一株高效降解血液蛋白的枯草芽孢桿菌NWMCC0137全基因組測序及分析

劉高強(qiáng) 李新鵬 劉文釗 周魏 彭喬烽 周雪雁 默罕默德?索布瑞?塔克瑞夫 丁功濤

摘要： NWMCC0137是從屠宰場下水道污泥中分離獲得的1株高效分解血液蛋白并具有良好生物防控特性的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。為探究枯草芽孢桿菌NWMCC0137（B.subtilis NWMCC0137）高效水解血液蛋白機(jī)制及挖掘次級代謝產(chǎn)物編碼基因資源，利用DNBSEQ與PacBio測序平臺對其進(jìn)行全基因組測序并進(jìn)行序列組裝和基因預(yù)測、功能注釋、比較基因組分析。結(jié)果表明B.subtilis NWMCC0137的基因組長度為4 215 585 bp，G+C含量為44.23%；編碼基因總長度為3 711 885 bp，編碼4 384個(gè)基因，編碼序列占整個(gè)基因組長度的88.05%，非編碼RNA中包含85個(gè)tRNA基因。在KEGG數(shù)據(jù)庫中B.subtilis NWMCC0137基因組被注釋到7種胞外蛋白酶編碼基因，其中與絲氨酸蛋白酶相關(guān)的編碼基因有8個(gè)。通過antiSMASH預(yù)測發(fā)現(xiàn)，菌株NWMCC0137基因組中包含7種與已知次生代謝產(chǎn)物合成基因簇相似度為100%的基因簇，包括產(chǎn)孢致死因子、聚酮類化合物、豐原素、枯草芽孢桿菌素168、兒茶酚型嗜鐵素、芽孢桿菌素、桿菌溶素合成基因簇。進(jìn)化分析結(jié)果表明，NWMCC0137為枯草芽孢桿菌，并且與枯草芽孢桿菌168具有很高的共線性。B.subtilis NWMCC0137基因組序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為CP103066。本研究從基因?qū)用娼沂玖司闚WMCC0137的遺傳信息，為該菌株應(yīng)用于屠宰場血液蛋白降解及生物防控提供了參考。

關(guān)鍵詞： 枯草芽孢桿菌；全基因組；基因功能注釋；蛋白酶

中圖分類號： Q934.124?? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A?? 文章編號： 1000-4440（2023）07-1460-12

Whole genome?; sequencing and analysis of Bacillus subtilis NWMCC0137， an efficient blood protein degrading strain

LIU Gao-qiang1，2， LI Xin-peng1，3， LIU Wen-zhao1，2， ZHOU Wei1，2， PENG Qiao-feng1，2， ZHOU Xue-yan1，2， MOHAMMED Sobri-takriff4， DING Gong-tao1

（1.China-Malaysia National Joint Laboratory， Biomedical Research Center， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030， China；2.College of Life Sciences and Engineering， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030， China；3.College of Chemical Engineering， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030， China；4.Department of Chemical and Process Engineering， Faculty of Engineering and Built Environment University Kebangsaan Malaysia， Bangi 43600， Malaysia）

Abstract： NWMCC0137 is a Bacillus subtilis strain isolated from sewage sludge in slaughterhouses， which efficiently decomposes blood proteins and has good biological control characteristics. In order to explore the mechanism of efficient hydrolysis of blood protein by Bacillus subtilis NWMCC0137 and explore the gene resources encoded by secondary metabolites， DNBSEQ and PacBio sequencing platforms were used to sequence the whole genome， and sequence assembly， gene prediction， functional annotation and comparative genome analysis were carried out. The results showed that the genome length of Bacillus subtilis NWMCC0137 was 4 215 585 bp， and the G+C content was 44.23%. The total length of the coding gene was 3 711 885 bp， encoding 4 384 genes， accounting for 88.05% of the entire genome length. The non-coding RNA contained 85 tRNA genes. In KEGG database， Bacillus subtilis NWMCC0137 genome was annotated to seven extracellular protease coding genes， including eight coding genes related to serine protease. According to the prediction of antiSMASH， the genome of strain NWMCC0137 contained seven gene clusters with 100% similarity to the known secondary metabolite synthesis gene clusters， including sporulation killing factor， bacillaene， fengycin， sublancin 168， bacillibactin， subtilosin A and bacilysin gene clusters. The evolutionary analysis results indicated that NWMCC0137 was a Bacillus subtilis and had high collinearity with Bacillus subtilis 168. The genome sequence of Bacillus subtilis NWMCC0137 had been submitted to the GenBank database with accession number CP103066. This study revealed the genetic information of strain NWMCC0137 at the genetic level， providing a reference for its application in degrading blood proteins and biological prevention and control.

