低劑量137Cs照射對甘藍型油菜幼苗抗氧化酶活性及光合作用的影響

李 斌，閆 冬，范 莉，姜曉燕

(中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學所，北京 100088)

隨著核能核技術的不斷發(fā)展，環(huán)境中的放射性污染風險增加，137Cs 和134Cs 為環(huán)境放射性污染中的主要人工放射性核素[1]。由于137Cs 和134Cs 半衰期長，所產生的電離輻射能夠在環(huán)境中長期存在，并且核素可隨著大氣環(huán)流沉降到土壤中，破壞土壤系統(tǒng)的生態(tài)環(huán)境，對土壤中植物的正常生長造成損傷，進而改變植物種群的平均特征、破壞植物種群的遺傳結構[2]。

植物受到照射后，體內產生的過量活性氧自由基對植物自身產生毒害作用，為抵御活性氧毒性的影響， 植物體內以超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)等為主的抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)生變化，清除體內過量自由基，維持植物細胞活性氧穩(wěn)態(tài)。作為植物抵御氧化應激的主要保護系統(tǒng)，通常將SOD、CAT、POD 等抗氧化酶的活性作為植物應激反應的重要監(jiān)測指標。此外，抗氧化酶還參與植物對環(huán)境脅迫的適應性反應中活性氧依賴的信號轉導[3]，在抵御外界脅迫，增強植物耐受性，維持植物正常生長方面發(fā)揮重要作用。

電離輻射抑制植物生長和發(fā)育的具體原因很復雜，研究表明通常是由于照射所引起的直接和間接作用所導致，其中光合能力的降低被認為是最關鍵的因素之一[4-6]。在高等植物中，光能的吸收、傳遞和轉化過程是由葉綠體類囊體膜上的蛋白復合物及其相關電子載體完成的[7]。這些蛋白復合物主要包括光系統(tǒng)Ⅰ(photosystem Ⅰ，PS Ⅰ)、光系統(tǒng)Ⅱ(photosystem Ⅱ，PS Ⅱ)、細胞色素b6f 和ATP 合酶復合物[8]。葉綠素能夠吸收光子并與蛋白質結合形成PS Ⅰ和PS Ⅱ，是植物葉片進行光合作用的主要色素，其含量是衡量植物光合作用強度的重要指標。

目前關于電離輻射對植物生理特性改變的研究主要集中在大劑量輻射育種方面，而關于植物幼苗期受到相對低劑量照射后的生理效應研究相對較少。甘藍型油菜(Brassica napusL.)作為一種重要的經濟作物，對其進行相關研究具有重要意義，且幼苗期作為其整個生育期的關鍵階段，直接影響后期的生長發(fā)育和產量。因此，本實驗選取甘藍型油菜(簡稱油菜)幼苗作為研究對象，以137Cs為照射源對油菜幼苗進行低劑量(≤30 Gy)照射，檢測其受照后抗氧化酶活性、葉綠素含量的變化，并對光合作用相關基因的表達進行分析，初步探討低劑量137Cs照射對油菜幼苗抗氧化酶活性及光合作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗所用油菜種子為中國科學院夏綠216。SOD、CAT 和POD 抗氧化酶活性測定試劑盒均購于Boxbio 公司，總RNA 提取試劑盒購于Solarbio 公司，逆轉錄試劑盒和SYBR 實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR，qPCR)試劑盒均購于翌圣生物公司。

1.2 方 法

1.2.1 油菜幼苗培養(yǎng)在實驗室條件下，采用土培方式獲得油菜幼苗。隨機挑選無病蟲害、充分成熟及籽粒飽滿的種子埋于盛有植物培養(yǎng)土的花盆中(20 cm×20 cm×18 cm)，使用光照培養(yǎng)架進行植物培養(yǎng)，期間溫度控制在22～24 ℃，濕度控制在50%～85%，光照周期為光期14 h，暗期10 h，光照度為5 000 lx[9]。

1.2.2 輻照條件幼苗長至二葉一心，株高3～4 cm時進行照射，每個劑量組包括5 棵油菜。以137Cs 為放射源，采用間隔照射代替慢性照射，每周照射5 d，每天照射7 h，照射劑量率為8.28 mGy/min，總照射劑量分別為0(對照組)、5、10、15、20、25和30 Gy。

