• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小鼠慢性酒精中毒性腦損傷模型的建立

    2023-12-13 04:53:24瑜王璐婉謝冬琳高大鵬
    關(guān)鍵詞:酒精中毒動(dòng)物模型腦損傷

    蔡 瑜王璐婉謝冬琳高大鵬*

    (1.浙江藥科職業(yè)大學(xué),浙江 寧波 315500;2.寧波大學(xué),浙江 寧波 315211;3.寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江 寧波 315020)

    酒是人類(lèi)社會(huì)流傳下來(lái)最古老的飲料之一。無(wú)論慶典、社交還是日常生活,酒都是必不可少之物。 但長(zhǎng)期過(guò)量飲酒會(huì)造成酒精濫用及依賴(lài),嚴(yán)重影響學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知等神經(jīng)功能,是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。 據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)表的全球酒精與健康報(bào)告指出,全球所有死亡人數(shù)的5.9%和全球疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的5.1%可歸因于過(guò)量飲酒[1]。 我國(guó)是一個(gè)酒類(lèi)生產(chǎn)和消費(fèi)的大國(guó),到2030 年中國(guó)成人的人均飲酒量將超過(guò)美國(guó),成為世界上最大的飲酒國(guó)家[1]。 酒精依賴(lài)患者由于長(zhǎng)期大量飲酒造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂、神經(jīng)損傷及神經(jīng)退行性病變,被稱(chēng)為慢性酒精中毒性腦病[2-3]。 該病臨床主要表現(xiàn)有認(rèn)知功能障礙,包括注意力不集中、記憶力下降和思維能力受損等,后期可出現(xiàn)酒精性癡呆、酒精性譫妄等[4-5]。 臨床病例研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期飲酒造成腦內(nèi)海馬和額葉區(qū)域的灰質(zhì)和白質(zhì)體積異常減少,提示這些區(qū)域有顯著的神經(jīng)元丟失[6]。 過(guò)量飲酒對(duì)個(gè)體、家庭及社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān),因此,為探究慢性酒精中毒性腦損傷的發(fā)病機(jī)制和治療藥物而構(gòu)建有效穩(wěn)定的動(dòng)物研究模型十分重要。

    目前,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的常見(jiàn)的動(dòng)物模型給酒方式包括口服、灌胃、腹腔注射和吸入。 通常,腹腔注射和灌胃方式用于急性飲酒模型,而口服和吸入方式用于慢性的酒精暴露方案[7]。 但是,以上任何一種單一的給酒方式均存在不足,無(wú)法滿(mǎn)足方便經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定可靠和盡可能模擬人類(lèi)飲酒的造模要求。因此探索多種給酒方式結(jié)合的造模方法可能是解決單一給酒方式局限性的有效途徑。 此外,已報(bào)道的慢性酒精中毒性腦損傷小鼠模型的評(píng)價(jià)尚有很多不足。 因此,探索建立多種給酒方式結(jié)合的慢性酒精中毒的動(dòng)物模型,并全面、客觀評(píng)價(jià)腦損傷動(dòng)物模型具有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠長(zhǎng)期飲用水中添加酒精結(jié)合酒精灌胃法,觀察小鼠的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)行為學(xué)改變以及檢測(cè)腦組織的形態(tài)學(xué)變化,構(gòu)建慢性小鼠酒精中毒性腦損傷模型,為后續(xù)慢性酒精中毒性腦病機(jī)制的研究和治療藥物的評(píng)價(jià)建立有效穩(wěn)定的動(dòng)物模型。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    40 只SPF 級(jí)C57BL/6J 雄性小鼠,體重(19±1.5)g,7 周齡,購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(浙)2019-0001]。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(浙)2019-0005]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(IACUC-NBU20230138),并在動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R 原則。 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,隨機(jī)分成對(duì)照組20 只和模型組20 只,開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

    1.2 主要試劑與儀器

    北京56°二鍋頭酒(北京京極酒業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):20210827);蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色試劑盒(Solarbio 北京索萊寶科技有限公司,G1120,生產(chǎn)批號(hào):20230217)和尼氏染色試劑盒(焦油紫法)(Solarbio 北京索萊寶科技有限公司,G1430,生產(chǎn)批號(hào):20220214)。 ANY-maze 行為學(xué)分析系統(tǒng)(美國(guó)stoelting 公司);徠卡RM2235 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司);光學(xué)顯微鏡(日本Nikon 公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 動(dòng)物模型的建立