Key words： Bacillus subtilis；whole genome；gene function annotation；protease

血液中蛋白質(zhì)含量為20%，動物屠宰后血液中的蛋白質(zhì)資源[1]只有少部分能被利用，大多數(shù)血液未能被妥善處理。這不僅造成資源浪費(fèi)，還會引起水土污染甚至是動物疾病[2]。提高動物屠宰血液利用率和廢棄血液的資源化利用，是目前亟待解決的問題。目前國內(nèi)外廢棄血液利用方式主要有飼料化、能源化、食品化、藥品化、肥料化等[3]。在飼料化和肥料化利用中，酶解和微生物發(fā)酵是重要的處理方式。酶解法對環(huán)境影響小，可以有效抑制毒物的生成[4]；與酶解法相比，微生物發(fā)酵的處理方式具有成本低、產(chǎn)酶種類豐富、操作簡單等優(yōu)勢[5-6]。

目前微生物發(fā)酵所用的菌種有芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌[7]等。龐偉[8]利用枯草芽孢桿菌對血粉發(fā)酵，檢測結(jié)果顯示，發(fā)酵后蛋白質(zhì)最大水解度為32.30%，發(fā)酵產(chǎn)物中氨基酸含量是原來的4.44倍，可溶性蛋白質(zhì)含量提高了53.77%。陶艷華等[9]和Yao等[10]均采用短小芽孢桿菌發(fā)酵，發(fā)酵后血紅蛋白降解率分別達(dá)到53.64%和85.00%。崔瑋琪等[11]篩選得到菌株X-17，以豬血作為唯一氮源發(fā)酵，經(jīng)優(yōu)化后血液蛋白水解度達(dá)到18.52%，可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到2.75 mg/ml。有研究結(jié)果表明，菌株對蛋白質(zhì)的降解率受血液占比影響較大，血液在發(fā)酵底物中的占比低于10%時(shí)，菌株對血液蛋白降解率較高[12]，血液在發(fā)酵底物中的占比高于10%時(shí)，降解率明顯降低。Zhang等[13]使用重組酵母菌發(fā)酵血液，血液在發(fā)酵底物中的占比為3.2%時(shí)，蛋白質(zhì)降解率為49.0%。而馬子豪等[14]發(fā)現(xiàn)，血液在發(fā)酵底物中的占比為30%時(shí)，蛋白質(zhì)降解率只有9.86%。本試驗(yàn)前期使用枯草芽孢桿菌NWMCC0137，在動物屠宰血液占發(fā)酵底物90.0%情況下，血液中蛋白質(zhì)水解率仍有17.6%，多肽含量為15.16 mg/ml，具有較高的水解效率，表明菌株NWMCC0137在動物屠宰血液再利用方面有著較好的潛力。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種重要的工業(yè)微生物[15]。研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生至少8種胞外或細(xì)胞壁相關(guān)蛋白酶[16]、纖維素酶、木聚糖酶[17]以及聚酮類化合物、細(xì)菌素等多種抗菌物質(zhì)[18]，還具有促進(jìn)養(yǎng)殖動物生長、降解環(huán)境廢棄物、凈化水質(zhì)等作用[19]。為探究菌株NWMCC0137對血液中蛋白質(zhì)降解的作用機(jī)制，通過DNBSEQ平臺與第三代測序技術(shù)PacBio測序平臺對其進(jìn)行全基因組測序，在獲得基因序列的基礎(chǔ)上，利用GO、COG、KEGG、CAZy等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋。并通過比較基因組學(xué)更好地了解菌株NWMCC0137分類地位及其與其他枯草芽孢桿菌的差異性，揭示其高效降解屠宰動物血液蛋白的作用機(jī)制，為后期的生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 本試驗(yàn)使用的菌株為B.subtilis NWMCC0137，由課題組前期分離所得。保存于西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心中國-馬來西亞國家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 相關(guān)試劑 LB培養(yǎng)基：瓊脂粉18.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH值7.4（所用培養(yǎng)基中試劑均為分析純）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，TaKaRa公司產(chǎn)品）。

