微生物學(xué)快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)在重癥肺炎中的應(yīng)用價(jià)值

楊幸樂 夏婷婷 左春磊 史家欣

1錦州醫(yī)科大學(xué)（遼寧錦州 121000）；徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院2呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，3檢驗(yàn)科（江蘇連云港 222006）

重癥肺炎是重癥監(jiān)護(hù)病房?jī)?nèi)的一種常見急危重癥，多見于免疫功能低下的患者，臨床上常表現(xiàn)為病情重、進(jìn)展迅速、治療難度大、預(yù)后差等特征，嚴(yán)重威脅人類健康［1］。盡管目前在病因調(diào)查和抗微生物治療方面已取得較大進(jìn)展，但重癥肺炎仍然是全世界感染死亡的主要原因之一［2］。有調(diào)查研究［3］表明，在沒有可靠的致病微生物證據(jù)的情況下，僅接受經(jīng)驗(yàn)性治療的患者病死率高達(dá)30% ～50%，及時(shí)有效的靶向抗菌藥物治療是提高重癥肺炎患者生存率的有效手段。微生物學(xué)快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估（M-ROSE）是指利用現(xiàn)場(chǎng)制片、染色手段并在較短時(shí)間內(nèi)獲取微生物學(xué)證據(jù)的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)［4-5］。有研究［6-7］證明M-ROSE 對(duì)肺部感染患者具有較高的診斷價(jià)值，但對(duì)于M-ROSE 在重癥肺炎中的應(yīng)用價(jià)值尚未明確。本研究通過觀察M-ROSE 對(duì)重癥肺炎患者入院后臨床癥狀、血炎癥指標(biāo)水平、機(jī)械通氣時(shí)間、住ICU 時(shí)間及病死率的影響，評(píng)價(jià)M-ROSE 在重癥肺炎中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料隨機(jī)選取2021 年2 月至2023 年2 月在連云港市第一人民醫(yī)院住院的60 例重癥肺炎患者，其中M-ROSE組30例、對(duì)照組30例。MROSE 組患者利用M-ROSE 檢測(cè)結(jié)果選取抗菌治療方案，而對(duì)照組則依據(jù)指南選擇經(jīng)驗(yàn)性抗菌治療方案。本研究已獲得連云港市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（倫理審查意見號(hào)：KY-20211027001）。

1.1.1 入組標(biāo)準(zhǔn)年齡≥18 歲；入院后初診為重癥肺炎尚未使用抗菌藥物治療；符合2007 年美國(guó)感染疾病學(xué)會(huì)/美國(guó)胸科學(xué)會(huì)關(guān)于重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)的住院患者［8］。重癥肺炎主要標(biāo)準(zhǔn)：患者需行有創(chuàng)機(jī)械通氣治療；膿毒性休克需血管收縮劑治療。次要標(biāo)準(zhǔn)：呼吸頻率＞ 30 次/min；氧合指數(shù)（PaO2/FiO2）＜ 250；多肺葉浸潤(rùn)；意識(shí)障礙／定向障礙；氮質(zhì)血癥（BUN ＞ 20 mg/dL）；由感染引起的白細(xì)胞減少（WBC ＜ 4.0 × 109/L）；血小板減少（血小板 ＜ 100 × 109/L）；低體溫（T ＜ 36 ℃）；低血壓，需要進(jìn)行積極的液體復(fù)蘇治療。符合1項(xiàng)主要標(biāo)準(zhǔn)或3項(xiàng)次要標(biāo)準(zhǔn)可診斷為重癥肺炎。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)合并有肺纖維化、免疫性疾病、長(zhǎng)期使用激素的患者；自身免疫性疾病患者；先天性免疫缺陷、獲得性免疫缺陷患者；晚期腫瘤患者。