    根據(jù)美國(guó)國(guó)家酒精濫用與酒精中毒研究所(National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism,NIAAA)的定義,危險(xiǎn)飲酒(risky use)是指65 歲以下的男性,每天飲用超過(guò)4 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)杯乙醇。 為了模擬人類(lèi)酗酒者的每日酒精飲用量,經(jīng)過(guò)體表面積折算,每只小鼠每天的酒精使用量需達(dá)到10 g/kg 及以上。 造模過(guò)程使用的酒精濃度和實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)基于預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,具體動(dòng)物模型建立過(guò)程如下:將56°白酒稀釋成5%(v/v)和28%(v/v)兩個(gè)濃度,模型組小鼠除基礎(chǔ)飲用水中含終濃度為5%(v/v)的酒精外,同時(shí)灌胃28%(v/v)酒精,前兩周灌胃劑量呈梯度增長(zhǎng)(從0 逐漸增加至6 g/kg 體重),隨后4 周灌胃劑量維持在6 g/kg 體重,對(duì)照組飲用水中不添加酒精同時(shí)灌胃等量生理鹽水。 繼6 周的建模過(guò)程后,所有小鼠接受認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)包括Y 迷宮、Morris 水迷宮、爬桿實(shí)驗(yàn)和平衡木實(shí)驗(yàn),每個(gè)實(shí)驗(yàn)之間間隔1 ~3 d,使得動(dòng)物獲得充分的休息。 具體慢性酒精中毒性腦損傷的建模過(guò)程和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)間表見(jiàn)圖1。

    圖1 慢性酒精中毒性腦損傷的建模過(guò)程和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)間表Figure 1 Modeling process of chronic alcoholic brain injury and timeline for behavior experiments

    1.3.2 行為學(xué)測(cè)試方法

    (1)Y 迷宮實(shí)驗(yàn)

    Y 迷宮實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行并稍有改進(jìn)。 Y 迷宮裝置由三個(gè)等長(zhǎng)水平臂組成(每個(gè)臂長(zhǎng)40 cm,寬10 cm,高20 cm),彼此成120°角,從一個(gè)中心點(diǎn)向外輻射。 簡(jiǎn)要步驟如下:小鼠被放置在三個(gè)臂的中心,在8 min 的時(shí)間里,它們可以自由地出入所有的三個(gè)臂。 記錄進(jìn)入三個(gè)臂的總次數(shù)和進(jìn)入順序。交替百分比被定義為連續(xù)進(jìn)入三個(gè)不同臂的次數(shù)/(總次數(shù)-2)。 交替百分比可以作為動(dòng)物空間工作記憶的指標(biāo),而進(jìn)入三個(gè)臂的總次數(shù)可以作為動(dòng)物自發(fā)運(yùn)動(dòng)的指標(biāo)。

    (2)Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

    Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[9-10]進(jìn)行并稍有改進(jìn)。 水迷宮宮體直徑125 cm,高75 cm。 內(nèi)壁涂黑,宮體內(nèi)充滿(mǎn)自來(lái)水,水溫保持在(23±2)℃。 逃生平臺(tái)直徑9 cm,距離圓周30 cm,置于宮體內(nèi)坐標(biāo)位置的第一象限。 簡(jiǎn)要步驟如下:整個(gè)水迷宮實(shí)驗(yàn)包括1 d 的適應(yīng)環(huán)境,1 d 的尋找可見(jiàn)平臺(tái)定位航行,5 d的尋找隱藏平臺(tái)(平臺(tái)低于水面0.7 cm)定位航行和去除平臺(tái)后1 d 的空間探索。 在定位航行過(guò)程中,將自由活動(dòng)的小鼠分別從四個(gè)象限隨機(jī)放入水中,讓其在逃生中尋找平臺(tái),若90 s 后,小鼠仍未找到平臺(tái),則引導(dǎo)小鼠找到平臺(tái)上,并在平臺(tái)上待15 s,每天訓(xùn)練3 次;在空間探索過(guò)程中,將小鼠從迷宮的固定位置放入水中,讓其自由探索60 s。 小鼠活動(dòng)通過(guò)水池上方固定的攝像頭進(jìn)行圖像采集并用ANY-mazeTM軟件進(jìn)行處理。 主要觀察指標(biāo)有:定位航行實(shí)驗(yàn)中小鼠找到平臺(tái)的平均逃避潛伏期和平均游泳速度,空間探索實(shí)驗(yàn)中小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)、在平臺(tái)象限的停留時(shí)間和搜索路徑。 動(dòng)物在最后1 d 空間探索實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)可以用來(lái)全面評(píng)估小鼠的空間記憶能力。

    (3)平衡木實(shí)驗(yàn)

    參照Drucker-Colín 等[11]報(bào)道的平衡木實(shí)驗(yàn)方法并稍有改進(jìn),簡(jiǎn)要步驟如下:取100 cm 長(zhǎng)、直徑1.8 cm 的圓木棒作為平衡木,平放于地面,兩端各一木架支撐(高60 cm)。 其中一端置一黑色塑料籠,為每次實(shí)驗(yàn)小鼠的終點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)前,訓(xùn)練小鼠從平衡木一端爬行至另一端的塑料籠里,并在籠里待15 s,每只小鼠訓(xùn)練6 次。 訓(xùn)練完畢進(jìn)行平衡木爬行時(shí)間測(cè)定,記錄每只小鼠在整根平衡木爬行的總時(shí)間,作為動(dòng)物運(yùn)動(dòng)和平衡能力的指標(biāo)。

    (4)爬桿實(shí)驗(yàn)