1.2 方法

1.2.1 菌株基因組的提取及測序 將菌株在LB固體培養(yǎng)基復(fù)蘇培養(yǎng)24 h，取單菌落接入LB液體培養(yǎng)基，于30 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取全基因組DNA。提取的DNA經(jīng)檢測符合條件后送至深圳華大基因股份有限公司通過第二代DNBSEQ平臺與第三代PacBio平臺進(jìn)行基因組測序。

1.2.2 基因組組分與功能分析 使用SMRT Link V5.0.1軟件（https：//www.pacb.com/support/software-downloads/）進(jìn)行數(shù)據(jù)組裝。使用Glimmer（V3.02）軟件（http：//www.cbcb.umd.edu/software/glimmer/）[20]預(yù)測編碼基因。利用RNAmmer（V1.2）軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/RNAmmer/）預(yù)測rRNA[21]，利用tRNAscan-SE（V1.3.1）軟件預(yù)測tRNA[22]，并與Rfam（V9.1）數(shù)據(jù)庫（http：//rfam.sanger.ac.uk/）比對得到sRNA[23]；使用CRISPR CasFinder軟件（V4.2.19）識別CRISPRs，得到DRs和Spacers；使用Tandem Repeat Finder（V4.04）軟件[24]預(yù)測串聯(lián)重復(fù)序列，根據(jù)重復(fù)單元長度及數(shù)目篩選出其中的微衛(wèi)星以及小衛(wèi)星序列，軟件的參數(shù)設(shè)置為：2778010502000-d-h。Tandem Repeat Finder查找算法是一個(gè)兩階段查找算法，由檢測階段和分析階段兩部分組成，算法首先會基于重復(fù)片段的概率模型的統(tǒng)計(jì)信息對序列進(jìn)行檢測并得到可能滿足條件的候選重復(fù)片段，之后通過對候選結(jié)果的分析和篩選得到最終的查找結(jié)果。并且Tandem Repeat Finder查找算法不需要預(yù)先知道任何如模式組成、模式長度、模式重復(fù)次數(shù)等關(guān)于模式的已知信息，運(yùn)行速度快、耗時(shí)少、重復(fù)序列準(zhǔn)確，能夠滿足數(shù)據(jù)分析的要求。

基因功能注釋使用Diamond軟件與Gene Ontology（GO）、Cluster of Orthologous Groups of proteins（COG）、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）、Carbohydrate-Active Enzymes Database（CAZy）等數(shù)據(jù)庫對比得到對應(yīng)的功能注釋信息。

1.2.3 比較基因組分析 利用Ortho Finder（v2.2.6，Genome Biology 2019，https：//github.com/davidemms/OrthoFinder）和參考基因組（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）找出多個(gè)同源基因，通過Ortho Finder軟件默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中進(jìn)化樹可視化采用的是Mega最大簡約法模型，參數(shù)為默認(rèn)。使用MUMmer軟件（V3.22）進(jìn)行共線性分析。通過antiSMASH version（V6.1.1，secondarymetabolites.org）對菌株NWMCC0137進(jìn)行次級代謝產(chǎn)物預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.subtilis NWMCC0137全基因組概況

