豌豆不同器官浸提液中化感物質(zhì)鑒定及差異性分析

摘要：豌豆生產(chǎn)中面臨連作障礙，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，但其發(fā)生機(jī)理未被完全揭示?；形镔|(zhì)引發(fā)的自毒效應(yīng)是連作障礙發(fā)生的重要原因之一，為了給進(jìn)一步研究豌豆化感物質(zhì)在豌豆連作障礙的作用提供參考。以不同基因型豌豆定豌10號(hào)、云豌8號(hào)為指示品種，對(duì)其苗期的根莖葉浸提液進(jìn)行了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析，以明確豌豆不同器官中化感物質(zhì)的差異。結(jié)果表明，云豌8號(hào)不同器官中化合物種類均高于定豌10號(hào)。2種豌豆的地上部器官中化合物種類多于根系。不同器官中相對(duì)含量較高的化感物質(zhì)種類存在差異。其中，抗氧化劑2246除定豌10號(hào)的葉片浸提液外，在2種豌豆的不同器官浸提液中均存在。此外，棕櫚酸和芥酸酰胺在云豌8號(hào)的不同器官浸提液中均存在，肉桂酸僅在定豌10號(hào)莖浸提液中存在。綜上，豌豆不同器官浸提液中均存在化感物質(zhì)，但其種類因器官類型和豌豆基因型而異。

關(guān)鍵詞：豌豆；不同器官浸提液；化感物質(zhì)；GC-MS

中圖分類號(hào)：S643.3? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：2097-2172（2023）11-1056-07

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.11.015

Identification and Differential Analysis of Allelopathic Substances in

Different Organ Extracts of Peas

ZHENG Lilong

（Institute of Agricultural Economics and Information，Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： Pea production is confronted with continuous cropping obstacle that seriously affects pea yield and quality， while the mechanism of? its occurrence is not fully understood. The autotoxic effect induced by chemosensory substances is one of the most important reasons for the occurrence of continuous cropping obstacle. Therefore， the study of chemosensory substances in pea plants is of great importance to further understand the occurrence of continuous cropping obstacle in pea. In this study， root， stem and leaf extracts of different genotypes of field-grown peas at the seedling stage（Dingwan 10 and Yunwan 8） were aualyzed using GC-MS to clarify the differences of chemical susceptibility substances in different organs of peas. The results showed that the compound composition in different organs of Yunwan 8 were higher than those of Dingwan 10. Two pea cultivars had more compounds in above-ground organs than in the roots. There were differences in the types of chemosensory substances with a high relative content in different organs. Among them， antioxidant 2246 was present in different organ extracts of both genotypes except for leaf extracts of Dingwan 10. In addition， palmitic acid and erucic acid amide were present in different organ extracts of Yunwan 8. Cinnamic acid was present only in the stem extract of? Dingwan 10. In conclusion， all different organ extracts of pea exist chemosensory substances， but their chemical compositions are varied with organ type and pea genotype.

Key words： Pea; Extract from different organ; Allelopathic substance; GC-MS

收稿日期：2023 - 09 - 15

作者簡(jiǎn)介：鄭立龍（1972 — ），男，山西萬榮人，副研究員，主要從事農(nóng)業(yè)科技信息及作物抗旱及生理生化研究工作。Email： 369973058@qq.com。

豌豆（Pisum sativum L.）作為我國(guó)重要的農(nóng)作物之一［1 ］，其產(chǎn)量的穩(wěn)定性及優(yōu)良品質(zhì)是我國(guó)農(nóng)業(yè)關(guān)注的重要問題之一。近年來由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)使豌豆種植呈產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)。另外，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，人口基數(shù)增加，耕地面積逐年減少，耕地復(fù)種指數(shù)顯著上漲，且不同作物對(duì)光照、溫度等環(huán)境因子的需求不同導(dǎo)致連作現(xiàn)象普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響豌豆的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成［2 - 3 ］。因此加強(qiáng)對(duì)作物連作障礙機(jī)理的研究，有利于對(duì)后期緩解甚至解決豌豆連作障礙提供新思路和理論依據(jù)。連作障礙成因復(fù)雜，其中植物體分泌的化感物質(zhì)引發(fā)的自毒效應(yīng)是造成連作障礙的主要原因之一［4 ］?；形镔|(zhì)幾乎存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等所有器官中［5 - 6 ］，主要通過雨霧淋溶、自然揮發(fā)、植物殘?bào)w與凋落物分解以及根系分泌等途徑向周圍環(huán)境釋放化學(xué)物質(zhì)，從而影響自身及其周圍其他植物的生長(zhǎng)［7 - 10 ］。植物化感物質(zhì)的種類和成分與植物自身基因型、生長(zhǎng)期以及外界環(huán)境條件等密切相關(guān)［11 - 13 ］。不同類型植物的化感物質(zhì)的種類與數(shù)量有明顯差異，且同一植物在不同生育期化感物質(zhì)的種類與濃度也有較大的差別［14? ］。因此，探究作物不同器官存在的化感物質(zhì)對(duì)于揭示作物連作障礙的發(fā)生機(jī)理具有重要意義。

