動(dòng)物骨骼標(biāo)本制作中脫脂漂白方法的探討
——以羊駝骨骼為例

丁常根,楊興林,馮 平

(榆林學(xué)院,陜西榆林 719000)

動(dòng)物骨骼標(biāo)本作為醫(yī)學(xué)院和獸醫(yī)學(xué)院的必備教具,被廣泛應(yīng)用于教學(xué)與科普[1]。常見的動(dòng)物骨骼標(biāo)本有3種,即附韌帶骨骼標(biāo)本、透明雙染色骨骼標(biāo)本、關(guān)節(jié)分離式骨骼標(biāo)本[2]。附韌帶骨骼標(biāo)本使用年限短,韌帶容易斷裂致使骨骼散架。透明雙染色骨骼標(biāo)本利用阿爾新藍(lán)、不同濃度梯度的酒精或甲醇、胰蛋白酶、茜素紅使骨骼顯現(xiàn)出藍(lán)色與紅色,使軟組織透明,以此方便觀察[3]。關(guān)節(jié)分離式骨骼標(biāo)本具有不易損壞的優(yōu)點(diǎn),在實(shí)際生活中更為常見。

在關(guān)節(jié)分離式骨骼標(biāo)本的制作過程中,脫脂是重要的環(huán)節(jié),常用物理和化學(xué)方法進(jìn)行脫脂。物理脫脂的方法有高壓蒸汽滅菌鍋蒸煮和超臨界CO2處理[4]。有學(xué)者研究表明,高溫煮沸會(huì)增加鯨魚骨骼孔隙率,超臨界CO2萃取使骨骼中的哈佛斯管產(chǎn)生細(xì)小裂紋,兩種方法都會(huì)對(duì)骨骼的膠原蛋白造成不可逆的損傷[5-6]。脫脂的化學(xué)試劑有汽油、工業(yè)酒精、丙酮、環(huán)已酮、甲醛/氯仿、天那水、二甲苯、醋酸戊酯、十二烷基苯磺酸鈉[7-9]。用FT-拉曼光譜及氣相色譜開展氯化溶劑和丙酮對(duì)骨骼的脫脂試驗(yàn),氯化溶劑會(huì)使骨骼變脆并產(chǎn)生細(xì)小裂紋,丙酮脫脂僅作用于骨骼表面,對(duì)骨骼內(nèi)部脫脂作用不顯著[10]。對(duì)魚類骨骼采用氨水進(jìn)行脫脂,氨水對(duì)小型骨骼具有良好脫脂效果,大型骨骼用氨水可以輔助脫脂;對(duì)綿羊骨骼用氨水防止泛油腐蝕,結(jié)果顯示,氨水對(duì)動(dòng)物骨骼的脫脂不徹底具有較好防止泛油的效果;在羊骨骼的脫脂處理中用汽油進(jìn)行初步脫脂,其次取90 ℃的熱水進(jìn)行浸泡,浸泡過程中添加氨水進(jìn)一步脫脂,此時(shí)熱水中有氣泡冒出,冒泡停止后,脂肪全部脫出[11-12]。

本研究運(yùn)用關(guān)節(jié)分離式骨骼標(biāo)本制作方法,用氨水作為脫脂溶劑對(duì)210日齡雄性羊駝骨骼進(jìn)行脫脂試驗(yàn),探索骨骼標(biāo)本在使用過程中不腐爛變質(zhì)、不泛油變黃的骨骼脫脂新方法,以期為骨骼標(biāo)本的制作提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用骨骼 選取210日齡雄性羊駝大小相近的10對(duì)肋骨及其他部位的骨骼。

