3 種Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)對(duì)稻草木質(zhì)素腐解及腐殖質(zhì)組成的影響

白成鑫 高嘉聰 曾檬 趙泓博 趙鑫 王帥 王楠

（1吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，吉林 吉林 132101；2 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；第一作者：baichengxin123@126.com；*通信作者：wangnan664806@126.com）

稻草是水稻規(guī)模化生產(chǎn)的副產(chǎn)物，占農(nóng)作物秸稈總產(chǎn)量的30%~40%[1]。稻草還田可改善土壤肥力，增加土壤孔隙，減少稻草因焚燒而引發(fā)的環(huán)境污染。在眾多還田方式中，稻草腐解再還田被視作是理想的方式。一般情況下，在東北地區(qū)水稻收獲后就已進(jìn)入冬季，待春季轉(zhuǎn)暖后，距離插秧前較短的溫和期（3 月下旬至5 月中旬，4℃~15℃）是稻草腐解的關(guān)鍵時(shí)期，稻草本身木質(zhì)素含量較高且不易腐解，微生物在較短的自然溫和期往往不能完全腐解稻草。探索稻草腐解的促進(jìn)因素對(duì)于北方稻草離田腐解技術(shù)研究尤為關(guān)鍵。

稻草中木質(zhì)素含量約為4.83%。稻草中的木質(zhì)素成分是自然界中含量?jī)H次于纖維素和半纖維素的芳香族高分子聚合物，稻草腐解過(guò)程伴隨著木質(zhì)素的腐殖化，木質(zhì)素腐殖化的結(jié)果是產(chǎn)生腐殖質(zhì)（HS），但該過(guò)程往往既漫長(zhǎng)又復(fù)雜，是稻草腐解成功與否的關(guān)鍵，在生產(chǎn)上尋求能催化稻草腐解進(jìn)程的積極因素具有重要實(shí)踐指導(dǎo)意義。Maillard 反應(yīng)是Cat、Gly 和Glu 3 種前體物質(zhì)在δ-MnO2催化下進(jìn)行非生物縮合的腐殖化過(guò)程，通過(guò)在稻草腐解中額外添加，各物質(zhì)通過(guò)氧化與親核反應(yīng)能夠聚合形成類腐殖質(zhì)[2]，促進(jìn)稻草腐解。也就是說(shuō)，3 種Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)通過(guò)各類反應(yīng)能夠促進(jìn)稻草的腐殖化，其中，Glu 是微生物的直接供能物質(zhì)，能夠明顯增加微生物活性，促進(jìn)無(wú)機(jī)氮素固持、減少氮素流失，為菌絲體形成提供能量，促進(jìn)芳香環(huán)的分解[3]；Cat 依據(jù)多酚理論易被氧化成醌類直接參與HS 的形成；Gly 水解產(chǎn)生低分子量有機(jī)酸能夠?yàn)槎喾有纬商峁┗A(chǔ)材料，間接促進(jìn)HS 的形成。WU 等[4]研究認(rèn)為，在堆肥過(guò)程中，多酚、羧酸、氨基酸、還原糖和多糖5 種前體物質(zhì)可通過(guò)木質(zhì)素-蛋白質(zhì)途徑、多酚途徑和Maillard 反應(yīng)等機(jī)制促進(jìn)HS 的形成[5]。張雪辰等[6]通過(guò)向牛糞、菌糠和雞糞組成的共堆肥體系中添加含有激發(fā)自然界微生物快速繁殖營(yíng)養(yǎng)因子（速效碳源、氮源和微量元素）的發(fā)酵激發(fā)劑，驗(yàn)證了其能有效促進(jìn)堆肥有機(jī)碳礦化分解的結(jié)論。前體物質(zhì)是調(diào)控堆肥HS 形成的關(guān)鍵[7]。本研究采用室內(nèi)培養(yǎng)法，以稻草為基礎(chǔ)材料，通過(guò)上述3 種Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)的外源加入，從腐殖質(zhì)組成角度揭示各前體物質(zhì)在稻草腐解過(guò)程中的貢獻(xiàn)，為稻草高效腐解提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