化感物質(zhì)主要是植物的次級(jí)代謝物，根據(jù)結(jié)構(gòu)和成分的不同，一般將常見的自毒物質(zhì)分為14類［15 - 16 ］，涉及酚類、萜類、糖和糖苷類、生物堿和非蛋白氨基酸等［8 ］。如李琴琴［17 ］采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）在小豆根、莖、葉和根際土壤浸提液中檢測(cè)到鄰苯二甲酸氫鉀、肉桂酸和對(duì)羥基苯甲酸等化感物質(zhì)。陳君良［7 ］通過GC-MS在百合根系分泌物中分離出了棕櫚酸、抗氧劑2246等化感物質(zhì)，說明通過GC-MS可鑒定植物體中的化感物質(zhì)［7 ］。豌豆種植中面臨連作危害，喻景權(quán)等［18 ］發(fā)現(xiàn)豌豆根系分泌物中存在化感物質(zhì)，這些物質(zhì)的積累可能是引發(fā)連作障礙的原因之一。但化感物質(zhì)是否僅存于根系分泌物中，還是在豌豆植株不同器官中均存在，且化感物質(zhì)種類是否有組織特異性等問題目前均未深入研究。因此，筆者采用GC-MS對(duì)苗期不同基因型豌豆的根、莖、葉浸提液成分及其相對(duì)含量進(jìn)行了鑒定及分析，以期為進(jìn)一步研究豌豆化感物質(zhì)在連作障礙中的作用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

指示豌豆品種為定豌10號(hào)、云豌8號(hào)，均由定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 豌豆不同器官的獲取? ? 不同基因型豌豆于2022年4月播種于甘肅省定西市安定區(qū)榆河村豌豆試驗(yàn)基地，待豌豆生長(zhǎng)至苗期時(shí)，采集不同基因型豌豆植株置于4 ℃冰盒中，并帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2? ? 豌豆根、莖、葉水浸提液的制備? ? 參照宋慧［19 ］的方法（稍作調(diào)整）將采集的豌豆植株根、莖、葉分離，并自然風(fēng)干后粉碎過60目篩。取10 g的樣品，加入100 mL無菌水，振蕩、浸提、過濾得濾液，取50 mL備用。

1.2.3? ? 各器官浸提液中化感物質(zhì)的分離、純化? ? 參照宋慧［19 ］的方法進(jìn)行豌豆各器官浸提液中化感物質(zhì)的分離與純化。用分析純二氯甲烷萃取50 mL浸提液溶液2次，每次添加二氯甲烷125 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 45 ℃ 減壓濃縮至干，加入2 mL色譜純二氯甲烷溶解，過0.45 μm濾膜，0.5 mL用于GC-MS上樣分析［19 ］。

1.2.4? ? 各器官浸提液的GC-MS分析? ? 參照宋慧［19 ］的方法進(jìn)行各器官浸提液的GC-MS分析。采用電子轟擊源，轟擊電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，進(jìn)樣口溫度260 ℃，柱溫50 ℃（保持5 min），以 5 ℃/min程序升溫至 250 ℃（保持10 min）。掃描范圍M/Z 35～550 amu，毛細(xì)管柱規(guī)格30 m×0.32 μm×0.25 mm，載氣為He，流量 1 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL［19 ］。

1.3? ?數(shù)據(jù)處理

與標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫(kù) NIST08 對(duì)比并進(jìn)行人工分析，確定各組分物質(zhì)結(jié)構(gòu)及名稱。相對(duì)含量指各組分在 GC-MS 分析中出峰面積占總峰面積的比例（/%）［20 - 21 ］。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?定豌10號(hào)不同器官浸提液的化感物質(zhì)鑒定