    參照Arai 等[12]報(bào)道的爬桿實(shí)驗(yàn)方法并稍有改進(jìn)。 簡(jiǎn)要步驟如下:將小鼠放在長(zhǎng)50 cm,直徑1.2 cm,45°固定的圓木棒上,使肌肉處于靜力緊張狀態(tài)。 先引導(dǎo)動(dòng)物在15 s 內(nèi)由桿頂爬至桿底,每只訓(xùn)練4 次,訓(xùn)練完畢進(jìn)行爬桿時(shí)間測(cè)定,記錄每只小鼠的爬桿時(shí)間,作為動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的指標(biāo)。

    1.3.3 腦組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法

    將小鼠麻醉后,開(kāi)胸,左心室插入灌注針頭,先灌注生理鹽水50 mL,再灌注4%多聚甲醛溶液50 mL,待小鼠全身僵直后,斷頭處死,冰上取全腦,4%多聚甲醛溶液固定18 h,石蠟包埋,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)漂洗,梯度乙醇脫水,石蠟包埋,切片,片厚8 μm,HE 及尼氏染色,光鏡觀察皮層及海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(xˉ±sxˉ)表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,Morris水迷宮隱藏平臺(tái)測(cè)試期采用two-way ANOVA 進(jìn)行分析。 所有統(tǒng)計(jì)分析及作圖均使用GraphPad Prism 9.5.0 軟件進(jìn)行。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組小鼠認(rèn)知功能比較

    在建立慢性酒精中毒性腦損傷模型小鼠的過(guò)程中,模型組小鼠體重增長(zhǎng)顯著低于對(duì)照組,從第2周開(kāi)始直至第6 周,模型組小鼠的體重明顯低于同齡的對(duì)照組小鼠(圖2)。 為了揭示酒精暴露小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷,每只小鼠都接受了Y 迷宮測(cè)試和Morris 水迷宮測(cè)試。 在Y 迷宮測(cè)試中,對(duì)照組和模型組小鼠進(jìn)入三臂的總次數(shù)沒(méi)有差異,這表明動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)不受長(zhǎng)期酒精暴露的影響。 在Y 迷宮測(cè)試中,模型組小鼠的自發(fā)交替率低于對(duì)照組(P<0.01),提示慢性乙醇處理可誘發(fā)小鼠短期空間工作記憶障礙(圖2)。

    注:A:小鼠體重變化;B:Y 迷宮實(shí)驗(yàn)。 與對(duì)照組相比, *P<0.05, **P<0.01。圖2 小鼠體重和Y 迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Note.A, Body weight changes of mice.B, Y maze test.Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.Figure 2 Comparison of body weights and the performance in Y maze between two groups

    在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,平臺(tái)測(cè)試中兩組的逃避潛伏期和平均游泳速度均無(wú)顯著差異(圖3)。 在隱藏平臺(tái)試驗(yàn)測(cè)試中,對(duì)于兩組小鼠在連續(xù)4 d 訓(xùn)練的逃避潛伏期數(shù)據(jù)進(jìn)行two-way ANOVA 分析(針對(duì)組別和訓(xùn)練天數(shù)這兩個(gè)因素),所得的分析結(jié)果說(shuō)明,無(wú)論是組別因素,還是訓(xùn)練天數(shù)因素,均對(duì)最終的逃避潛伏期有顯著影響(分別是P<0.05 和P<0.001),但上述兩個(gè)因素沒(méi)有交叉影響(P=0.9313)。

    注:A:可見(jiàn)平臺(tái)測(cè)試;B:隱藏平臺(tái)測(cè)試;C:空間探索測(cè)試。 與對(duì)照組相比, *P<0.05。圖3 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Note.A, Visible platform trial.B, Hidden platform trial.C, Probe trial.Compared with the control group, *P<0.05.Figure 3 Comparison of the results of water maze between two groups

    這些分析結(jié)果表明,在隱藏平臺(tái)試驗(yàn)測(cè)試中,兩組小鼠隨訓(xùn)練天數(shù)的增加,逃避潛伏期逐漸降低,結(jié)果有顯著性差異;并且相對(duì)于對(duì)照組,模型組的逃避潛伏期維持較長(zhǎng)時(shí)間,結(jié)果有顯著性差異。此外,對(duì)于隱藏平臺(tái)試驗(yàn)測(cè)試的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),兩組小鼠隱藏平臺(tái)測(cè)試第1 天逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與對(duì)照組相比,模型組在第2 ~4 天逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)。 在空間探索測(cè)試中,長(zhǎng)期暴露于酒精的小鼠與對(duì)照組小鼠相比,穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05)以及在平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比顯著降低(P<0.05)。 在搜索策略方面,模型組小鼠的路徑軌跡不太集中于平臺(tái)所在象限。 綜上,與對(duì)照組相比,長(zhǎng)期酒精暴露導(dǎo)致小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷。

    2.2 兩組小鼠運(yùn)動(dòng)功能比較

    在平衡木實(shí)驗(yàn)中,模型組小鼠通過(guò)平衡木的總時(shí)間顯著大于對(duì)照組(P<0.01),見(jiàn)圖4。 在爬桿實(shí)驗(yàn)中,模型組小鼠的爬桿時(shí)間與對(duì)照組相比顯著延長(zhǎng)(P<0.05),見(jiàn)圖4。 綜上,與對(duì)照組相比,慢性酒精暴露導(dǎo)致小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力明顯降低。