1.1.2 主要試劑 氫氧化鈉(批號(hào):20210508),天津科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;過氧化氫片劑(批號(hào):20210927),昌樂鑫富強(qiáng)有限公司產(chǎn)品;氨水(批號(hào):20200707),煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品;蒸餾水由榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 儀器與設(shè)備 解剖手術(shù)臺(tái)、電子天平、浸泡箱、恒溫箱,均由榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物預(yù)處理 ①取210日齡雄性羊駝沿腹中線打開腹腔去除內(nèi)臟,進(jìn)行清水沖洗,以四肢、頸部、頭部依次取下,逐一剔除骨骼各部位上的軟組織,解剖過程中舌骨、腕骨、籽骨、胸骨柄等細(xì)小骨要保留[13]。②剝離好的骨骼依照骨骼的大小、密度、骨髓腔容量放入1～3號(hào)浸泡箱內(nèi),頭骨、頸椎、胸椎、腰椎、薦骨置1號(hào)浸泡箱,前肢骨置2號(hào)浸泡箱,后肢骨、骨盆置3號(hào)浸泡箱。同時(shí)肋骨、胸骨、舌骨、尾椎、腕骨、籽骨等細(xì)小骨分類置于各紗布袋內(nèi)[14],置入燒杯內(nèi)。將現(xiàn)配制的20 g/L NaOH溶液對(duì)骨骼進(jìn)行初步脫脂腐蝕,浸泡箱內(nèi)NaOH溶液以沒過骨骼為準(zhǔn),分別加入配制好的NaOH溶液。1～20號(hào)燒杯內(nèi)肋骨斜置,各加入1 L配制好的NaOH溶液使肋骨完全浸于溶液當(dāng)中。21號(hào)燒杯內(nèi)細(xì)小骨與所剩6根肋骨加入配制好的NaOH溶液。經(jīng)肉眼觀察殘余肌肉呈透明膠凍樣后,對(duì)骨骼澆注約85 ℃的熱水,長(zhǎng)骨兩端打孔,利用注射器清水沖洗后,將配制的20 g/L NaOH溶液注入到長(zhǎng)骨內(nèi)骨髓腔。再于NaOH溶液中浸泡10～12 h,后清水沖洗,清除殘余肌肉并剔除蹄部角質(zhì)層,暴露骨骼,為脫脂漂白試驗(yàn)做好準(zhǔn)備。腐蝕脫脂完成后,根據(jù)骨骼大小、密度和骨髓腔容量,將骨骼分為后肢骨、前肢骨、頭骨、肋骨、細(xì)小骨等5類,并置于不同的容器。

1.2.2 骨骼脫脂漂白 ①選取羊駝肋骨13對(duì)中的10對(duì)大小相近的肋骨,將20根肋骨依次置入1號(hào)～20號(hào)燒杯內(nèi),隨機(jī)為分4組。同時(shí)制備濃度為2、4、6、8、10 mL/L氨水與100 mL/L H2O2混合溶液,將其1組的每件燒杯分別加入1 L制備好的混合溶液置于20 ℃的恒溫箱內(nèi)反應(yīng),其反應(yīng)時(shí)間設(shè)為4 h(其余組將溫度依次設(shè)為25、30、35 ℃,其濃度、液體量、時(shí)間等其他條件不變)。觀察不同條件下的脫脂效果。②對(duì)篩選到的最適氨水濃度及溫度,其室溫與恒溫箱溫度相近時(shí),骨骼可在室內(nèi)進(jìn)行脫脂,將后肢骨、前肢骨、頭骨、所剩肋骨、細(xì)小骨為標(biāo)志性骨骼與全身其他骨骼分類置于不同的浸泡箱,添加溶液使骨骼完全浸于溶液中進(jìn)行脫脂漂白處理,觀察各浸泡箱內(nèi)骨骼的脫脂時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度、氨水濃度處理結(jié)果

25～30 ℃時(shí)6 mL/L的氨水皂化反應(yīng)可控且不損傷肋骨,1 h后反應(yīng)明顯,大量白色泡沫析出,泡沫表面附有脂滴,用玻璃棒進(jìn)行緩慢攪拌使骨骼充分與藥品發(fā)生反應(yīng)。在溫度相同情況下,氨水濃度越高,反應(yīng)越迅速,氨水濃度過高對(duì)肋骨表面產(chǎn)生損傷,對(duì)肋體損傷較大,肋頭次之。在溫度不同,氨水濃度相同的情況下,低溫?zé)o法對(duì)肋骨有效脫脂漂白,并對(duì)肋骨表面造成了損傷(表1)。

