抑制線粒體內(nèi)膜蛋白OMA1 對Rot 誘導(dǎo)帕金森病細(xì)胞模型凋亡的影響

石 瑾呂 玥徐 婷宣婷婷楊 娟杜丹丹張俊梅李海寧*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,銀川 750004;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心腦血管病醫(yī)院神經(jīng)電生理科,銀川 750004)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種慢性不可治愈的神經(jīng)退行性疾病,主要影響老年人,就患病率而言,PD 在世界上排名第二[1]。 PD 具有廣泛的表型和有限的治療[2]。 PD 患者出現(xiàn)運動癥狀及非運動癥狀時其體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元通常消失50%～80%[3-4]。 PD 目前是無法治愈的,有限的可用于臨床干預(yù)的措施只能提供癥狀緩解。 目前導(dǎo)致PD 的確切原因仍有待探索,相關(guān)研究顯示,線粒體功能障礙是PD 的主要發(fā)病機制[5]。 線粒體動力學(xué)缺陷導(dǎo)致線粒體功能障礙,并與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[6-7]。

近年來,OMA1(overlapping activity with m-AAA protease,OMA1)作為一種用于調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)研究的內(nèi)膜蛋白逐漸受到重視。 OMA1 在生理狀態(tài)下活性很低,但當(dāng)線粒體應(yīng)激時被迅速激活,過度活躍的OMA1 是致病性的[8-9],其可過度激活視神經(jīng)萎縮蛋白1(optic atrophy protein 1,OPA1),導(dǎo)致LOPA1(長形式)裂解增強,S-OPA1(短形式)釋放增加,過量的S-OPA1 可通過其成膜特性提高Bax/Bak1 活化后的外膜通透性并促進細(xì)胞色素c的釋放,促進線粒體的分裂和神經(jīng)元的凋亡[10]。 另外,相關(guān)研究報道稱基因消融OMA1 可防止OPA1 裂解,延遲小鼠神經(jīng)退化模型中的神經(jīng)元凋亡[11]。OMA1 通過激活L-OPA1 亞型從而抑制線粒體融合而誘發(fā)凋亡。 OMA1 在腫瘤方面的研究較多[12],但是OMA1 在PD 中的研究有限,因此,研究設(shè)想抑制OMA1 可能通過抑制細(xì)胞凋亡從而為以線粒體功能障礙為主要發(fā)病機制的PD 疾病提高新的治療靶點。 本研究使用Rot 誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SHSY5Y 建立體外PD 細(xì)胞模型,旨在研究PD 細(xì)胞模型上OMA1 的表達(dá)水平及抑制OMA1 的表達(dá)對PD細(xì)胞模型凋亡的影響,為帕金森病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 細(xì)胞系購自武漢普諾賽生命科技有限公司(貨號:CL-0208),細(xì)胞實驗經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理審查委員會審核批準(zhǔn)(KYLL-2022-0135)。

1.2 主要試劑與儀器

TUNEL 凋亡檢測試劑盒(貨號:KGA7073)、全蛋白提取試劑盒(貨號:KGP250)、BCA 蛋白含量檢測試劑盒(貨號:KGPBCA)、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(貨號:KGP113)均購自江蘇凱基生物公司;CCK-8 試劑盒(貨號:C6005)購自蘇州新賽美生物科技有限公司;MEM/F12 培養(yǎng)基(貨號:PM151220)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;DNA RNA Transfection Reagent(貨號:IV1216050) 購自美國Invitrogen 公司;EDTA 含酚紅胰酶胰酶(貨號:T1320)購自北京索萊寶科技有限公司、胎牛血清(FBS)(貨號:04-001-1ACS)購自以色列Biological Industries 公司; 魚藤 酮(Rotenone) (貨號: HYB1756-1)購自美國MCE 公司;GAPDH Ab(貨號:AF7021-30)購自江蘇Affity 公司;Anti-OMA1(貨號:ab154949)、Anti-caspase-3(貨號:ab32351-10 μL)、Anti-Bax ( 貨 號: ab32503)、 Anti-Bcl-2 ( 貨 號:ab32124)抗體均購自英國Abcam 公司;山羊抗兔二抗IgG-HRP 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;OMA1 siRNA 合成序列由上海漢恒生物科技有限公司合成及提供。 細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號:HF-90;Heal Force 公司);生物安全柜(型號:HFSAFE-1200;NUAIRE 公 司); 倒 置 顯 微 鏡( 型 號: CX51;OLYMPUS 公司);倒置熒光生物顯微鏡(型號:AXIO OBSERVER A1; AxioCam MRc5 公 司);Western blot 制膠設(shè)備(型號:mx1731;北京六一儀器公司);多色熒光凝膠成像系統(tǒng)(型號:CHEMI DOC MP;BioRad 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