B.subtilis NWMCC0137基因組長度為4 215 585 bp，G+C含量為44.23%，無質(zhì)粒?；蚪M共有4 384個(gè)編碼基因，編碼基因總長度為3 711 885 bp，平均長度846.69 bp，占基因組的88.05%。串聯(lián)重復(fù)序列（Tandem repeat，TR）55個(gè)，重復(fù)序列單元大小為12～253 bp，總長度4 141 bp，占基因組的0.0982%。小衛(wèi)星DNA（Minisatellite DNA）42個(gè)，單元大小為15～60 bp，總長度2 458 bp，占基因組的0.0583%。將NWMCC0137基因組完整測序數(shù)據(jù)提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為CP103066。將B. subtilis NWMCC0137與另外2株枯草芽孢桿菌進(jìn)行差異性比較分析結(jié)果（表1）表明，NWMCC0137與B. subtilis 168的基因組長度和G+C含量占比都很接近，但NWMCC0137的編碼基因數(shù)卻比B.subtilis 168多142個(gè)。B.subtilis N2-10[25]（GenBank登錄號CP098417）的基因組長度小于NWMCC0137，菌株NWMCC0137的G+C含量占比也大于B.subtilis N2-10。

2.2 B.subtilis NWMCC0137基因組組分分析

非編碼RNA（ncRNA）是一類可直接在RNA水平對生命活動發(fā)揮作用的RNA分子。NWMCC0137基因組含tRNA、rRNA、sRNA 3種非編碼RNA，其中tRNA 85個(gè)，5s rRNA、16s rRNA及23s rRNA均為10個(gè)，sRNA 34個(gè)。B.subtilis NWMCC0137的基因組圈圖如圖1所示。由于DNA單鏈中G與C含量不一定相同，單鏈中G與C含量的偏移稱為GC-Skew，因此第8圈的GC-Skew值是用來衡量在DNA單鏈中堿基G和C相對含量的不同。GC-Skew+表示G含量大于C，GC-Skew-表示G含量小于C。DNA復(fù)制中的前導(dǎo)鏈（Leading strand）富含G和T，而滯后鏈（Lagging strand）中的A和C偏多，表現(xiàn)出堿基組成上的不對稱性。因此從復(fù)制起點(diǎn)延伸的前導(dǎo)鏈中是GC-Skew+，而在滯后鏈中為GC-Skew-。

2.3 B.subtilis NWMCC0137基因功能分析

將全基因組數(shù)據(jù)與GO、KEGG和COG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋。B.subtilis NWMCC0137基因組中被注釋到GO數(shù)據(jù)庫的基因數(shù)目為2 555個(gè)（58.28%），被注釋到COG的基因數(shù)目為3 207個(gè)（73.15%），KEEG數(shù)據(jù)庫中被注釋到有具體Pathway的基因數(shù)目為2 609個(gè)（59.51%），NR數(shù)據(jù)庫中被注釋到的基因數(shù)目為4 381個(gè)（99.93%），CAZy數(shù)據(jù)庫中被注釋到的基因數(shù)目為152個(gè)（3.46%），VFDB數(shù)據(jù)庫中被注釋到的基因數(shù)目為206個(gè)（4.69%）。

2.3.1 GO數(shù)據(jù)庫注釋 B.subtilis NWMCC0137基因功能GO數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果如圖2所示，基因被注釋到與生物過程相關(guān)的類別最多，有19種，前3種分別是細(xì)胞過程（1 407個(gè)基因）、代謝過程（1 347個(gè)基因）和定位（387個(gè)基因）?；虮蛔⑨尩脚c分子功能相關(guān)的類別有12種，基因數(shù)量最多的前兩類是催化活性和結(jié)合。細(xì)胞組分中與細(xì)胞組織相關(guān)的功能注釋基因最多，為716個(gè)。GO數(shù)據(jù)庫中還注釋到抗逆性相關(guān)的基因，如孢子形成（GO：0043934）、萌發(fā)（GO：0030435）；此外，菌株還含有嗜鐵素生物合成基因（GO：0019290）。GO數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果表明，該菌株不僅在代謝過程中結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)和催化等方面具有較強(qiáng)能力，還具有抗逆、抗真菌等特性。