1.2 方法

1.2.1 資料收集收集入組患者臨床、實(shí)驗(yàn)室及相關(guān)影像學(xué)資料，包括患者基礎(chǔ)信息、既往史、血清炎癥指標(biāo)（細(xì)胞因子、WBC、CRP）、發(fā)熱時(shí)長(zhǎng)、機(jī)械通氣時(shí)間、住ICU 時(shí)長(zhǎng)、28 d 病死率。住院后首次診斷重癥肺炎日期即為觀察起始日期，每天對(duì)患者治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，肺炎已控制且生命體征平穩(wěn)者予轉(zhuǎn)出ICU。所有入組患者均由本人或委托人簽署知情同意書（版本號(hào)：V1.2021.01.27）。

1.2.2 氣道分泌物及肺泡灌洗液收集對(duì)于意識(shí)清醒，有自主排痰能力的入組患者，囑咐患者主動(dòng)咳痰，收集深部痰標(biāo)本；對(duì)于無(wú)自主排痰能力和有創(chuàng)機(jī)械通氣者予吸痰器吸引深部痰液，并予以送檢下一步檢測(cè)；接受電子支氣管鏡檢查行支氣管肺泡灌洗者，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），留取部分BALF 送檢驗(yàn)科行病原學(xué)檢測(cè)，其余BALF行M-ROSE 檢測(cè)。

1.2.3 標(biāo)本染色

1.2.3.1 革蘭氏染色對(duì)收集到的痰液和BALF進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速涂片，對(duì)于痰液豐富者，予0.1%DTT進(jìn)行祛痰處理，再吸取20 μL 標(biāo)本進(jìn)行涂片，自內(nèi)向外劃直徑為1 cm 的同心圓薄層，將標(biāo)本至于酒精燈上加熱固定。（1）滴加80 μL 結(jié)晶紫進(jìn)行初染，時(shí)間1 min；（2）流水沖洗后，滴加80 μL 碘液進(jìn)行媒染，時(shí)間1 min；（3）流水沖洗后滴加95%乙醇進(jìn)行脫色，時(shí)間20 s ；（4）無(wú)需沖洗，直接滴加80 μL 沙黃復(fù)染，時(shí)間1 min；（5）染好的涂片用細(xì)小流水沖洗，盡量減少沉渣沉積，避免流水直接沖洗玻片，將洗凈的涂片片尾朝上，待涂片自然晾干后鏡檢，滴加香柏油在油鏡下觀察。若視野中出現(xiàn)紫色球（桿）狀細(xì)菌，則為革蘭陽(yáng)性球（桿）菌；若視野中出現(xiàn)紅色球（桿）菌，則為革蘭陰性菌球（桿）菌。

1.2.3.2 抗酸染色取標(biāo)本混懸液20 μL，在潔凈的載玻片上由內(nèi)向外均勻涂抹直徑為1 cm 的同心圓薄層，將標(biāo)本至于酒精燈上加熱固定；（1）滴加石碳酸復(fù)紅初染（3 min，弱火）；（2）水洗后，3%鹽酸乙醇脫色（20 s，2 次）；（3）水洗后，亞甲藍(lán)復(fù)染（1 min），染好的涂片用細(xì)小流水沖洗，盡量減少沉渣沉積，避免流水直接沖洗玻片，將洗凈的涂片片尾朝上，待涂片自然晾干后鏡檢。若視野中出現(xiàn)紅色細(xì)長(zhǎng)，略彎曲的桿菌，則為結(jié)核桿菌。

1.2.3.3 真菌涂片鏡檢接種環(huán)取標(biāo)本混懸液，涂抹于潔凈載玻片上，滴加10%的氫氧化鉀溶液處理后在低倍鏡和高倍鏡下觀察有無(wú)孢子或菌絲，注意操作過程盡可能在無(wú)菌環(huán)境終完成，以此減少假陽(yáng)性的發(fā)生率。若真菌涂片見孢子或菌絲，可進(jìn)一步完成墨汁染色，判斷是否為隱球菌感染。