    注:A:平衡木實(shí)驗(yàn);B:爬桿實(shí)驗(yàn)。 與對(duì)照組相比, *P <0.05, **P<0.01。圖4 平衡木和爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Note.A, beam balance experiment.B, pole test.Compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.Figure 4 Comparison of the results of beam balance experiment and pole test between two groups

    2.3 兩組小鼠腦組織形態(tài)學(xué)比較

    HE 染色顯示對(duì)照組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列清晰,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、輪廓清晰,而模型組小鼠神經(jīng)元表型明顯收縮變形(圖5A),并且,在長(zhǎng)期乙醇暴露后,小鼠海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。 尼氏染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了兩組神經(jīng)元的這些病理改變(圖5B)。 即對(duì)照組海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)輪廓清晰,而模型組小鼠神經(jīng)元萎縮,形態(tài)破壞。 并且,經(jīng)長(zhǎng)期乙醇暴露后,小鼠海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。 兩組小鼠腦組織病理染色結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,長(zhǎng)期乙醇暴露導(dǎo)致小鼠海馬區(qū)形態(tài)損傷和細(xì)胞壞死。

    注:A:海馬組織HE 染色;B:海馬組織尼氏染色。圖5 海馬組織HE 和尼氏染色結(jié)果比較Note.A, HE staining of hippocampus.B, Nissl staining of hippocampus.Figure 5 Comparison of the results of HE staining and Nissl staining of hippocampus

    3 討論

    酒精使用障礙是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見(jiàn)的神經(jīng)和精神疾病之一,影響全球數(shù)百萬(wàn)人[13]。 隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,慢性酒精中毒性腦病的發(fā)病率逐年上升,但目前尚未得到足夠的重視。 為了進(jìn)一步對(duì)長(zhǎng)期過(guò)量酗酒所致的腦損傷的病理變化和發(fā)病機(jī)制有更好的研究,探索建立合適的動(dòng)物模型至關(guān)重要。

    國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的慢性酒精中毒性肝損傷模型和慢性飲酒成癮/戒斷模型及評(píng)價(jià)已較成熟,而慢性酒精誘導(dǎo)的腦損傷動(dòng)物模型及評(píng)價(jià)尚未完善。對(duì)于建立慢性酒精中毒性腦損傷動(dòng)物模型,有一些重要的造模因素需考慮并優(yōu)化,包括選取的動(dòng)物種類(lèi)品系、給予動(dòng)物酒精的方式、給予酒精的濃度、動(dòng)物酒精暴露的時(shí)間和劑量等。 本研究均通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)上述各因素進(jìn)行確定并優(yōu)化,以期得到一種盡可能模擬人類(lèi)慢性飲酒過(guò)程、穩(wěn)定可靠且造模時(shí)間短的腦損傷模型,這也是本研究對(duì)于目前已有造模方法的改進(jìn)創(chuàng)新之處。 具體模型建立過(guò)程中,首先,本實(shí)驗(yàn)選取了C57BL/6J 品系的小鼠作為建立模型的對(duì)象,這向該品系小鼠有較高的自愿飲酒量以及對(duì)酒精的生理反應(yīng)與人類(lèi)非常相似等特征有關(guān)[14]。 盡管?chē)?guó)內(nèi)外文獻(xiàn)也選用過(guò)BALB/c、ICR 及昆明小鼠作為造模對(duì)象[15-17],但總體而言,C57BL/6J 小鼠是目前研究酒精誘導(dǎo)的器官損傷最常用的動(dòng)物之一。 此外,建立模型過(guò)程中,如何給予動(dòng)物酒精的方式也是需要考慮并優(yōu)化的。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道常見(jiàn)的給酒方式包括口服(含酒精的流質(zhì)飲食或飲用水)、灌胃、腹腔注射和吸入(暴露于酒精蒸氣)。 通常,急性飲酒模型采用的是腹腔注射和灌胃方式,而慢性的動(dòng)物酒精暴露方案采用口服和吸入方式[7]。 含酒精的流質(zhì)飲食最早是由Lieber 和DeCarli 開(kāi)發(fā)的,在造模過(guò)程中,該飲食作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物唯一的食物和水來(lái)源[18-19]。 Lieber-DeCarli 模型雖然造模簡(jiǎn)便但未模仿人類(lèi)飲酒。 并且,還存在造模耗時(shí)長(zhǎng)、飲食種類(lèi)受限、營(yíng)養(yǎng)情況與正常飲食時(shí)不同等不足。 Tsukamoto-French 模型是通過(guò)動(dòng)物胃內(nèi)植入導(dǎo)管的方式給予酒精[20],造模過(guò)程需要特殊的設(shè)備技術(shù)和持續(xù)的動(dòng)物監(jiān)測(cè)、成本高,不便于廣泛應(yīng)用。 飲用水中添加酒精的模型是長(zhǎng)期乙醇暴露的更實(shí)用的解決方案,該模型已用于多種物種,包括小鼠、大鼠和豚鼠[21-22]。 該模型優(yōu)點(diǎn)是模擬人類(lèi)飲酒的生理過(guò)程、建模方便便宜,可長(zhǎng)期給酒(8 個(gè)月以上),但存在造模時(shí)間長(zhǎng),并且可能無(wú)法模擬人類(lèi)酒精疾病的晚期階段等不足[23]。de Witte 等[24]開(kāi)發(fā)了一種稱(chēng)為“肺酒精化”的酒精吸入模型,可以長(zhǎng)期達(dá)到較高的(200 mg/dL)血液酒精水平,適合酒精成癮方面的研究,但吸入酒精畢竟不同于飲用酒精,不能完全模擬真實(shí)情況。 綜合考量上述給酒方式的優(yōu)缺點(diǎn),此次模型采用飲水中添加酒精+灌胃法,避免單一給酒方式的局限性,使動(dòng)物模型盡可能模擬人類(lèi)慢性飲酒過(guò)程并縮短造模時(shí)間。 更值得一提的是,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),小鼠灌胃時(shí)能耐受的酒精濃度需低于30%(v/v),因此56°的白酒原液需稀釋1 倍后使用并1 d 中分兩次灌胃。 陳翠桃等[16]采用白酒原液灌胃前30 min給予小鼠灌胃蒸餾水的方法,這些都是為了減少高度酒精灌胃引起的小鼠中毒癥狀甚至死亡。 并且,造模前兩周采用酒精劑量梯度提升,提高小鼠耐受性和存活率。 最后,動(dòng)物暴露酒精的時(shí)間長(zhǎng)短也是建立模型時(shí)需要考慮的問(wèn)題。 通常研究人員會(huì)將1個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間地給予酒精視為慢性酒精暴露[23]。酒精引起的慢性疾病,如慢性酒精中毒性腦病,是一個(gè)多步驟的疾病過(guò)程,研究者感興趣的多步驟多進(jìn)程的哪個(gè)階段將決定酒精的給藥持續(xù)時(shí)間[23]。 本研究對(duì)慢性酒精中毒性腦病的早期癥狀尤其是認(rèn)知功能障礙和運(yùn)動(dòng)功能障礙最為關(guān)注,結(jié)合前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最終將小鼠慢性酒精暴露的時(shí)間優(yōu)化為6 周,相比目前報(bào)道的造模方法,既縮短了造模時(shí)間,又可以獲得穩(wěn)定的慢性酒精中毒性腦損傷模型。