2.3.2 COG數(shù)據(jù)庫注釋 根據(jù)B.subtilis NWMCC0137基因功能的COG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果（圖3），其中參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝的基因有329個(gè)；關(guān)于碳水化合物的運(yùn)輸和代謝的基因，有327個(gè)；與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的有330個(gè)基因。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)有232個(gè)基因與細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的生物反應(yīng)有關(guān)，說明菌株具有較強(qiáng)的生成細(xì)胞膜的能力。還有102個(gè)基因與防御機(jī)制有關(guān)，這些基因保障了菌株在復(fù)雜環(huán)境中的生存能力，使菌株能夠在下水道污泥中存活。在COG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果中，菌株NWMCC0137的基因功能主要被注釋到氨基酸、碳水化合物、無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝3個(gè)途徑。

2.3.3 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋 B.subtilis NWMCC0137基因組與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，共有2 609個(gè)基因分別在6大功能42個(gè)通路上得到功能注釋（圖4）。在新陳代謝方面被功能注釋的基因最多，有1 710個(gè)基因。12個(gè)代謝通路中，與碳水化合物代謝相關(guān)的基因有285個(gè)，與氨基酸代謝相關(guān)的基因有227個(gè)。還有331個(gè)基因在環(huán)境信息處理上得到功能注釋，其中與膜運(yùn)輸相關(guān)的基因有187個(gè)，與信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因有143個(gè)。在KEGG數(shù)據(jù)庫中，被注釋到的數(shù)量最多的是與碳水化合物代謝相關(guān)的基因，其次是與氨基酸代謝相關(guān)的基因，還注釋到44個(gè)與萜類和聚酮類化合物代謝相關(guān)的基因。這些基因控制著表面活性素生物合成以及豐原素合成。其中與表面活性素（Surfactin family）相關(guān)的基因有3個(gè)，分別為srfAA（GL000364）、srfAB（GL000365）、srfAC （GL000366）；與豐原素（Fengycin family ）相關(guān)的基因有6個(gè)，分別為ppsA（GL001976）、ppsB（GL001975）、ppsC （GL001973）、ppsD（GL001972、GL001974）、ppsE（GL001971）。

根據(jù)前期研究結(jié)果，菌株NWMCC0137所產(chǎn)的中性蛋白酶具有半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶的性質(zhì)，可裂解大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，使之成為小分子寡肽[26]，在水解反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。通過NWMCC0137基因組與KEGG數(shù)據(jù)庫比對分析可得，NWMCC0137基因組中包括枯草桿菌蛋白酶AprE（GL001852，EC 3.4.21.62）、中性金屬蛋白酶NprE（GL001588，EC 3.4.24.28）、絲氨酸蛋白酶Epr（GL004096，EC 3.4.21.-）和Vpr（GL004062，EC 3.4.21.-）、桿狀肽酶F（Bpr， GL001652，EC 3.4.21.-）、中性蛋白酶B（NprB， GL001176，EC 3.4.24.-）、細(xì)胞壁相關(guān)蛋白酶 （WprA，GL001142，EC 3.4.21.-）編碼基因。其中編碼絲氨酸蛋白酶的基因有8個(gè)（表2），分別是絲氨酸蛋白酶Do（Serine protease Do）、主要細(xì)胞內(nèi)絲氨酸蛋白酶（Major intracellular serine protease）、絲氨酸蛋白酶AprX（Serine protease AprX）、膜結(jié)合絲氨酸蛋白酶ClpP類（Membrane-bound serine protease）、絲氨酸蛋白酶（Serine protease）、微量細(xì)胞外絲氨酸蛋白酶Vpr（Minor extracellular serine protease Vpr）。推斷這些基因是枯草芽孢桿菌NWMCC0137高效降解屠宰動物血液蛋白的基礎(chǔ)。