從液氮罐中將凍存的SH-SY5Y 細(xì)胞取出,迅速移至提前預(yù)熱的37℃水浴鍋中,使其快速融化。 將細(xì)胞懸液吸至含有配制好的完全培養(yǎng)基(89%MEM/F12+10% FBS +1%雙抗)的15 mL 離心管中,1000 r/min 離心5 min,棄上清,加入提前配制好的培養(yǎng)基吹打混勻,將細(xì)胞懸液吸至含有4 mL 完全培養(yǎng)基的60 mm 培養(yǎng)皿中充分混勻,然后置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d 換液1 次。 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%左右時予以胰酶消化,按1 ∶2 進行傳代。

1.3.2 CCK-8 法篩選出最佳Rot 處理濃度

將SH-SY5Y 細(xì)胞用胰酶消化后按100μL 中含細(xì)胞數(shù)2×104個接種于96 孔板中,貼壁培養(yǎng)24 h后,加入用完全培養(yǎng)基稀釋好不同濃度的Rot(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 μmol/L)輕輕混勻后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后,每孔加入100 μL 配制好的CCK-8 溶液(MEM/F12 90 μL+CCK-8 10 μL),繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀檢測OD450進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。 實驗重復(fù)3 次。

1.3.3 實驗分組、處理及OMA1 siRNA 轉(zhuǎn)染

實驗分為對照(control)組(細(xì)胞不經(jīng)特殊處理)、PD 模型(PD model)組(0.2 μmol/L 的Rot 處理細(xì)胞24 h)、空載轉(zhuǎn)染(negative control)組(正常對照組基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染OMA1-siRNA 的陰性對照序列)和OMA1 siRNA 組(0.2 μmol/L 的Rot 處理細(xì)胞24 h 后轉(zhuǎn)染OMA1 siRNA)。

PD 細(xì)胞構(gòu)建成功后,進行siRNA 的轉(zhuǎn)染,參照Invigentech INVI DNA RNA 轉(zhuǎn)染說明書,將不同序列siRNA 各15 μL 與轉(zhuǎn)染試劑Invigentech INVI DNA RNA 15 μL 混合,室溫靜置10 ～15 min 后轉(zhuǎn)染至構(gòu)建好的PD 細(xì)胞模型上24 h,采用Western blot檢測最佳OMA1 沉默序列。 實驗重復(fù)3 次。

1.3.4 TUNEL 染色檢測細(xì)胞凋亡

12 孔板中接種各處理組細(xì)胞,實驗分組及處理同1.3.3,將不同處理組的細(xì)胞固定;1% TritonX-100 通透液處理5 min;在陽性片上滴加配制好的DNaseI 反 應(yīng) 液(DNaseI 30 μL+DNaseI Buffer 70 μL),37℃處理30 min;滴加TdT 酶反應(yīng)液,37℃避光60 min,洗滌;滴加Streptavidin-Fluorescein 標(biāo)記液,再在37℃避光30 min,洗滌;DAPI 復(fù)染細(xì)胞核,再次洗滌;熒光顯微鏡下觀察并拍照(激發(fā)波長450～500 nm,發(fā)射波長515～565 nm)。 實驗重復(fù)3 次。