    采用動(dòng)物模型效度對(duì)本研究所建立的小鼠動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。 動(dòng)物模型效度是動(dòng)物模型的綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),即評(píng)價(jià)所建立的動(dòng)物模型在多大程度上模擬了臨床該種疾病。 動(dòng)物模型效度主要由表面效度、結(jié)構(gòu)效度和預(yù)測(cè)效度組成,其中表面效度指動(dòng)物模型與臨床疾病癥狀和體征的相似性,結(jié)構(gòu)效度指動(dòng)物造模過(guò)程與臨床疾病的致病過(guò)程和病理機(jī)制的相似性,預(yù)測(cè)效度指動(dòng)物模型與臨床患者對(duì)治療藥物反應(yīng)的相似性。 首先,從表面效度看,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,模型組體重增長(zhǎng)幅度顯著降低,日常活動(dòng)易被噪聲驚嚇、動(dòng)作刻板;在認(rèn)知行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中,模型組在Y 迷宮測(cè)試中的自發(fā)交替率顯著降低,在水迷宮空間探索階段的穿越平臺(tái)次數(shù)和在平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比顯著降低;在運(yùn)動(dòng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中,長(zhǎng)期酒精暴露會(huì)導(dǎo)致小鼠通過(guò)平衡木的總時(shí)間和爬桿時(shí)間顯著延長(zhǎng);并且,模型組小鼠腦組織HE 染色和尼氏染色均顯示出海馬區(qū)形態(tài)損傷和細(xì)胞壞死。 這些與臨床上觀察到的患者在病理及病理生理方面的變化極為相似。 例如,慢性酒精中毒性腦病的患者早期常有焦慮不安、頭痛、失眠、乏力、注意力不集中等,逐漸出現(xiàn)智能障礙和精神異常,表現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、注意力不集中、記憶力下降,常伴有虛構(gòu)、思維能力受損,有的出現(xiàn)眼肌麻痹、共濟(jì)失調(diào)和影像學(xué)改變等。 與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)已報(bào)道的慢性酒精中毒性腦損傷模型評(píng)價(jià)相比,本研究對(duì)模型小鼠的認(rèn)識(shí)功能、運(yùn)動(dòng)功能以及海馬區(qū)病理?yè)p傷都采用兩種經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果相互佐證。 其次,從結(jié)構(gòu)效度看,慢性飲酒是酒精中毒性腦病的重要誘因,據(jù)此,建立小鼠長(zhǎng)時(shí)間酒精暴露可以認(rèn)為是一種具有良好效度的疾病模型。最后,從預(yù)測(cè)維度看,目前臨床尚無(wú)藥物治療該疾病,因此無(wú)從驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)效度。 綜上所述,本實(shí)驗(yàn)所建立的小鼠慢性酒精中毒性腦損傷模型在動(dòng)物模型的表面和結(jié)構(gòu)效度上是非常有優(yōu)勢(shì)的,基本模擬了人類(lèi)長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致的早期神經(jīng)病理和行為學(xué)改變。 此外,本實(shí)驗(yàn)造模方法簡(jiǎn)單方便、飼養(yǎng)成本較低、動(dòng)物存活率高、時(shí)間短,在6 周內(nèi)可初步建立小鼠慢性酒精中毒性腦損傷模型。 本研究的局限性在于,僅從動(dòng)物行為學(xué)和腦組織形態(tài)學(xué)兩方面評(píng)價(jià)了慢性酒精對(duì)小鼠腦組織所造成的損傷。在接下來(lái)的研究工作中,我們將進(jìn)一步探討慢性酒精所致的認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制以及潛在藥物的治療作用。