1.2.3 抗氧化酶活性測定采用試劑盒進行酶的提取。稱取0.1 g新鮮油菜葉片加入1 mL提取液冰浴勻漿，4 ℃、8 000 g 離心10 min，取上清置于冰上待測。SOD活性采用氮藍四唑(NBT)光還原法測定，CAT活性采用過氧化氫法測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，每次測定設置3 個平行樣。具體操作步驟均按試劑盒說明書進行。

1.2.4 葉綠素與類胡蘿卜素含量的測定取0.1 g 葉片與2 mL 濃度為80%的丙酮混合勻漿，避光提取12 h 后，定容至5.0 mL，8 000 g 離心10 min。采用分光光度法測定葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b與類胡蘿卜素含量。取上清液在紫外分光光度計上分別測定663、645 和470 nm 處的吸光度，按照下面的公式計算色素的濃度(μg/mL)，每次測定設置3個平行樣：

Ca=12.72×D(663)-2.59×D(645)

Cb=22.88×D(645)-4.67×D(663)

Ca+b=20.29×D(645)+8.05×D(663)

Cx+c=[1 000×D(470)-3.27×Ca-104×Cb]/229

式中：Ca為葉綠素a含量；Cb為葉綠素b含量；Ca+b為葉綠素a+b 含量；Cx+c為類胡蘿卜素含量；D為吸光度。

1.2.5 qPCR 檢測光合作用相關基因的表達在高等植物體內，光合作用是由多個基因共同調控的復雜過程，為了解137Cs 照射對光合作用相關基因表達的影響，采用總RNA提取試劑盒提取油菜葉片總RNA，采用逆轉錄試劑盒進行cDNA 的合成，分別采用SYBR qPCR試劑盒對psb A、psb D、psb C和LOD106434505基因的表達進行qPCR 分析，反應體系為10 μL Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix，0.5 μL 正向和反向引物，5 μL 模板cDNA 并補充無菌超純水至20 μL。擴增條件為：95 ℃、5 min；95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s，40個循環(huán)。以GAPDH為參照。通過2-ΔΔCT法進行定量分析，每次測定設置3個平行樣。引物序列如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.3 數據處理與分析

通過Microsoft Excel 2016軟件進行數據的計算和整理，采用R 軟件對數據進行方差分析，通過GraphPad Prism 9 進行圖表的繪制。數值采用±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 不同劑量137Cs 照射對油菜幼苗抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶活性的變化與植物體內氧化穩(wěn)態(tài)有直接關系，常作為衡量植物抗逆性強弱的指標[10]。不同劑量137Cs 照射對油菜幼苗中抗氧化酶活性有顯著影響。與對照組比較，隨照射劑量的增加，5～30 Gy 照射組SOD 活性逐漸增加，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖1A)。其中5、10和15 Gy劑量組的SOD活性分別增加至對照組的1.32、1.48 和1.63 倍(P＜0.05)；20 和25 Gy 劑量組的SOD 活性增加至對照組的2 倍(P＜0.05)；30 Gy 劑量組的SOD 活性最高。CAT 活性在30 Gy 照射組最高，增加至對照組的1.50 倍(P＜0.05，圖1B)。POD活性在5和15 Gy照射組表現為增加(P＜0.05)，其中15 Gy 劑量組活性最高，增加至對照組1.90 倍(P＜0.05)；25 Gy 劑量組最低，降至對照組的41%(P＜0.05，圖1C)。