2.1.1? ? 根系浸提液化感物質(zhì)? ? 從表1可以看出，定豌10號(hào)根系浸提液成分共有20種，烴類、醇類化合物各6種，酮類和酰胺類化合物各2種，酯類、醛類、酚類、其他化合物各1種，其中相對(duì)含量最高的是抗氧劑2246（20.77%），其次是芥酸酰胺（16.97%）、4-（3- 羥基丁基）-3，5，5-三甲基環(huán)己烷 -2- 烯 -1- 酮（11.31%）、1-十九碳烯（7.41%）。

2.1.2? ? 莖稈浸提液化感物質(zhì)? ? 定豌10號(hào)莖稈浸提液二氯甲烷提取液的GC-MS鑒定成分結(jié)果（表2）表明，定豌10號(hào)莖稈浸提液中存在29種化合物，其中酯類化合物10種、酸類化合物7種、烴類化合物5種、醛類化合物4種、酚類化合物2種、醇類化合物1種，其中相對(duì)含量排名前四的化合物分別是棕櫚酸（13.91%）、肉桂酸（11.96%）、肉豆蔻酸（8.17%）、抗氧劑2246（8.04%）。

2.1.3? ? 葉片浸提液化感物質(zhì)? ? 定豌10號(hào)葉片浸提液鑒定成分結(jié)果（表3）表明，定豌10號(hào)葉片浸提液共檢測(cè)出33種化合物，其中烴類化合物18種，酯類化合物12種，醛類化合物、醇類化合物、苯類化合物各1種。其中烴類和酯類在所有化合物中占有的比重較大，相對(duì)含量較高的前四種物質(zhì)分別是正十九酸甲酯（42.47%）、棕櫚酸甲酯（14.73%）、硬脂酸甲酯（8.57%）、4-N-丙基苯甲醛（5.41%）。 2.2? ?云豌8號(hào)不同器官浸提液的化感物質(zhì)鑒定

2.2.1? ? 根系浸提液化感物質(zhì)? ? 從表4可以看出，云豌8號(hào)根系浸提液中共檢測(cè)7類36種化合物，包括烴類化合物16種、酯類化合物6種、醇類化合物5種、酮類化合物4種、酚類化合物和酸類化合物各2種、酰胺類化合物1種，其中烴類和酯類化合物占大多數(shù)，根系水浸提液相對(duì)含量較高的化合物分別是抗氧劑2246、芥酸酰胺、棕櫚酸、正-二十二醇，相對(duì)含量分別為23.40%、20.28%、13.85%、7.80%。

2.2.2? ? 莖稈浸提液化感物質(zhì)? ? 由表5可知，云豌8號(hào)莖稈浸提液中的化合物主要有9類40種，包括烴類化合物12種、醇類化合物8種、酮類化合物5種、酸類化合物5種、酯類化合物和酚類化合物各3種、醛類化合物2種，酰胺類化合物和其他化合物各1種，其中烴類、醇類、酮類和酸類物質(zhì)占大多數(shù)，相對(duì)含量較高的物質(zhì)分別是棕櫚酸（15.67%）、芥酸酰胺（14.37%）、4-乙基苯酚（8.72%），抗氧劑2246（7.39%）。

2.2.3? ? 葉片浸提液化感物質(zhì)? ? 由云豌8號(hào)葉片浸提液分析結(jié)果（表6）可以看出，云豌8號(hào)葉片浸提液中存在8類37種化合物，其中包括烴類化合物10種，醇類化合物6種，酯類化合物、酮類化合物和酸類化合物各5種，醛類化合物4種，酚類類化合物和酰胺類化合物各1種。相對(duì)含量最高的是棕櫚酸，達(dá)35.57%；其次是蓖麻油酸，為9.76%；芥酸酰胺（8.73%）、抗氧劑2246（5.22%）含量較高。

2.3? ?定豌10號(hào)和云豌8號(hào)不同器官浸提液的化感物質(zhì)鑒定結(jié)果分析

對(duì)豌豆植株不同器官浸提液的化感物質(zhì)鑒定結(jié)果可知，在定豌10號(hào)、云豌8號(hào)的根系浸提液中分別檢測(cè)到20種、36種化合物，莖稈浸提液中分別檢測(cè)到29、40種化合物，葉片浸提液中分別有33、37種化合物。云豌8號(hào)不同器官浸提液中檢測(cè)到的化合物種類多于定豌10號(hào)。2種豌豆的地上部器官中化合物種類多于根系。不同器官中相對(duì)含量較高的化感物質(zhì)種類存在差異。其中，抗氧化劑2246除定豌10號(hào)的葉片浸提液外，在2種豌豆不同器官浸提液中均存在。此外，棕櫚酸和芥酸酰胺在云豌8號(hào)的不同器官浸提液中均存在。肉桂酸僅在定豌10號(hào)莖浸提液中存在。