1.3.5 Western blot 檢測OMA1、Caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)

各個實驗處理組提取總蛋白,采取BCA 法進行蛋白濃度的測定,統(tǒng)一各組蛋白濃度為2 μg/μL,100℃金屬浴中處理蛋白5 min,使蛋白變性,上樣量為30 μg,選取10% SDS-PAGE 分離膠、5%濃縮膠進行電泳,轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上,用5%脫脂牛奶于室溫下封閉1.5 h;加入對應(yīng)的一抗OMA1(1 ∶1000)、Caspase-3(1 ∶5000)、Bax(1 ∶5000)、Bcl-2(1 ∶1000),GAPDH(1 ∶10 000)于4℃孵育過夜;然后用TBST 洗滌3 次,每次10 min,分別加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶10 000),室溫孵育1 h,再次TBST洗膜3 次,配制ECL 發(fā)光液后,將目的條帶置于凝膠成像儀中,進行曝光和顯影。 使用Image J 軟件對蛋白質(zhì)相對表達(dá)量進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)均為計量資料,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)示,應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析,方差齊時,采用單因素方差分析,P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 篩選出最佳Rot 濃度

如表1 所示,以對照組細(xì)胞存活率為100%計算,隨著Rot 作用SH-SY5Y 細(xì)胞濃度逐漸增加(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 μmol/L),SH-SY5Y 細(xì)胞生存率呈濃度依賴性降低(P＜0.05)。 由于在Rot作用濃度為0.2 μmol/L 時,細(xì)胞存活率為(50.00±1.01)%。 因此將0.2 μmol/L Rot 濃度設(shè)為后續(xù)實驗造模最佳濃度。

表1 不同濃度Rot 對SH-SY5Y 細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effect of different concentrations of Rot on the survival rate of SH-SY5Y cells

2.2 不同濃度Rot 誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞中OMA1及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

如圖1A、1B 所示,與對照組相比,0.1 μmol/L和0.2 μmol/L Rot 誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞構(gòu)建的PD細(xì)胞模型中OMA1 蛋白表達(dá)水平逐漸升高(P＜0.01)。 如圖1C ～1E 所示,與對照組相比,0.1 μmol/L 和0.2 μmol/L Rot 組Caspase-3 表達(dá)明顯升高,Bax/Bcl-2 值明顯升高(P＜0.01)。 提示隨著魚藤酮濃度的升高,PD 細(xì)胞模型中OMA1 表達(dá)升高,凋亡蛋白的表達(dá)逐漸升高,抗凋亡蛋白的表達(dá)逐漸降低。

注:A:用Western blot 對不同組的代表性蛋白OMA1 圖像進行分析;B:各組OMA1 蛋白表達(dá)的定量分析;C:用Western blot 對不同組的代表性蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2 圖像進行分析;D:各組Caspase-3 蛋白表達(dá)的定量分析;E:各組Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)定量的比值分析。 與對照組相比, **P＜0.01。圖1 不同濃度Rot 誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞中OMA1 及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響Note.A, Representative protein of OMA1 image by Western blot in different groups.B, Quantitative analysis of OMA1 protein expression in each group.C, Representative protein of Caspase-3, Bax, Bcl-2 images by Western blot in different groups.D, Quantitative analysis of Caspase-3 protein expression in each groups.E, Quantitative analysis of Bax/Bcl-2 protein ratio expression in each groups.Compared with control group, **P＜0.01.Figure 1 Effect of OMA1 and apoptosis-related protein expression in SH-SY5Y cells induced by different concentrations of Rot