稻草取自吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院北大地水稻試驗(yàn)田，經(jīng)風(fēng)干、粉碎過(guò)0.25 mm 孔徑篩備用，其總有機(jī)碳、N、P2O5和K2O 含量分別為37.8%、1.93%、2.33%和0.76%。

微生物菌劑制備：稱取天津環(huán)微生物科技有限公司出品的秸稈腐熟劑（有效活菌數(shù)≥200 億cfu/g）1 g于100 mL 無(wú)菌水中，在28 ℃氣浴振蕩器中以120 r/min 的轉(zhuǎn)數(shù)振蕩提取2 h，靜止沉降30 min 后以3 500 r/min 的轉(zhuǎn)數(shù)離心15 min，收集上清液，其中活菌數(shù)≥1.8×108個(gè)/mL，主要包括木霉菌、芽孢桿菌、放線菌、假單胞菌、乳酸菌和酵母菌等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021 年5 月進(jìn)行，采用室內(nèi)培養(yǎng)法，準(zhǔn)確稱取12.0 g 稻草粉末于100 mL 三角瓶中，用一定濃度的（NH4）2SO4溶液調(diào)節(jié)稻草粉末含水量60%和C/N 比為25∶1。試驗(yàn)共設(shè)3 個(gè)處理，分別在裝有稻草粉末的三角瓶中添加5 mL 0.12 mol/L 的鄰苯二酚（Catechol）、葡萄糖（Glucose）和甘氨酸（Glycine），以添加等體積的蒸餾水為對(duì)照，分別用Cat、Glu、Gly 和CK 表示，每個(gè)處理在各培養(yǎng)時(shí)間下均重復(fù)3 次、設(shè)置3 個(gè)瓶，用無(wú)菌透氣膜封口，將上述處理對(duì)應(yīng)的三角瓶置于121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min，待冷卻至常溫后，在無(wú)菌操作條件下接種10 mL 微生物菌劑，再次用無(wú)菌透氣膜封口，啟動(dòng)28 ℃的恒溫好氧培養(yǎng)，期間按恒重標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)態(tài)補(bǔ)水，使含水量始終穩(wěn)定在60%，在培養(yǎng)0、45 和90 d時(shí)動(dòng)態(tài)取樣，取樣后立即轉(zhuǎn)入50 ℃鼓風(fēng)干燥箱中風(fēng)干來(lái)終止微生物反應(yīng)，磨細(xì)過(guò)0.25 mm 孔徑篩，備用。

1.3 測(cè)試指標(biāo)及方法

在Kumada 方法上作修訂進(jìn)行腐殖質(zhì)組成分析[8]。稱取1.0 g 稻草粉末于100 mL 聚乙烯離心管中，加入30 mL 蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，?0 ℃恒溫水浴振蕩器中提取1 h，離心（3 500 r/min，15 min），吸取上清液于50 mL容量瓶中，之后在含有殘?jiān)碾x心管中繼續(xù)加20 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍? 500 r/min 離心15 min，將此次上清液與前次合并，用蒸餾水定容，所獲溶液即為水溶性物質(zhì)（water soluble substance，WSS）；在此前的殘?jiān)屑尤?.1 mol/L NaOH 和0.1 mol/L Na2P2O7的混合液，于3 500 r/min 離心15 min，按上述步驟對(duì)殘?jiān)M(jìn)行二次提取，獲得的上清溶液為可提取腐殖酸（humic-extracted acid，HE）；離心管中殘?jiān)谜麴s水多次洗滌、離心，直至洗液近中性，將其轉(zhuǎn)入50 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘至質(zhì)量恒定，該沉淀即為胡敏素（humin，Hu）。