2.3.4 碳水化合物相關(guān)酶（CAZy）基因數(shù)據(jù)庫注釋 將B.subtilis NWMCC0137的基因組序列與碳水化合物相關(guān)酶數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋比對，注釋結(jié)果顯示，編碼CAZy的基因有152個(gè)，占基因總數(shù)的3.46%。其中，NWMCC0137基因組中有68個(gè)糖苷水解酶（GHs）編碼基因、43個(gè)碳水化合物酶結(jié)合模塊（Carbohydrate-binding modules，CBMs）編碼基因、31個(gè)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs）基因、13個(gè)碳水化合物酯酶（CEs）編碼基因、7個(gè)多糖裂解酶（PLs）編碼基因、1個(gè)輔助活性酶（AAs）編碼基因。在碳水化合物酶結(jié)合模塊中α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）與分支酶（EC 2.4.1.18）具有最高的覆蓋度。在糖苷水解酶中，覆蓋度較高的有分支酶、幾丁質(zhì)酶（EC 3.2.1.14）、β-1，4-木聚糖內(nèi)切酶（EC 3.2.1.8）、雙功能胞壁酰胺酶DD內(nèi)肽酶（EC 3.2.1.17）、G型溶菌酶（EC 3.2.1.17）。這些酶在菌株生長代謝過程中發(fā)揮著重要作用。菌株NWMCC0137基因組中還含有內(nèi)切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）、β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）等酶的編碼基因，從基因?qū)用孢M(jìn)一步了解了菌株NWMCC0137在碳水化合物代謝中的潛力。

2.4 系統(tǒng)發(fā)生分析與共線性分析

根據(jù)全基因組序列，使用TreeBeST軟件對B.subtilis 168、B.subtilis NWMCC0137、B.subtilis ATCC 11774、B.subtilis CGMCC2108、B.subtilis ATCC 21228、B. tequilensis EA-CB0015、B. velezensis JS25R構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖5）。從圖中可以看出B.subtilis NWMCC0137與枯草芽孢桿菌168聚合在同一分支，說明這兩者之間的進(jìn)化距離最為接近。

為研究B.subtilis NWMCC0137分別與B.subtilis 168、B.subtilis ATCC11774基因組的整體相似性，采用MUMmer 軟件對它們進(jìn)行共線性分析（圖6）。通過共線性分析，可以得到測序基因組與參考基因組之間遺傳基因變化情況，以及菌株基因組在進(jìn)化過程中發(fā)生的結(jié)構(gòu)性變異情況?？莶菅挎邨U菌B.subtilis NWMCC0137分別與B.subtilis 168、B.subtilis ATCC11774均具有良好的共線性，存在著大量同源性基因，說明菌株之間的進(jìn)化關(guān)系較近。而B.subtilis NWMCC0137與B.subtilis ATCC11774之間的遺傳差異較為明顯。

2.5 次級代謝產(chǎn)物合成基因注釋結(jié)果

通過antiSMASH 對菌株NWMCC0137進(jìn)行次級代謝產(chǎn)物合成基因注釋（表3）。該菌株共有13種次級代謝產(chǎn)物合成基因簇被注釋，其中包括非核糖體多肽類（NRPS）、萜烯（Terpene）、塞克肽類（Sactipeptide）、Transatpks、第三類聚酮合酶（T3PKS）、甘氨酸（Glycocin）、內(nèi)酯（Beta-lactone）、表肽（Epipeptide）、蘭提肽（Ranthipeptide）和CDPS基因簇。在已鑒定的基因簇類型中，基因簇相似性為100%的有產(chǎn)孢致死因子（Sporulation killing factor）、聚酮類化合物（Bacillaene）、豐原素（Fengycin）、枯草芽孢桿菌素168 （Sublancin 168）、兒茶酚型嗜鐵素（Bacillibactin）、芽孢桿菌素（Subtilosin A）、桿菌溶素（Bacilysin）合成基因簇。有3類基因簇未能注釋到明確的代謝產(chǎn)物。非核糖體多肽類（NRPS）基因簇與表面活性素（Surfactin）基因簇相似度為83%，表肽（Epipeptide）基因簇與泰藍(lán)抑素A（Thailanstatin A）基因簇相似度僅為10%，表明菌株NWMCC0137可能合成新的代謝產(chǎn)物。