2.3 抑制OMA1 對PD 細(xì)胞模型凋亡的影響

2.3.1 抑制OMA1 對細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2 所示,未分化SH-SY5Y 細(xì)胞大小均一、細(xì)胞突起明顯、呈梭形及多邊形;給予Rot 處理后形成PD 細(xì)胞模型,其細(xì)胞形態(tài)改變、胞體變圓、突觸縮短甚至消失;與PD 細(xì)胞模型組相比,OMA1 siRNA 組細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)、突觸逐漸恢復(fù),細(xì)胞存活率升高。

2.3.2 抑制OMA1 對PD 細(xì)胞模型凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

如圖3 所示,與PD 模型組相比,OMA1 siRNA組中凋亡蛋白Caspase-3 表達(dá)水平降低(P＜0.01),Bax/Bcl-2 值明顯降低(P＜0.01)。 提示抑制OMA1的表達(dá)后,可以減輕PD 細(xì)胞模型上凋亡蛋白的表達(dá),升高抗凋亡蛋白的表達(dá)。

注:A:用Western blot 對不同組的代表性蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2 圖像進行分析;B:各組Caspase-3 蛋白表達(dá)的定量分析;C:各組Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)定量的比值分析。 與對照組比較, **P＜0.01;與PD 模型組比較, ##P＜0.01。圖3 抑制OMA1 在Rot 誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響Note.A, Representative protein of Caspase-3, Bax, Bcl-2 images by Western blot in different groups.B, Quantitative analysis of Caspase-3 protein expression in each groups.C, Quantitative analysis of Bax/Bcl-2 protein ratio expression in each groups.Compared with control group, **P ＜0.01.Compared with PD model group, ##P＜0.01Figure 3 Effect of inhibition of OMA1 in Rot-induced apoptosis-related protein expression in SH-SY5Y cells

2.3.3 抑制OMA1 對PD 細(xì)胞模型凋亡TUNEL 染色結(jié)果的影響

如圖4 所示,通過TUNEL 染色實驗進行凋亡驗證,與對照組相比,PD 模型組凋亡的綠色熒光強度顯著升高;與PD 模型組相比,OMA1 siRNA 組凋亡的綠色熒光強度顯著降低。 提示抑制OMA1 通過TUNEL 染色顯示可以減輕PD 細(xì)胞模型的凋亡。

注:A:TUNEL 染色檢測各組凋亡熒光強度,TUNEL:綠色熒光標(biāo)記凋亡細(xì)胞;DAPI:藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核;Merge:TUNEL 與DAPI 合成圖;B:各組熒光表達(dá)相對量。 與對照組比較, ***P＜0.001;與PD 模型組比較, ###P＜0.001。圖4 抑制OMA1 對PD 細(xì)胞模型凋亡TUNEL 染色Note.A, TUNEL staining to detect the fluorescence intensity of apoptosis in each group, TUNEL, Green fluorescent labeling of apoptotic cells.DAPI,Blue fluorescent labeling of cell nuclei.Merge, TUNEL and DAPI synthesis chart.B, Relative amount of fluorescence expression in each group.Compared with control group, ***P＜0.001.Compared with PD model group, ###P＜0.001.Figure 4 Inhibition of OMA1 on apoptosis TUNEL staining in PD cell models

3 討論

PD 致病的常見原因有黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性[13]、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激[14]等。 Polito等[15]報道,遺傳和環(huán)境因素對PD 的影響非常重要。 PD 與各種內(nèi)源性和外源性毒素[16]有關(guān),這些毒素經(jīng)常被用于建立PD 的疾病模型。 Rot 是一種線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ的抑制劑,具有明顯的神經(jīng)毒性,也具有高度親脂性,容易越過血腦屏障,能夠造成多巴胺神經(jīng)元α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)聚集[17],并且導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species,ROS)的過度生成,引起多巴胺能神經(jīng)元的氧化應(yīng)激[18],是模擬PD 病理常用的神經(jīng)毒性分子[19]。 因此本研究選用Rot 作為化學(xué)誘導(dǎo)劑構(gòu)建體外PD 細(xì)胞模型,并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡為線粒體功能障礙性疾病PD 提供新的治療靶點。