吸取30 mL HE 溶液，用0.5 mol/L 的H2SO4將其pH 調(diào)至1.0~1.5，置于70 ℃水浴鍋中保溫1.5 h，靜置過(guò)夜，出現(xiàn)絮狀沉淀，次日將含有沉淀的溶液過(guò)濾于50 mL 容量瓶中并定容，此溶液為富里酸（fulvic acid，F(xiàn)A）；用稀酸淋洗濾紙上的沉淀，再用0.05 mol/L 溫?zé)岬腘aOH 將沉淀溶解于50 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，獲得胡敏酸（Humic acid，HA）堿溶液，采用外加熱-重鉻酸鉀氧化法測(cè)定總有機(jī)碳（TOC）含量及WSS、HE、HA 和Hu 組 分 的 有 機(jī) 碳 含 量（CWSS、CHE、CHA和CHu），差減法（CHE-CHA）計(jì)算FA 組分的碳含量（CFA）并由此計(jì)算胡富比（HA 組分有機(jī)碳含量與FA 組分有機(jī)碳含量之比，CHA/CFA）；采用北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)的TU-1901 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定HE 堿溶液的400 nm 和600 nm 處的光密度（A400nm和A600nm），計(jì)算色調(diào)系數(shù)（△lgK=lgA400nm-lgA600nm）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并繪圖，用SPSS 18.0（PASW Statistics 18）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)稻草腐解進(jìn)程總有機(jī)碳（TOC）含量的影響

由圖1 可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Cat、Glu、Gly和CK 的TOC 含量均呈降低趨勢(shì)。與0 d 相比，培養(yǎng)90 d 后，Cat、Glu、Gly 和CK 處理下的TOC 含量分別降低了17.8%、22.9%、18.0%和13.3%。與CK 相比，添加Maillard 反應(yīng)底物的3 個(gè)處理對(duì)TOC 礦化分解作用均有所促進(jìn)，其中，Glu 的作用最為顯著。

圖1 添加Cat、Glu 和Gly 對(duì)稻草腐解進(jìn)程TOC 含量的影響

2.2 對(duì)稻草腐解進(jìn)程可提取腐殖酸碳（CHE）含量及HE堿溶液△logK 的影響

如圖2 所示，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，不同處理的CHE含量呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，Cat 處理的CHE含量隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，而Glu、Gly 處理和CK 的CHE則表現(xiàn)為先升高后下降。與0 d 相比，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)（90 d），Cat、Glu、Gly 處 理 和CK 的CHE含 量 分 別 增 加 了475.4%、456.8%、397.5%和386.5%，Cat 處理CHE的增幅最大，其次為Glu 處理。

圖2 添加Cat、Glu 和Gly 對(duì)稻草腐解進(jìn)程CHE 含量的影響

如圖3 所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各處理HE 堿溶液△lgK 均表現(xiàn)為漸趨降低趨勢(shì)，其中添加Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)的3 個(gè)處理歷經(jīng)45 d 和90 d 的培養(yǎng)結(jié)果無(wú)顯著差異，更有利于培養(yǎng)中后期HE 分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。與0 d 相比，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)（90 d）Cat、Glu、Gly 處理和CK 的HE 堿溶液△lgK 分別降低10.0%、12.9%、30.2%和19.1%，降幅最大的是Gly 處理，即添加Gly 更有利于提升稻草腐解后HE 分子的復(fù)雜化。

圖3 添加Cat、Glu 和Gly 對(duì)稻草腐解進(jìn)程HE 堿溶液△lgK的影響

2.3 對(duì)稻草腐解進(jìn)程胡敏酸碳（CHA）含量的影響

如圖4 所示，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，除了Gly 處理使稻草腐解進(jìn)程CHA先增加后略有降低外，其余各處理的CHA含量均逐漸升高。與0 d 相比，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)（90 d），Cat、Glu、Gly 處 理 和CK 的CHA含 量 分 別 增 加 了461.4%、657.1%、493.8%、281.8%，相比CK，添加3 種Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)均使CHA含量不同程度提升，其中，添加Glu 增幅最大。

