎么达到女性高潮| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 精品亚洲成国产av| 他把我摸到了高潮在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 美女 人体艺术 gogo| 国产高清videossex| netflix在线观看网站| 精品电影一区二区在线| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲人成伊人成综合网2020| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲成人免费av在线播放| 久久亚洲精品不卡| 精品乱码久久久久久99久播| 男女免费视频国产| 日本wwww免费看| 国精品久久久久久国模美| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲精品在线观看二区| 日韩三级视频一区二区三区| 无人区码免费观看不卡| 真人做人爱边吃奶动态| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日韩免费高清中文字幕av| 一a级毛片在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产深夜福利视频在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美日韩成人在线一区二区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| a级毛片黄视频| 涩涩av久久男人的天堂| 天堂中文最新版在线下载| 国产亚洲欧美98| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久热这里只有精品99| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 黄片大片在线免费观看| 欧美久久黑人一区二区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 免费在线观看亚洲国产| 美女国产高潮福利片在线看| 国产高清激情床上av| 又大又爽又粗| 国产高清videossex| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产一卡二卡三卡精品| 国产成人影院久久av| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲伊人色综图| 免费看十八禁软件| 99国产精品一区二区蜜桃av | 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲第一青青草原| 日韩欧美在线二视频 | 国产高清激情床上av| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 中文字幕色久视频| 高清欧美精品videossex| av中文乱码字幕在线| 成在线人永久免费视频| 日本vs欧美在线观看视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品福利永久在线观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产精品永久免费网站| 水蜜桃什么品种好| 啦啦啦免费观看视频1| 在线看a的网站| 成年女人毛片免费观看观看9 | 99国产极品粉嫩在线观看| 丰满的人妻完整版| 亚洲五月天丁香| 黄片播放在线免费| 欧美性长视频在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| 69精品国产乱码久久久| 欧美最黄视频在线播放免费 | 欧美最黄视频在线播放免费 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久午夜亚洲精品久久| 免费在线观看日本一区| 国产在线观看jvid| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲精品在线美女| 欧美日韩乱码在线| 久久久久久久久免费视频了| 在线观看一区二区三区激情| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 激情在线观看视频在线高清 | 亚洲av成人一区二区三| 精品国产美女av久久久久小说| 精品久久久久久电影网| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 色婷婷av一区二区三区视频| 美女视频免费永久观看网站| 69av精品久久久久久| 伦理电影免费视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 中文字幕制服av| 国产一卡二卡三卡精品| 久久午夜亚洲精品久久| 国产成人精品久久二区二区免费| 99re在线观看精品视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲欧美激情在线| 1024香蕉在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 丝袜美足系列| 亚洲第一青青草原| 在线观看午夜福利视频| 久久热在线av| 午夜精品国产一区二区电影| 国产成人精品在线电影| 欧美色视频一区免费| 黄片播放在线免费| 纯流量卡能插随身wifi吗| 少妇被粗大的猛进出69影院| 90打野战视频偷拍视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲一区中文字幕在线| 精品国产国语对白av| 免费黄频网站在线观看国产| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 免费高清在线观看日韩| 亚洲综合色网址| 欧美日韩亚洲高清精品| av超薄肉色丝袜交足视频| 精品欧美一区二区三区在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 丰满饥渴人妻一区二区三| 亚洲中文av在线| e午夜精品久久久久久久| 麻豆乱淫一区二区| cao死你这个sao货| 久久精品国产综合久久久| 一二三四社区在线视频社区8| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲精品国产色婷婷电影| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 天天添夜夜摸| 国产精品 欧美亚洲| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品 国内视频| 精品国内亚洲2022精品成人 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 国产精品久久久av美女十八| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产精品1区2区在线观看. | 亚洲精品中文字幕一二三四区| 一夜夜www| 久久国产精品影院| 