線粒體是細(xì)胞的能量工廠,同時也是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡通路激活的重要結(jié)構(gòu)。 線粒體的融合由OPA1、Mfn1、Mfn2 調(diào) 控,分 裂 則 由Drp1、Fis1 和EndoG 調(diào)節(jié)[20],在應(yīng)激條件下,線粒體融合允許功能性線粒體內(nèi)容物與受損線粒體的代償性混合,從而減輕急性損傷。 因此,融合中斷會加劇急性損傷,導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的呼吸能力喪失和隨后的細(xì)胞死亡。 OPA1 為線粒體形狀改變和細(xì)胞生存的調(diào)控中心。 OPA1 的缺失損害了線粒體融合,干擾了嵴的形態(tài)發(fā)生,并增加了細(xì)胞的凋亡敏感性[21]。 線粒體內(nèi)膜蛋白OMA1 和i-AAA 蛋白酶YME1L 分別在S1和S2 裂解OPA1[22]。 雖然YME1L 對OPA1 的加工處于代謝控制之下[23],但OMA1 在各種壓力應(yīng)激下被激活,導(dǎo)致L-OPA1 的完全降解和線粒體斷裂[24-25]。 此外,培養(yǎng)細(xì)胞中OMA1 的缺失被發(fā)現(xiàn)可以防止細(xì)胞凋亡[26-27]。 相反,過度活躍的OMA1 是致病性的[8,11,28],可能通過破壞OPA1 介導(dǎo)的線粒體融合導(dǎo)致疾病發(fā)生。 有趣的是,缺乏OMA1 的小鼠表現(xiàn)出免受神經(jīng)變性[11]、腎缺血[27]和心力衰竭[8]的保護,這強烈表明OMA1 是有希望的治療靶標(biāo)。 然而,OMA1 處理應(yīng)激誘導(dǎo)的OPA1 在體內(nèi)普遍相關(guān),但其在PD 發(fā)病中對凋亡相關(guān)的影響報道有限。

為探究抑制OMA1 在Rot 誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞構(gòu)建的體外PD 細(xì)胞模型中的表達(dá)及對凋亡的影響。 用不同濃度Rot 誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞構(gòu)建體外PD 細(xì)胞模型,隨著Rot 濃度的升高,OMA1 活性被激活,OMA1 蛋白的表達(dá)也逐漸升高,且凋亡蛋白表達(dá)升高,抗凋亡蛋白表達(dá)降低,實驗中凋亡蛋白的表達(dá)結(jié)果與在PD 患者腦組織的檢查顯示相符,PD患者腦組織的檢查結(jié)果顯示黑質(zhì)致密部活性Caspase-3 和Bax 水平升高[29-31]。 接下來設(shè)想,在PD 細(xì)胞模型上OMA1 的活性是增高的,其表達(dá)也是增加的,且凋亡蛋白的表達(dá)也是增高的,那么如果抑制OMA1 的表達(dá)后,對PD 細(xì)胞模型的凋亡會具有抑制作用嗎? 在PD 細(xì)胞模型基礎(chǔ)上抑制OMA1 的表達(dá),首先在形態(tài)學(xué)上就可以觀察到,與PD 模型組相比,抑制OMA1 后細(xì)胞存活率明顯升高、形態(tài)恢復(fù)、數(shù)量增多,隨后通過Western blot 檢測到抑制OMA1 的表達(dá)后凋亡蛋白表達(dá)降低,抗凋亡蛋白表達(dá)升高,TUNEL 染色發(fā)現(xiàn)抑制OMA1 凋亡的熒光染色與PD 模型組相比減少。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)在PD 細(xì)胞模型基礎(chǔ)上抑制OMA1 的表達(dá)對PD 細(xì)胞模型具有保護作用和抗凋亡的作用,可能為PD 患者的治療提供新的見解。