圖4 添加Cat、Glu 和Gly 對(duì)稻草腐解進(jìn)程CHA 含量的影響

2.4 對(duì)稻草腐解進(jìn)程CHA/CFA 的影響

作為評(píng)價(jià)腐殖質(zhì)品質(zhì)的重要指標(biāo)，CHA/CFA值越大表明腐殖質(zhì)品質(zhì)越好。由圖5 可見(jiàn)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各處理和CK 的CHA/CFA均表現(xiàn)為漸趨增高趨勢(shì)。與0 d相比，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)（90 d），Cat、Glu、Gly 處理和CK 的CHA/CFA分別增加151.6%、412.4%、312.4%和87.0%?？梢?jiàn)，添加3 種Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)均能使CHA/CFA獲得比CK 更大幅度的提升，相比之下，添加Glu 在改善腐殖質(zhì)品質(zhì)方面更有優(yōu)勢(shì)。

圖5 添加Cat、Glu 和Gly 對(duì)稻草腐解進(jìn)程CHA/CFA 的影響

3 討論

在本試驗(yàn)條件下，無(wú)論是否添加Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)，稻草腐解過(guò)程均伴隨著礦化的進(jìn)行，TOC 含量漸趨降低。添加Cat、Glu 和Gly 促進(jìn)了微生物對(duì)稻草的礦化分解，使TOC 含量下降幅度顯著高于CK，添加Glu 降幅最大，下降了22.9%。Glu 和Gly 均為水溶性物質(zhì)，前者為分子量較小的醛糖，空間位阻小，被視作HS 形成的主要貢獻(xiàn)者[4]，而后者為結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的小分子氨基酸，既能作為微生物的氮源，又能成為不穩(wěn)定的碳底物[3]，被微生物直接利用并合成自身生命體的能源物質(zhì)。兩者均能有效提高微生物多樣性，促進(jìn)微生物對(duì)稻草的礦化作用。Cat 是一種強(qiáng)還原劑，易被氧化成鄰苯醌，屬芳香族化合物，化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，微生物利用難度大于Glu 和Gly，但與稻草中的木質(zhì)素相比，Cat 也可在一定程度上充當(dāng)能源物質(zhì)供微生物利用。劉娜等[9]研究指出，特定菌株在2 d 內(nèi)對(duì)濃度低于700 mg/L Cat的降解率可高達(dá)90%，微生物通過(guò)酶催化、酶促反應(yīng)和三羧酸循環(huán)，最終使Cat 降解為H2O 和CO2[10]?？梢?jiàn)，外源添加的3 種Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)均可作為底物提升微生物活性，促進(jìn)微生物對(duì)稻草的礦化作用。

HE 是堆肥過(guò)程產(chǎn)生的次生產(chǎn)物[11]，CHE含量可作為堆肥腐熟度評(píng)價(jià)及其農(nóng)用效果的重要指標(biāo)。與0 d相比，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)（90 d），Cat、Glu、Gly 處理和CK 的CHE含量分別增加475.4%、456.8%、397.5%和386.5%。可見(jiàn)，與CK 相比，外源添加3 種Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)均可顯著提高CHE含量。木質(zhì)素-蛋白質(zhì)理論和多酚-蛋白質(zhì)理論涉及多酚和氨基酸之間的縮聚反應(yīng)，是自然界中重要的腐殖化途徑[4]，是鄰苯二酚和甘氨酸能夠?qū)E 形成有促進(jìn)作用的重要依據(jù)。此外，微生物借助外部添加的鄰苯二酚、葡萄糖和甘氨酸來(lái)腐解稻草，礦化作用的加劇使更多的稻草分解產(chǎn)物（芳香碳、羧基碳及羰基碳）被釋放，為提升腐殖化作用創(chuàng)造了物質(zhì)條件。Cat 屬酚類物質(zhì)，在多酚-蛋白質(zhì)理論中，酚類是構(gòu)成腐殖質(zhì)分子核的關(guān)鍵成分[12]，促進(jìn)生成HE。Glu 和Gly 是腐殖化作用的重要前體物質(zhì)，且本身可以被微生物利用，最終以菌體的形式進(jìn)入HE 使CHE含量升高。HE 堿溶液的色調(diào)系數(shù)（△lgK）可反映其分子的復(fù)雜程度，該值越大表明HE 分子結(jié)構(gòu)越簡(jiǎn)單[13]。結(jié)合HE 堿溶液△lgK 的降低可以判斷，不論是否添加Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)，稻草經(jīng)腐解后HE 分子結(jié)構(gòu)都更加復(fù)雜，盡管如此，添加Glu 和Cat 對(duì)稻草腐解過(guò)程HE 分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜化程度不如CK，分析原因如下：微生物利用Glu 可使菌體中多糖含量增多、飽和度增高，同時(shí)合成了更多長(zhǎng)鏈脂肪烴和不飽和碳鏈[14]，上述物質(zhì)進(jìn)入HE組分使其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度低于CK；Cat 具有一定的生物毒性和強(qiáng)還原性，一定程度上不利于稻草木質(zhì)素的氧化降解，干擾了微生物代謝[15]，限制了一部分芳香族產(chǎn)物進(jìn)入HE，故而使HE 分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜化程度低于CK，甚至有報(bào)道指出，Maillard 反應(yīng)還解釋了在多糖、還原糖和氨基酸參與，而多酚缺失的環(huán)境中仍然有HS 形成的現(xiàn)象[5]。Gly 的添加使培養(yǎng)體系過(guò)氧化氫酶活性增加[3]，提高了微生物對(duì)稻草木質(zhì)素的氧化降解[16]，因此使HE 分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度顯著高于CK。