日韩欧美免费精品| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产主播在线观看一区二区| 两人在一起打扑克的视频| 久久香蕉精品热| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲欧美一区二区三区久久| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲国产欧美一区二区综合| 成人永久免费在线观看视频| 久久香蕉国产精品| xxx96com| av在线播放免费不卡| 亚洲熟女精品中文字幕| 9热在线视频观看99| 99国产综合亚洲精品| 国产精品电影一区二区三区 | 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 我的亚洲天堂| 成年动漫av网址| 国产激情久久老熟女| 99re在线观看精品视频| 老司机福利观看| 一级a爱片免费观看的视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 999久久久精品免费观看国产| 18在线观看网站| 国产乱人伦免费视频| 91成年电影在线观看| 丁香六月欧美| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久久久精品国产欧美久久久| 搡老岳熟女国产| 国产精品免费一区二区三区在线 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 捣出白浆h1v1| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产不卡一卡二| www.精华液| 人妻 亚洲 视频| 欧美黄色淫秽网站| 老熟女久久久| 精品熟女少妇八av免费久了| 在线观看66精品国产| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品国产国语对白av| videosex国产| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 91麻豆av在线| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品 国内视频| av电影中文网址| 捣出白浆h1v1| 国产人伦9x9x在线观看| 国产野战对白在线观看| 国产成人影院久久av| 国产精品99久久99久久久不卡| 99国产精品一区二区蜜桃av | 叶爱在线成人免费视频播放| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久久国产成人精品二区 | 欧美激情 高清一区二区三区| 久久热在线av| 欧美在线黄色| 国产精品欧美亚洲77777| 国产免费av片在线观看野外av| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 99久久国产精品久久久| 日韩免费av在线播放| 一级作爱视频免费观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 成年动漫av网址| 色婷婷av一区二区三区视频| 午夜精品国产一区二区电影| 这个男人来自地球电影免费观看| 一本大道久久a久久精品| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 欧美激情高清一区二区三区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产日韩欧美亚洲二区| a在线观看视频网站| av不卡在线播放| 美女高潮到喷水免费观看| 伦理电影免费视频| 搡老岳熟女国产| 99热国产这里只有精品6| 一级毛片精品| 国产真人三级小视频在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 麻豆成人av在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 最新在线观看一区二区三区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产免费现黄频在线看| 国产成人av教育| 亚洲精品在线美女| 久久精品91无色码中文字幕| 午夜福利影视在线免费观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 精品人妻在线不人妻| 国产成人啪精品午夜网站| 国产主播在线观看一区二区| 久久久久视频综合| 国产深夜福利视频在线观看| 一区在线观看完整版| 亚洲成人免费电影在线观看| 在线看a的网站| 91在线观看av| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 黄色片一级片一级黄色片| 身体一侧抽搐| 中国美女看黄片| 757午夜福利合集在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品二区激情视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 在线观看免费高清a一片| 在线永久观看黄色视频| 国产男女内射视频| 精品亚洲成国产av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 12—13女人毛片做爰片一| 男人操女人黄网站| 亚洲专区国产一区二区| 男女下面插进去视频免费观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 大陆偷拍与自拍| 美女福利国产在线| 女性生殖器流出的白浆| 精品高清国产在线一区| 亚洲精品美女久久av网站| 怎么达到女性高潮| 天堂动漫精品| 午夜免费鲁丝| 91精品三级在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 91精品三级在线观看| 午夜免费鲁丝| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久久国产一区二区| 午夜福利欧美成人| 校园春色视频在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲成a人片在线一区二区| 午夜免费成人在线视频| 免费在线观看亚洲国产| 国产在线一区二区三区精| 久久香蕉激情| 午夜免费成人在线视频| 很黄的视频免费| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲一区高清亚洲精品| 波多野结衣av一区二区av| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 韩国精品一区二区三区| 99热网站在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 婷婷丁香在线五月| 国产淫语在线视频| 国产精品 欧美亚洲| 一进一出好大好爽视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 悠悠久久av| 黄色片一级片一级黄色片| 乱人伦中国视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲美女黄片视频| 热99re8久久精品国产|