3 討論

屠宰場廢棄動物血液不能得到價(jià)值化利用，導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)資源被浪費(fèi)。課題前期搜集到的B.subtilis NWMCC0137是產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)勢菌株，能夠有效將血液中的大分子蛋白質(zhì)分解為小分子多肽及氨基酸。由于傳統(tǒng)方法難以挖掘該菌產(chǎn)中性蛋白酶關(guān)鍵基因，因此對該菌進(jìn)行全基因組測序以挖掘其基因資源。

B.subtilis NWMCC0137基因組在GO數(shù)據(jù)庫中被注釋到與生物過程、分子功能有關(guān)的基因占比多，這些基因?qū)甑纳飳W(xué)過程影響較大。B.subtilis NWMCC0137基因組在COG數(shù)據(jù)庫中被注釋到與氨基酸、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝有關(guān)的基因較多。B.subtilis NWMCC0137基因組在KEGG數(shù)據(jù)庫中被注釋到與代謝途徑有關(guān)的基因最多，其中碳水化合物代謝與氨基酸代謝是被注釋到基因最多的兩種代謝途徑。3個(gè)數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果一致。KEGG數(shù)據(jù)庫中還注釋到B.subtilis NWMCC0137基因組中的7種胞外蛋白酶編碼基因，最主要的胞外蛋白酶是由AprE編碼的枯草桿菌蛋白酶和NprE編碼的中性金屬蛋白酶[27]，枯草桿菌蛋白酶可將環(huán)境中的不溶性蛋白質(zhì)降解為多種寡肽和氨基酸，以此來生產(chǎn)含氮化合物供細(xì)菌本體利用。此外絲氨酸蛋白酶Epr和Vpr、桿狀肽酶F、中性蛋白酶B、細(xì)胞壁相關(guān)蛋白酶WprA編碼基因，這些基因也是NWMCC0137能夠高效降解血液中蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)。而且前期研究結(jié)果表明，菌株NWMCC0137所產(chǎn)蛋白酶具有金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶的特性。菌株代謝產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶表明AprX基因也是影響芽孢桿菌屬產(chǎn)胞外蛋白酶的重要基因，因此NprE與AprX均是影響菌株NWMCC0137產(chǎn)酶的關(guān)鍵基因。賈仲昕等[28]在細(xì)菌生長的后期階段對蛋白酶基因的表達(dá)與產(chǎn)酶能力進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明除枯草桿菌蛋白酶AprE和中性金屬蛋白酶NprE編碼基因外，AprX也是影響芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)胞外蛋白酶能力的重要基因[29]。前人研究結(jié)果驗(yàn)證了本研究結(jié)果。此外，蛋白酶是一種誘導(dǎo)酶，在合成過程中受多方面因素的影響。在CAZy數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果中，菌株NWMCC0137含有許多與α-淀粉酶、β-1，4-木聚糖內(nèi)切酶、G型溶菌酶、幾丁質(zhì)酶、β-葡萄糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶相關(guān)的編碼基因。菌株NWMCC0137可產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶，內(nèi)切葡聚糖酶、β-1，4-木聚糖內(nèi)切酶等纖維素酶。動物飼料中含有大量的纖維素，纖維素?zé)o法被動物高效利用，枯草芽孢桿菌可作為添加劑應(yīng)用于飼料中[30]。將枯草芽孢桿菌混入飼料后，在微生物的分解作用下纖維素能夠被動物機(jī)體快速吸收，轉(zhuǎn)變?yōu)閯游锷L發(fā)育過程中的供能物質(zhì)，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的碳水化合物分解酶在這一過程中有著不可或缺的作用。G型溶菌酶不但具有廣譜抗菌作用，在抗病毒與抗腫瘤活性中也有廣泛的應(yīng)用[31]。此外還注釋到與幾丁質(zhì)酶等細(xì)胞壁降解酶相關(guān)的編碼基因，推測菌株NWMCC0137可通過降解病原真菌的細(xì)胞壁來抑制病原微生物的生命活動，從而完成抑菌作用。