圖1 不同劑量137Cs照射后的油菜幼苗葉片中抗氧化酶活性的變化

2.2 不同劑量137Cs 照射對油菜幼苗光合色素含量的影響

葉綠素在植物光合作用的光能吸收、傳遞和轉化等環(huán)節(jié)中具有重要作用，葉綠素含量降低是引起植物光合速率降低的重要原因之一[11]。137Cs 對油菜幼苗葉片中葉綠素含量有一定影響。隨著照射劑量的增高，油菜幼苗葉片的葉綠素a 在10 Gy 劑量組含量最高，較對照組增加了24.51%(P＜0.05)；在30 Gy 劑量組含量最低，較10 Gy 劑量組降低了29.49%(P＜0.05)，見圖2A。葉綠素b 的含量在5 和10 Gy 劑量組分別較對照組增加了23.04 和29.51%(均為P＜0.05)；30 Gy 劑量組的葉綠素b 含量最低，較10 Gy 劑量組降低了39.46%(P＜0.05)，見圖2B。葉綠素a+b 的含量在5 Gy劑量組最高，比對照組增加了25.22%(P＜0.05)，見圖2C。葉片內類胡蘿卜素含量與葉綠素a+b 的變化趨勢相似，5 Gy 劑量組時較對照組增加了28.30%(P＜0.05)；30 Gy劑量組含量最低，較5 Gy劑量組降低了29.37%(P＜0.05)，見圖2D。

圖2 不同劑量137Cs照射處理的油菜幼苗葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量

2.3 qPCR 檢測137Cs 照射對油菜幼苗光合基因表達的影響

psb A和psb D基因對137Cs的照射不敏感(圖3A和B)。受到照射后，與對照組比較，psb C mRNA 表達水平均下調(15 Gy 劑量組除外)，5 Gy 劑量組表達水平下調了45.1%(P＜0.05)，10 Gy 劑量組表達水平降低了50%(P＜0.05，圖3C)。而LOC106434505 mRNA 的表達水平在照射后均顯著上調(P＜0.05)，15 Gy劑量組較對照組增加了1倍(P＜0.05)，在30 Gy劑量組表達水平最高(圖3C)。

圖3 不同劑量137Cs照射后油菜幼苗葉片中光合基因的表達情況

3 討 論

研究表明，在重金屬、極端溫度、電離輻射等逆境脅迫下，植物光合作用過程中卡爾文循環(huán)(也稱暗反應)中電子的減少和梅勒反應中的過量電子泄露能夠導致體內活性氧水平增加[12]，過量的活性氧破壞生物分子和細胞結構，甚至導致植物死亡。SOD、CAT 和POD是植物體內酶促防御系統(tǒng)的重要抗氧化酶，能有效清除植物受到脅迫后所產生的大量活性氧及其他過氧自由基，抑制膜脂質過氧化，減輕活性氧等物質對植物細胞膜結構和功能的破壞。在本研究中，油菜幼苗受照后，體內活性氧大量累積，SOD作為防御活性氧的第一道酶防線迅速反應[12]，隨著137Cs 照射劑量的增加，活性逐漸增強。SOD從超氧陰離子中接受電子并傳遞電子，將油菜體內大量活性氧轉化為無毒的O2和毒性較低的H2O2；隨著體內H2O2增多，CAT活性也隨之增強，催化分解H2O2產生H2O和O2；POD參與植物體內多種生理功能，與CAT協(xié)作清除H2O2，起到保護作用，而隨著逆境脅迫的發(fā)展，POD能夠促進活性氧的生成，加速葉綠素降解，引發(fā)膜脂質過氧化，表現為膜損傷作用[13]。在李春牛等[14]和Kiani 等[15]的研究中，茉莉花、小麥受到照射后體內SOD、CAT 及POD活性隨著照射劑量的增加而逐漸增高，當劑量高達一定程度時轉而下降。而在本研究中，油菜幼苗受到137Cs照射后，SOD和CAT活性逐漸增強，隨著照射劑量的增加，并未出現活性下降的現象，這可能是由于不同物種對電離輻射的敏感性不同有關，油菜對電離輻射的耐受性較強[16]。