3? ?討論與結(jié)論

豌豆作為典型的忌連作作物，連作時(shí)不僅會(huì)導(dǎo)致病蟲害加劇，還會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量降低、品質(zhì)下 降［20 - 21 ］。喻景權(quán)等［18 ］研究發(fā)現(xiàn)，豌豆根系分泌物中存在的化感物質(zhì)可引起連作障礙。另有研究表明，不同品種、不同器官之間化感物質(zhì)的含量和種類存在較大的區(qū)別［22 - 23 ］。然而目前有關(guān)豌豆不同器官中是否存在化感物質(zhì)，及其化感物質(zhì)的種類尚不清楚。本研究通過采用GC-MS技術(shù)分析了2種不同豌豆的不同器官浸提液中的化感物質(zhì)種類及相對(duì)含量。結(jié)果表明，在定豌10號(hào)和云豌8號(hào)的根系浸提液中分別檢測(cè)到20種、36種化合物，莖稈浸提液中分別檢測(cè)到29、40種化合物，葉片浸提液中分別有33、37種化合物。云豌8號(hào)不同器官浸提液中檢測(cè)到的化合物種類多于定豌10號(hào)。這可能是由于豌豆是一種遺傳多樣性較高的植物，長(zhǎng)期的選育導(dǎo)致每個(gè)豌豆都具有自己獨(dú)特的遺傳背景。其中可能包括基因變異和多態(tài)性，并影響豌豆中的代謝途徑、酶活性以及其他相關(guān)的生物化學(xué)反應(yīng)，從而出現(xiàn)不同豌豆中化合物的差異。此外，我們發(fā)現(xiàn)，2種豌豆地上部器官中化合物種類均多于根系，這可能是由于葉片進(jìn)行光合作用，利用光能將二氧化碳和水轉(zhuǎn)化成有機(jī)物質(zhì)。此外，地上部且易受到外界環(huán)境因素的影響，如干旱，蟲害等，需要合成更多防御性化合物來應(yīng)對(duì)外界侵害，從而導(dǎo)致地上部器官化合物種類多于根系。

目前普遍認(rèn)為低分子有機(jī)酸、酚類及萜類為最常見的化感物質(zhì)［24 - 26 ］。喻景權(quán)等［18 ］從豌豆的根系分泌物中鑒定出以肉桂酸、苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸為代表的多種酚酸類化感物質(zhì)。宋慧［19 ］從小豆不同器官及根際土壤浸提液中分離出了鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、肉桂酸等有機(jī)酸類物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)三者均會(huì)對(duì)小豆的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。本研究對(duì)豌豆不同品種的不同器官浸提液成分進(jìn)行鑒定，在定豌10號(hào)的莖稈同樣也發(fā)現(xiàn)肉桂酸、肉豆蔻酸等有機(jī)酸的存在，且相對(duì)含量都較高，但其化感活性的大小及對(duì)不同豌豆的影響程度還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。陳君良［7 ］利用GC-MS技術(shù)從百合根系分泌物中分離出抗氧劑2246、棕櫚酸、鄰苯二甲酸異辛酯等物質(zhì)，并證實(shí)了抗氧劑2246和棕櫚酸會(huì)對(duì)百合的生長(zhǎng)產(chǎn)生化感抑制效應(yīng)，本研究中從定豌10號(hào)的根系和莖稈中，云豌8號(hào)根系、莖稈、葉片均檢測(cè)到抗氧劑2246，從定豌10號(hào)的莖稈中及云豌8號(hào)根系和莖稈中均檢測(cè)到棕櫚酸。但這兩種物質(zhì)是否會(huì)對(duì)豌豆產(chǎn)生化感作用目前尚不清楚。與以往研究結(jié)果不同的是，本研究中從云豌8號(hào)的根、莖、葉中均檢測(cè)前人未發(fā)現(xiàn)的化感物質(zhì)芥酸酰胺，且相對(duì)含量在不同的組分中均較高?；谏鲜鲅芯勘砻?，豌豆不同器官中，肉桂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、抗氧劑2246及芥酸酰胺中具有化感作用潛力的成分，后續(xù)可進(jìn)一步進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證來探究其化感作用的強(qiáng)弱。

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