在抗菌物質(zhì)合成方面，NWMCC0137菌株有13個(gè)合成基因簇，包括10個(gè)已知基因簇和3個(gè)未知基因簇，菌體在生長過程中可以產(chǎn)生枯草菌素、豐原素、桿菌溶素、表面活性素等活性物質(zhì)，在致病菌的防治中具有很大潛力。Bacillaene是一類能抑制蛋白質(zhì)合成的聚酮類化合物，因此對細(xì)菌和真菌均有良好的抑制作用。豐原素是一種具有很強(qiáng)抗真菌活性的環(huán)狀脂肽類物質(zhì)[32]。枯草芽孢桿菌素168是一類具有廣譜抗菌作用的抗菌肽，在寄生蟲防治方面具有突出作用[33]。兒茶酚型嗜鐵素是一種對鐵離子有高親和性的螯合劑，而鐵離子是病原菌生長過程中必不可少的元素，因此在兒茶酚型嗜鐵素的作用下致病菌的生長受到抑制[34]。還有研究結(jié)果表明，兒茶酚型嗜鐵素具有控制微生物間競爭的作用[35]。桿菌溶素是一類雙肽抗菌物質(zhì)，對真菌和細(xì)菌都表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑菌活性[36]。表面活性素是由芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的一種環(huán)脂肽類小分子活性物質(zhì)，不僅具有良好的抗菌、抗病毒活性[37]，還展現(xiàn)出了滅蚊活性[38]?？咕镔|(zhì)的存在也為菌株NWMCC0137在生物防治中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

通過GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫注釋，在B.subtilis NWMCC0137基因組中發(fā)現(xiàn)，與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝、轉(zhuǎn)錄代謝途徑有關(guān)的基因占比較多。在KEGG數(shù)據(jù)庫注釋中，還發(fā)現(xiàn)了7種蛋白酶編碼基因，而在CAZy數(shù)據(jù)庫注釋中，發(fā)現(xiàn)與碳水化合物降解、生物合成等途徑相關(guān)的編碼基因也十分豐富。推測這些酶的存在是菌株NWMCC0137能夠高效水解屠宰動物血液蛋白的內(nèi)在因素。表面活性素、豐原素、兒茶酚型嗜鐵素和桿菌溶素等次級代謝產(chǎn)物對致病菌具有較好的防控效果，在水解過程中能夠抑制致病微生物的生長從而減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失。

4 結(jié)論

本研究采用第二代DNBSEQ平臺與第三代PacBio平臺高通量測序技術(shù)對NWMCC0137進(jìn)行全基因組測序，全基因組長度為4 215 585 bp，G+C含量為44.23%，同時(shí)將完整的基因組數(shù)據(jù)與GO、KEGG、COG和CAZy等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋，從分子生物學(xué)的角度探究NWMCC0137的生物學(xué)特性以及基因組功能特性。在KEGG數(shù)據(jù)庫中B.subtilis NWMCC0137基因組被注釋到7種蛋白酶基因以及與萜類和聚酮類化合物代謝相關(guān)的基因。在CAZy數(shù)據(jù)庫中B.subtilis NWMCC0137基因組被注釋到α-淀粉酶、幾丁質(zhì)酶、分支酶、β-1，4-木聚糖內(nèi)切酶、G型溶菌酶、β-葡萄糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶等多種酶的編碼基因，這些基因在菌株生長過程中發(fā)揮著重要作用。通過antiSMASH分析，菌株NWMCC0137含有多個(gè)次級代謝產(chǎn)物合成基因簇，因此對抑制致病菌的生長具有較好的效果。本研究從基因?qū)用娼沂玖司闚WMCC0137的遺傳信息，為該菌株用于降解屠宰動物血液蛋白及生物防控提供了數(shù)據(jù)支持。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）