1.2.4 抗菌治療方案的選擇M-ROSE 組患者的初始抗菌藥物治療方案根據(jù)鏡檢結(jié)果，結(jié)合《抗菌藥物臨床應(yīng)用指南（第三版）》選擇相應(yīng)的抗感染治療方案。對(duì)照組患者根據(jù)《中國(guó)成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南（2018 年版）》、《中國(guó)成人社區(qū)獲得性肺炎診斷和治療指南（2016 年版）》指南結(jié)合臨床選擇經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療方案［9-10］。

1.2.5 血清細(xì)胞因子的測(cè)定抽取所有受試者在診斷后的第1、7 天清晨空腹靜脈血3 mL，以3 000 r/min，4 ℃離心15 min，分離血清，應(yīng)用流式熒光法（CBA）檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IL-6、IL-10 的水平，操作過程嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.2.6 臨床觀察指標(biāo)及療效判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)兩組患者病程第1、7 天炎癥指標(biāo)（WBC、CRP）進(jìn)行觀察比較，并比較兩組患者發(fā)熱消失時(shí)長(zhǎng)、機(jī)械通氣時(shí)間、住ICU 時(shí)長(zhǎng)及28 d 病死率的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，非正態(tài)計(jì)量資料數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)（Q1/Q3）表示；正態(tài)計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料兩組患者性別、年齡、臨床癥狀（發(fā)熱、呼吸困難）、慢性病史、吸煙史、APACHEⅡ評(píng)分，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），有可比性。見表1。

表1 兩組患者一般資料Tab.1 Comparison of general data of patients between the two groups

2.2 M-ROSE 結(jié)果30 例患者的M-ROSE 評(píng)估結(jié)果顯示，革蘭陽(yáng)性菌為5 例（16.67%，涂片結(jié)果如圖1A），革蘭陰性菌為11 例（36.67%，涂片結(jié)果如圖1B），結(jié)核1 例（3.70%，涂片結(jié)果如圖1C）；真菌3 例（10%，涂片結(jié)果如圖1D）；混合感染10 例（33.33%）。

圖1 M-ROSE 涂片F(xiàn)ig.1 M-ROSE smear

2.3 血清IL-6、IL-10 水平變化應(yīng)用CBA 法檢測(cè)入組患者第1、7 天血清中細(xì)胞因子IL-6、IL-10的表達(dá)，并計(jì)算IL-6/IL-10 比值。第1 天兩組IL-6、IL-10、IL-6/IL-10 水平無(wú)明顯差異（P＞ 0.05），治療7 d 后M-ROSE 組IL-6、IL-10、IL-6/IL-10 水平均較對(duì)照組顯著下降（P＜ 0.05）。見表2。

表2 兩組患者血清細(xì)胞因子水平的動(dòng)態(tài)變化與比較Tab.2 Comparative analysis of serum cytokine levels and their dynamic changes between the two groups ±s

表2 兩組患者血清細(xì)胞因子水平的動(dòng)態(tài)變化與比較Tab.2 Comparative analysis of serum cytokine levels and their dynamic changes between the two groups ±s

注：#中位數(shù)和四分位數(shù)

細(xì)胞因子IL-6（pg/mL）IL-10（pg/mL）IL-6/IL-10 P值0.143 0.001 0.849 0.011 0.249 0.001天數(shù)第1天第7天第1天第7天第1天第7天M-ROSE組119.04 ± 46.79 34.85（29.14，44.76）#1.89 ± 0.66 1.86 ± 0.55 66.94 ± 28.77 21.08 ± 4.63對(duì)照組139.38 ± 58.62 74.17（63.14，95.31）#1.92 ± 0.60 2.27 ± 0.65 75.86 ± 30.46 33.97 ± 6.07統(tǒng)計(jì)量值1.486 8.271 0.191 2.638 1.166 9.242