HA 作為腐殖質(zhì)中的活躍物質(zhì)[17]，具有疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，富含羧基、羥基、甲氧基和氨基[18]。在本試驗(yàn)中，無(wú)論添加Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)與否，經(jīng)培養(yǎng)后稻草CHA含量均不同程度提高，其中3 種Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)處理下的CHA含量的增幅高于CK。分析其原因如下：Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)的添加可極大提高微生物對(duì)稻草降解后的腐殖化作用，使縮合產(chǎn)物進(jìn)入HA 組分，進(jìn)而使CHA含量提升幅度高于CK，其中Glu 的促進(jìn)作用最為顯著。在稻草腐解過(guò)程，為了充分表征腐殖質(zhì)品質(zhì)的變化，用CHA/CFA來(lái)描述HA 與FA 間轉(zhuǎn)化的相對(duì)速度[7]。添加3 種Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)及CK 處理下的FA 的形成速率小于HA，總體表現(xiàn)為FA 逐漸向HA 轉(zhuǎn)化?？膳袛啵静萃瓿筛夂?，無(wú)論是否添加Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)，腐殖質(zhì)品質(zhì)均獲不同程度提高，與STEVENSON[19]報(bào)道一致，即前體物質(zhì)參與HS 的形成可增加其芳香性，使稻草腐解后的腐殖質(zhì)品質(zhì)顯著高于CK，其中添加Glu 在改善腐殖質(zhì)品質(zhì)方面更有優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié)論

隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，Cat、Glu、Gly 處理和CK 的TOC 含量均呈漸趨降低趨勢(shì)，添加3 種Maillard 反應(yīng)底物對(duì)TOC 礦化作用均有所促進(jìn)，其中，Glu 的作用最為顯著，使TOC 含量下降22.9%；歷經(jīng)培養(yǎng)，各處理均有利于CHE的增加并促進(jìn)HE 分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜化，Cat 的添加使CHE獲得最大幅度提高（475.4%），其次為Glu，Gly 的添加使HE 分子復(fù)雜程度達(dá)到最高；添加3 種Maillard 反應(yīng)前體物質(zhì)能夠使CHA含量獲得提高且改善腐殖質(zhì)品質(zhì)，相比之下，Glu 在提高CHA含量及改善腐殖質(zhì)品質(zhì)方面更勝一籌。綜上，Glu 在促進(jìn)稻草礦化分解、提升稻草腐解進(jìn)程CHA含量、改善腐殖質(zhì)品質(zhì)方面更有優(yōu)勢(shì)，Cat 更有利于CHE含量的提升，而Gly 則更易促進(jìn)HE 分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜化。