    猜你喜歡
    酒精中毒動(dòng)物模型腦損傷
    肥胖中醫(yī)證候動(dòng)物模型研究進(jìn)展
    MRI,CT檢查診斷酒依賴(lài)致慢性酒精中毒性腦病的效果對(duì)比
    急性酒精中毒的內(nèi)科急診治療分析
    胃癌前病變動(dòng)物模型復(fù)制實(shí)驗(yàn)進(jìn)展
    潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型研究進(jìn)展
    腦損傷 與其逃避不如面對(duì)
    幸福(2019年21期)2019-08-20 05:39:10
    急性酒精中毒患者發(fā)生急性并發(fā)癥特點(diǎn)分析
    糖尿病性視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型研究進(jìn)展
    院前急救中急性酒精中毒患者的救治體會(huì)
    認(rèn)知行為療法治療創(chuàng)傷性腦損傷后抑郁
    久久久国产精品麻豆| 午夜91福利影院| 高清av免费在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 黄色片一级片一级黄色片| 老鸭窝网址在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久狼人影院| 亚洲中文av在线| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产成人精品久久二区二区91| 又大又爽又粗| 两人在一起打扑克的视频| 99久久综合精品五月天人人| 999久久久精品免费观看国产| 日韩免费av在线播放| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲,欧美精品.| avwww免费| 黑人操中国人逼视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 嫩草影院精品99| 国产av一区二区精品久久| 人人澡人人妻人| 亚洲人成电影免费在线| 成在线人永久免费视频| 国产精品1区2区在线观看.| 三级毛片av免费| 国产有黄有色有爽视频| av欧美777| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 日韩有码中文字幕| tocl精华| 99热国产这里只有精品6| 久久香蕉激情| 又大又爽又粗| 18美女黄网站色大片免费观看| 麻豆av在线久日| 国产精品成人在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品无人区乱码1区二区| 美女 人体艺术 gogo| 91大片在线观看| 女性被躁到高潮视频| 亚洲少妇的诱惑av| 黄色视频,在线免费观看| 欧美色视频一区免费| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲 国产 在线| 国产真人三级小视频在线观看| 黄色视频不卡| 午夜免费激情av| 夜夜夜夜夜久久久久| 我的亚洲天堂| 亚洲五月色婷婷综合| 无遮挡黄片免费观看| 女性生殖器流出的白浆| 欧美精品一区二区免费开放| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 日韩免费av在线播放| 午夜免费观看网址| 性色av乱码一区二区三区2| 日本一区二区免费在线视频| 天堂影院成人在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久中文看片网| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品电影一区二区三区| 在线观看www视频免费| 搡老岳熟女国产| 99国产综合亚洲精品| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲情色 制服丝袜| 老司机在亚洲福利影院| 成人av一区二区三区在线看| 天天影视国产精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久精品国产清高在天天线| 国产精品久久久人人做人人爽| 91成人精品电影| av中文乱码字幕在线| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品99久久99久久久不卡| 又黄又爽又免费观看的视频| 美国免费a级毛片| 亚洲自偷自拍图片 自拍| www日本在线高清视频| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品综合久久久久久久免费 | 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 手机成人av网站| 少妇 在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产成人系列免费观看| 久热这里只有精品99| 天堂√8在线中文| 国产成人精品在线电影| 黄频高清免费视频| 两性夫妻黄色片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 级片在线观看| 高清欧美精品videossex| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲av成人av| 亚洲av熟女| 精品国产一区二区久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 热99国产精品久久久久久7| 美女午夜性视频免费| 69av精品久久久久久| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美人与性动交α欧美软件| 精品一品国产午夜福利视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 老鸭窝网址在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 91精品三级在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 色老头精品视频在线观看| 丰满的人妻完整版| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 两个人看的免费小视频| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 精品国产亚洲在线| 欧美午夜高清在线| 99香蕉大伊视频| 咕卡用的链子| 乱人伦中国视频| 亚洲七黄色美女视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产乱人伦免费视频| 久久天堂一区二区三区四区| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久 成人 亚洲| 亚洲自拍偷在线| 国产精品 国内视频| 91大片在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 老司机午夜十八禁免费视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 新久久久久国产一级毛片| 在线天堂中文资源库| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产欧美日韩一区二区精品| 日韩免费高清中文字幕av| 在线观看一区二区三区激情| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美激情高清一区二区三区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产1区2区3区精品| 午夜免费成人在线视频| a级毛片在线看网站| 国产高清国产精品国产三级| 日本五十路高清| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 婷婷丁香在线五月| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久久久久大精品| 日韩欧美在线二视频| 在线观看www视频免费| 色综合站精品国产| 亚洲精品国产一区二区精华液| av免费在线观看网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 三级毛片av免费| 99国产精品一区二区三区| 国产91精品成人一区二区三区| 99精品久久久久人妻精品| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久狼人影院| 精品一区二区三区四区五区乱码| 女同久久另类99精品国产91| 国产成人精品在线电影| 成人三级做爰电影| 久久久久久人人人人人| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲激情在线av| a级毛片黄视频| 亚洲,欧美精品.