2.4 血清WBC和CRP水平變化入院時(shí)M-ROSE組和對(duì)照組患者血清WBC、CRP 水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見表3。治療1 周后兩組患者血清WBC、CRP 水平均較前下降，M-ROSE 組和對(duì)照組患者血清WBC、CRP 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表3。

表3 兩組患者血清炎癥指標(biāo)水平的變化與比較Tab.3 Dynamic alterations and comparative analysis of serum inflammatory biomarkers between the two groups ±s

表3 兩組患者血清炎癥指標(biāo)水平的變化與比較Tab.3 Dynamic alterations and comparative analysis of serum inflammatory biomarkers between the two groups ±s

血炎癥指標(biāo)WBC（× 109個(gè)/L）CRP （mg/L）天數(shù)第1天第7天第1天第7天M-ROSE組11.71 ± 2.50 8.86 ± 1.22 99.00 ± 43.74 74.93 ± 28.60對(duì)照組11.07 ± 1.93 9.58 ± 1.34 106.50 ± 39.09 93.05 ± 27.05統(tǒng)計(jì)量值1.118 2.182 0.701 2.521 P值0.268 0.033 0.486 0.014

2.5 患者發(fā)熱時(shí)間對(duì)照組患者發(fā)熱時(shí)間是（4.17 ± 1.70）d，M-ROSE 組是（2.87 ± 1.53）d，MROSE 組顯著少于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 3.114，P= 0.003）。

2.6 機(jī)械通氣時(shí)間M-ROSE 組（n= 14）和對(duì)照組（n= 16）機(jī)械通氣時(shí)間分別是（4.21 ± 1.48）d 和（7.31 ± 2.72）d，M-ROSE 組機(jī)械通氣時(shí)間顯著低于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 4.355，P＜ 0.05）。

2.7 住ICU 時(shí)長(zhǎng)M-ROSE 組和對(duì)照組住ICU 時(shí)長(zhǎng)分別是（11.77 ± 1.52）、（12.80 ± 1.75） d，M-ROSE組顯著低于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 2.439，P= 0.018）。

2.8 28 d 病死率M-ROSE 組死亡2 例（6.67%），對(duì)照組死亡1 例（3.33%），兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 0.351，P= 0.554）。

3 討論

重癥肺炎作為ICU 內(nèi)常見的急危重癥，其治療難度大，病死率高，常有多種合并癥，極大增加了醫(yī)療保健負(fù)擔(dān)［1］。如何改善重癥肺炎預(yù)后一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一［11］。盡早確定病原體并進(jìn)行針對(duì)性治療是改善重癥肺炎患者預(yù)后的關(guān)鍵措施之一［12］。近年來(lái)隨著各類介入與微創(chuàng)技術(shù)的飛速發(fā)展，快速染色制片技術(shù)不斷提升，基于介入技術(shù)的M-ROSE 優(yōu)勢(shì)愈發(fā)明顯，并逐漸成為現(xiàn)代介入呼吸病學(xué)和呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)的核心技術(shù)之一［7，13-14］。既往有研究［6］將M-ROSE 應(yīng)用于支氣管鏡下的肺部感染患者的病原學(xué)診斷中，通過回顧性分析評(píng)估M-ROSE 的診斷敏感性和特異性，初步證明了M-ROSE 在支氣管鏡下對(duì)肺部感染患者具有較高的診斷價(jià)值，有助于對(duì)感染患者進(jìn)行病原學(xué)的初步評(píng)估，為下一步的臨床治療提供早期病原學(xué)依據(jù)，及早開始使用合適的抗菌藥物是減少重癥肺炎患者不良后果的關(guān)鍵因素［11］。