光合作用是植物生長和生物能量積累的基礎，葉綠素在光合作用過程中吸收光能，并將光能轉化為化學能，是植物體內的主要光合色素。高等植物體內葉綠素的合成是一個復雜的過程，整個過程由17種酶調控[17]。大量研究表明，植物葉綠素的合成與分解不僅受自身激素與酶的調節(jié)，還受到溫度、光照、電離輻射等環(huán)境因素的影響，并且電離輻射的影響表現為低劑量促進、高劑量抑制的規(guī)律[18]。本研究中，采用不同劑量的137Cs 照射油菜幼苗后，隨著137Cs 劑量增加，油菜葉片中葉綠素含量表現為先增后減的趨勢，與其他研究結果一致[19-20]。這說明低劑量(5 和10 Gy)電離輻射能夠促進葉綠素合成，而隨著照射劑量增加，葉綠素合成逐漸受到抑制，如通過降低葉綠素合成酶活性[21]、改變葉片類囊體的正常結構[22]，或調控葉綠素降解酶[23]而促進葉綠素降解。有研究表明，葉綠素含量與光合速率、植物產量呈正相關關系[6，17]，若阻斷植物葉綠素合成或促進植物葉綠素降解，將引起植物光合作用紊亂，植物生長受阻甚至導致死亡。

除此之外，137Cs 照射還通過促進光反應過程中的光能捕獲和能量傳遞對油菜幼苗光合作用產生影響。在光合作用過程中，葉綠素和類胡蘿卜素吸收光能并結合到類囊體膜的蛋白上，形成2 大類超分子復合物：PS Ⅰ和PS Ⅱ，其中PS Ⅱ是電離輻射的主要靶標之一[6]。PS Ⅱ主要由在功能和結構上不同的兩部分組成：①核心復合體，主要成分包括D1、D2 蛋白所組成的光化學反應中心及兩個序列相關的核心天線蛋白CP43、 CP47； ②捕 光 復 合 體(light-harvesting complex，LHC)和放氧復合體外周蛋白，主要由色素蛋白復合體組成[24-25]。在結構上，psb A和psb D分別編碼PS Ⅱ的D1 蛋白和D2 蛋白，D1 蛋白也叫Qβ蛋白，在光抑制條件下能夠快速更新，與D2 蛋白結合形成復合物，在光電子轉運中起著重要的作用[26]。psb C編碼PS Ⅱ葉綠素載脂蛋白CP43，CP43 和CP47與PS Ⅱ核心復合物緊密相連，并結合大量葉綠素，將PS Ⅱ外周LHC 吸收的能量傳給光反應中心，從而引起光化學反應[27]。研究表明，psb A的轉錄受到光敏色素介導，且psb A和psb B表現出光依賴性，其表達主要受到光的調控，維持光誘導的成熟葉綠體中D1和D2蛋白的快速周轉，以避免光抑制[28]。因此，在本研究中，psb A和psb D基因的表達水平并未受到137Cs照射的影響。而psb C基因的表達水平在受到照射后顯著下調(P＜0.05)，這說明137Cs 照射對油菜光合作用的光電子轉運和能量傳遞具有一定影響。在功能上，LHC II蛋白是PS Ⅱ的主要捕光葉綠素a和或b結合蛋白，由LHC b家族編碼，其含量占了類囊體膜蛋白總量的1/3 以上，并且結合了50%以上的葉綠素[24]。LHC II的主要功能是光能的吸收和傳遞，提高捕光面積和捕光效率；此外，LHC II在光能分配的調節(jié)以及光保護過程中也具有重要的作用[24-25]。其中，LHC Ⅱ中的Ⅲ型葉綠素a 和或b 結合蛋白由LOC106434505基因編碼，油菜受到照射后，LOC106434505基因的表達隨著137Cs 照射劑量的增加而增加(P＜0.05)，以增強對光能的捕獲和傳遞，通過調節(jié)光合作用為受照后的油菜解毒機制提供能量，提高植物抗逆性。此外，psb C基因的表達在受到照射后立即出現下調，而LOC106434505基因的表達在劑量增至15 Gy時才出現顯著上調。這也說明油菜幼苗體內可能存在反饋調節(jié)機制[29]，當幼苗體內光合作用相關基因psb C下調后，油菜幼苗葉片中光電子轉運和能量傳遞受阻，光合作用效率降低，反向上調LOC106434505基因的表達，增加幼苗葉片對光能的吸收和傳遞，以彌補油菜幼苗光合作用過程中光電子轉運受阻的影響。

綜上所述，低劑量(≤30 Gy)137Cs 照射能夠增強油菜幼苗抗氧化酶活性，并通過影響油菜幼苗葉綠素含量、光電子轉運、能量捕獲與傳遞對油菜光合作用產生影響。