| 三级毛片av免费| 看免费av毛片| 亚洲精品在线美女| 亚洲av第一区精品v没综合| 最新在线观看一区二区三区| 精品高清国产在线一区| 一a级毛片在线观看| 超色免费av| 亚洲精品av麻豆狂野| 在线视频色国产色| 99香蕉大伊视频| 色老头精品视频在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产区一区二久久| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久久久久大精品| 精品久久久久久久久久免费视频 | 国产精华一区二区三区| 91九色精品人成在线观看| 日本 av在线| 69精品国产乱码久久久| 97人妻天天添夜夜摸| 久久精品影院6| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 男女下面插进去视频免费观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 三上悠亚av全集在线观看| 在线看a的网站| 国产成人啪精品午夜网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 91av网站免费观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 丁香欧美五月| 一级作爱视频免费观看| 水蜜桃什么品种好| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲精品久久午夜乱码| 丁香欧美五月| 久99久视频精品免费| av免费在线观看网站| 亚洲人成77777在线视频| 精品久久久久久成人av| 涩涩av久久男人的天堂| 午夜免费激情av| 又黄又粗又硬又大视频| 男女床上黄色一级片免费看| 校园春色视频在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美中文综合在线视频| 亚洲美女黄片视频| 日韩有码中文字幕| 欧美日韩黄片免| 性色av乱码一区二区三区2| 看免费av毛片| 免费在线观看完整版高清| 欧美一级毛片孕妇| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲五月婷婷丁香| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一区二区三区激情视频| av电影中文网址| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 成人三级黄色视频| 免费观看人在逋| bbb黄色大片| 国产成人av激情在线播放| 国产99白浆流出| 国产三级黄色录像| 国产亚洲欧美98| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产一区在线观看成人免费| 欧美在线一区亚洲| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲av成人av| x7x7x7水蜜桃| 国产成+人综合+亚洲专区| 99re在线观看精品视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 中文字幕最新亚洲高清| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产乱人伦免费视频| 国产有黄有色有爽视频| 午夜91福利影院| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲欧美激情综合另类| 日韩免费av在线播放| 国产精品偷伦视频观看了| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 露出奶头的视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 午夜a级毛片| 免费不卡黄色视频| 午夜免费成人在线视频| 精品久久久久久电影网| 亚洲成人久久性| 1024视频免费在线观看| 无限看片的www在线观看| 在线免费观看的www视频| 国产成人影院久久av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久久九九精品影院| 久久久久精品国产欧美久久久| 中文亚洲av片在线观看爽| 黄色视频不卡| 99久久国产精品久久久| 免费在线观看日本一区| 99国产极品粉嫩在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久草成人影院| 国产乱人伦免费视频| 国产成年人精品一区二区 | av国产精品久久久久影院| 美女大奶头视频| 视频在线观看一区二区三区| 99热国产这里只有精品6| 女性被躁到高潮视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 午夜福利影视在线免费观看| 一区福利在线观看| 亚洲五月天丁香| 亚洲色图综合在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 宅男免费午夜| 后天国语完整版免费观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 曰老女人黄片| 十八禁网站免费在线| 免费在线观看亚洲国产| 岛国在线观看网站| 亚洲精品一二三| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产真人三级小视频在线观看| av在线天堂中文字幕 | 妹子高潮喷水视频| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 亚洲成人久久性| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美一级毛片孕妇| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产有黄有色有爽视频| 久久久久国内视频| 亚洲av片天天在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 丝袜人妻中文字幕| 少妇的丰满在线观看| 日韩精品中文字幕看吧| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲男人的天堂狠狠| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲精品美女久久av网站| 精品日产1卡2卡| 日韩精品中文字幕看吧| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 一进一出抽搐动态| 成人精品一区二区免费| 国产成人系列免费观看| 中文欧美无线码| 亚洲欧美一区二区三区久久| 日韩欧美一区视频在线观看| 男人操女人黄网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 在线观看一区二区三区| 这个男人来自地球电影免费观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 午夜精品国产一区二区电影| 在线看a的网站| 国产精品野战在线观看 | 欧美黄色淫秽网站| 成人特级黄色片久久久久久久| 丝袜美腿诱惑在线| 最近最新中文字幕大全电影3 | 一进一出抽搐动态| 欧美性长视频在线观看| 久久精品影院6| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲精品在线观看二区| 最近最新免费中文字幕在线| 中文字幕高清在线视频| 成人三级黄色视频| 成人亚洲精品av一区二区 | 久久青草综合色| 日韩三级视频一区二区三区| 在线国产一区二区在线| 午夜亚洲福利在线播放| 午夜激情av网站| 一级,二级,三级黄色视频| 一二三四在线观看免费中文在| 久久亚洲真实| 精品福利观看| 又大又爽又粗| 亚洲欧美激情在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 12—13女人毛片做爰片一| 国产熟女午夜一区二区三区| 99久久人妻综合| 夜夜夜夜夜久久久久| 免费看a级黄色片| 热99re8久久精品国产| 亚洲成人久久性| 视频区图区小说| 自线自在国产av| 国产麻豆69| 亚洲自拍偷在线| 老司机福利观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 日韩三级视频一区二区三区| 韩国av一区二区三区四区| 99国产综合亚洲精品| 日韩国内少妇激情av| cao死你这个sao货| 亚洲中文字幕日韩| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产野战对白在线观看| 成人三级做爰电影| 男女下面进入的视频免费午夜 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精华一区二区三区| 成年版毛片免费区| 久久久国产精品麻豆| 正在播放国产对白刺激| 日本欧美视频一区| 很黄的视频免费| www.