眾所周知，促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)之間的平衡在重癥肺炎病程及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。IL-6 作為促炎因子中的重要成員，在細(xì)胞間信號(hào)傳遞以及殺滅病原菌方面具有顯著意義，但其過度表達(dá)則會(huì)加重組織損傷導(dǎo)致不良預(yù)后［15］。而IL-10 是抑制炎癥反應(yīng)、限制過度免疫反應(yīng)的重要抗炎介質(zhì)［16］。既往研究［17］表明，降鈣素原（PCT）在細(xì)菌感染引起的促炎癥反應(yīng)刺激下水平會(huì)升高，是一種鑒別細(xì)菌與非細(xì)菌感染的有用指標(biāo)，但在新冠肺炎中進(jìn)行的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)PCT 反映全身炎癥反應(yīng)水平的敏感性低于CRP，結(jié)果顯示無(wú)論在輕型組、普通組、重型組或危重組CRP 水平均高于對(duì)照組，而PCT 在輕型組和普通組中均與對(duì)照組無(wú)顯著異。因此，CRP 能更好地反映全身炎癥反應(yīng)水平并對(duì)治療效果作出快速反應(yīng)［18］。

本研究通過前瞻性研究本院60 例重癥肺炎患者，觀察兩組患者血液炎癥因子水平（如IL-6、IL-10、IL-6/IL-10）、WBC、CRP 以及發(fā)熱時(shí)長(zhǎng)、機(jī)械通氣時(shí)間、住ICU 時(shí)長(zhǎng)、28 d 病死率，評(píng)估M-ROSE在重癥感染患者中的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果顯示，治療7 d 后M-ROSE 組IL-6、IL-10、IL-6/IL-10 水平均低于對(duì)照組（P＜ 0.05）。與對(duì)照組相比，M-ROSE組患者的血WBC、CRP 水平下降速度更快（P＜ 0.05），發(fā)熱癥狀持續(xù)時(shí)間更短（P＜ 0.05），機(jī)械通氣時(shí)間和住ICU 時(shí)長(zhǎng)明顯縮短（P＜ 0.05）。由此可見，依據(jù)M-ROSE 檢測(cè)結(jié)果選擇抗菌方案可快速有效地改善癥狀，促進(jìn)炎癥因子和炎癥指標(biāo)水平下降，縮短機(jī)械通氣時(shí)間及住ICU 時(shí)間。這些指標(biāo)的快速改善，得益于M-ROSE 快速提供了初始病原學(xué)信息從而盡早選擇了更有針對(duì)性的抗菌藥物。

既往有研究［19］表明，對(duì)痰液進(jìn)行革蘭染色可優(yōu)化醫(yī)院獲得性肺炎抗菌藥物的選擇，顯著降低肺炎患者病死率。而本研究結(jié)果顯示M-ROSE 組與對(duì)照組患者病死率無(wú)明顯差異（P＞0.05），究其原因可能在于本研究納入的樣本量較小、微生物學(xué)鑒別手段較少，未來(lái)需要進(jìn)行多中心、大樣本的研究，并納入更多的微生物檢測(cè)手段（如真菌免疫熒光檢測(cè)法、快速病原核酸檢測(cè)等）及檢測(cè)標(biāo)本（如胸水、氣管鏡活檢或針吸活檢標(biāo)本），以此獲得進(jìn)一步的結(jié)論。

M-ROSE 操作簡(jiǎn)單，可行性強(qiáng)，有助于在病原學(xué)層面對(duì)重癥肺炎患者進(jìn)行初步病原學(xué)評(píng)估，為重癥肺部感染患者的治療提供初步的病原學(xué)參考，對(duì)改善重癥肺炎預(yù)后具有潛在的臨床價(jià)值。由于過度、不適當(dāng)使用抗菌藥物易導(dǎo)致抗菌藥物耐藥，盡早、合理使用抗菌藥物可極大減少抗菌藥物耐藥的發(fā)生［11，20］。下一步需要探索M-ROSE 指導(dǎo)的抗菌藥物治療與基于指南的經(jīng)驗(yàn)抗菌藥物治療的耐藥性是否存在差異。

【Author contributions】YANG Xingle， XIA Tingting and ZUO Chunlei performed the experiments and wrote the article. SHI Jiaxin revised the article. SHI Jiaxin designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.