表1 反應(yīng)4 h條件下不同濃度、不同溫度的氨水與100 mL/L H2O2的混合溶液對(duì)肋骨的處理效果

2.2 不同部位骨骼在氨水中的處理時(shí)間和效果

25～30 ℃、6 mL/L氨水對(duì)不同類型骨骼脫脂漂白顯示,后肢骨9 h可完成脫脂漂白,前肢骨8 h可完成脫脂漂白,頭骨6 h可完成脫脂漂白,籽骨、腕骨、髕骨、尾椎、胸骨柄等細(xì)小骨骼,2 h可完成脫脂漂白,表明骨骼的大小、密度、骨髓腔容量會(huì)影響到脫脂漂白的時(shí)間,且呈正相關(guān)性(表2)。

表2 氨水對(duì)不同部位骨骼脫脂漂白的效果

3 討論

氨水為無機(jī)溶劑,與有機(jī)溶劑相比,H2O2漂白過程中添加氨水能與油脂產(chǎn)生皂化反應(yīng),不同于NaOH的皂化反應(yīng),強(qiáng)堿作用在暴露骨質(zhì)的骨骼其損傷較為嚴(yán)重,而氨水為弱堿對(duì)骨骼損傷較小。本研究通過氨水與H2O2的混合溶液對(duì)羊駝骨骼的處理,發(fā)現(xiàn)溫度在25～30 ℃反應(yīng)可控且不損傷骨骼。此外,在25～30 ℃的條件下發(fā)現(xiàn)當(dāng)氨水的濃度過高或室內(nèi)溫度過高,皂化反應(yīng)明顯增強(qiáng),同時(shí)室外陽光充沛的條件下自然光的直射,會(huì)導(dǎo)致皂化反應(yīng)劇烈,制作過程中需關(guān)注自然條件造成的影響,必要時(shí)需迅速將骨骼取出并重新配制溶液。

漂白作為較多動(dòng)物骨骼標(biāo)本所必需的環(huán)節(jié),H2O2濃度超過200 mL/L會(huì)造成骨骼的損傷,H2O2濃度對(duì)于不同動(dòng)物不同部位的骨骼、薄厚、骨質(zhì)及其抗侵蝕的性質(zhì)也均有差別[15],按照動(dòng)物體型、骨密度、骨髓腔容量等原則合理控制H2O2濃度在30～100 mL/L[16],可降低對(duì)骨質(zhì)的影響。

NaOH作為骨骼脫脂腐蝕的重要試劑,其不僅能夠去除殘留在骨骼凹槽縫隙處的肌肉,同時(shí)還可將脂肪水解成甘油和脂肪酸鹽,對(duì)去除骨骼表面的油脂有一定的成效[17-18]。本試驗(yàn)羊駝骨骼利用NaOH處理后其表面均有油污殘留,其中較小的骨骼表面油脂處理有一定效果,而長(zhǎng)骨骨骼表面殘留有較多油污和不規(guī)則小黃點(diǎn),說明NaOH可作為油脂處理的輔助方法,但其主要作用是去除骨骼縫隙內(nèi)殘余筋肉。

動(dòng)物骨骼標(biāo)本制作時(shí),未完全脫脂的骨骼,油脂會(huì)緩慢滲出,極易滋生細(xì)菌污染,影響骨骼標(biāo)本的使用壽命[19]。動(dòng)物骨骼的質(zhì)量也會(huì)影響到骨骼標(biāo)本的使用和保存年限,老齡動(dòng)物骨骼往往伴有纖維質(zhì)骨化,骨骼內(nèi)黃骨髓過多,難于溶解,骨髓中含有大量飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸,是造成骨骼標(biāo)本發(fā)生霉變、發(fā)黑、散發(fā)酸臭味等造成使用年限縮短的主要誘因,而幼齡動(dòng)物骨骼發(fā)育不完善,部分骨骼發(fā)育未愈合,不適于制作為骨骼標(biāo)本。為了避免動(dòng)物本身對(duì)骨骼標(biāo)本造成的影響,選擇試驗(yàn)動(dòng)物方面,成年動(dòng)物相比老齡動(dòng)物與幼齡動(dòng)物更易制作骨骼標(biāo)本[20-22]。

羊駝骨骼以6 mL/L氨水與100 mL/L H2O2混合,25～30 ℃脫脂漂白效果較好,其脫脂漂白的時(shí)間與骨骼的大小、密度、骨髓腔容量呈正相關(guān)性。通過對(duì)羊駝全身骨骼的脫脂漂白處理,為脫脂的方案增添了新的選擇,同時(shí)填補(bǔ)了制作羊駝骨骼標(biāo)本資料上的空白。