熟女人妻精品国产| 日韩大尺度精品在线看网址 | 无限看片的www在线观看| 亚洲片人在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 黄色女人牲交| 亚洲人成电影免费在线| 欧美日韩精品网址| 淫秽高清视频在线观看| av网站在线播放免费| 18禁观看日本| 青草久久国产| 美女国产高潮福利片在线看| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久 成人 亚洲| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久伊人香网站| 色在线成人网| 日本wwww免费看| 12—13女人毛片做爰片一| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲人成电影免费在线| 无遮挡黄片免费观看| 国产97色在线日韩免费| 亚洲全国av大片| 久久午夜亚洲精品久久| 91在线观看av| 亚洲激情在线av| 一级片'在线观看视频| 不卡一级毛片| 交换朋友夫妻互换小说| 久久久久久久久免费视频了| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲性夜色夜夜综合| av国产精品久久久久影院| 欧美黑人欧美精品刺激| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产一区在线观看成人免费| 校园春色视频在线观看| 黄片小视频在线播放| 在线观看免费高清a一片| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 成年人黄色毛片网站| 久久久久亚洲av毛片大全| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久亚洲精品不卡| 我的亚洲天堂| 丝袜美腿诱惑在线| av免费在线观看网站| 丝袜人妻中文字幕| 国产深夜福利视频在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久亚洲精品不卡| 可以在线观看毛片的网站| 欧美日韩乱码在线| 国产亚洲av高清不卡| 一级作爱视频免费观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品 欧美亚洲| 在线免费观看的www视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 岛国视频午夜一区免费看| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品无人区乱码1区二区| avwww免费| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产三级黄色录像| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 欧美丝袜亚洲另类 | 免费观看人在逋| 黄色成人免费大全| 后天国语完整版免费观看| 亚洲美女黄片视频| 亚洲免费av在线视频| 国产野战对白在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 男人的好看免费观看在线视频 | 热re99久久精品国产66热6| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 精品高清国产在线一区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 9色porny在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 两个人看的免费小视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久热在线av| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 两个人看的免费小视频| 国产精品二区激情视频| 9色porny在线观看| 91精品三级在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲精品美女久久av网站| 久久 成人 亚洲| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产成人精品久久二区二区免费| 视频区欧美日本亚洲| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 午夜日韩欧美国产| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 99久久99久久久精品蜜桃| av在线天堂中文字幕 | 精品久久久久久,| 欧美成人免费av一区二区三区| 美女大奶头视频| 色尼玛亚洲综合影院| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 一级毛片女人18水好多| 一夜夜www| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 校园春色视频在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 美女国产高潮福利片在线看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日本 av在线| 丝袜美足系列| 超色免费av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黄片播放在线免费| 一夜夜www| 黄色 视频免费看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 午夜福利免费观看在线| 一二三四在线观看免费中文在| 无人区码免费观看不卡| 1024香蕉在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美乱妇无乱码| 国产成人系列免费观看| 窝窝影院91人妻| av网站免费在线观看视频| 99久久人妻综合| xxx96com| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美日韩亚洲高清精品| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 91成年电影在线观看| 一级黄色大片毛片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产精品二区激情视频| 曰老女人黄片| 亚洲欧美激情综合另类| 深夜精品福利| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久99久视频精品免费| 另类亚洲欧美激情| 亚洲av片天天在线观看| 中文欧美无线码| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲国产欧美网| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久久国产欧美日韩av| 日日夜夜操网爽| av超薄肉色丝袜交足视频| 涩涩av久久男人的天堂| 看免费av毛片| 久久精品91无色码中文字幕| 国产男靠女视频免费网站| 怎么达到女性高潮| 国产精品久久视频播放| 国产三级在线视频| av国产精品久久久久影院| 免费看十八禁软件| 国产精品久久久av美女十八| 脱女人内裤的视频| 免费看十八禁软件| 一级a爱片免费观看的视频| 日日爽夜夜爽网站| 1024视频免费在线观看| 最好的美女福利视频网| 日韩欧美在线二视频|