siRNA 沉默CAPN1 基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞MG-63 增殖、侵襲及Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

鄭思化 趙學(xué)正 高偉

骨肉瘤是主要起源于間葉組織的一種原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年[1]。骨肉瘤具有高度的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，對患者的生命和生活質(zhì)量均造成嚴(yán)重的影響[2-3]。目前，外科手術(shù)仍是治療骨肉瘤的主要方法。隨著新輔助化療技術(shù)的不斷推廣，患者5 年生存率明顯提高，但復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者生存率仍較低[4-5]。因此，深入探究骨肉瘤發(fā)病的細(xì)胞機(jī)制及分子信號機(jī)制迫在眉睫。研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶1（calpain 1，CAPN1）通過促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。但目前CAPN1 是否參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展尚不明確。本研究旨在探討小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默CAPN1 基因?qū)θ斯侨饬黾?xì)胞MG-63 增殖、侵襲及B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人骨肉瘤細(xì)胞MG-63 購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，貨號：C11995500BT）和10% FBS（美國Gibco 公司，批號：2007142）；siRNA 轉(zhuǎn)染試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，批號：2007281）；CAPN1 siRNA 轉(zhuǎn)染試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，批號：2009172）；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號：2012011）；Trizol Reagent 試劑盒（上海聯(lián)碩生物科技有限公司，批號：2110172）；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，貨號：K1622-100 react）；qRTPCR 試劑盒（上海欽誠生物科技有限公司，貨號：QC90504-1）；四唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液（上海哈靈生物科技有限公司，批號：2003241）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：ST038）；Bcl-2 抗體（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，貨號：251711）和Bax 抗體（深圳市豪地拓生物科技有限公司，貨號：251834）。倒置顯微鏡（日本Olympus 公司，型號：CKX53）；酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司，型號：Multiskan Sky）；實時熒光定量PCR儀（美國ABI 公司，型號：7500）；Transwell 小室（美國Corning 公司，型號：3422）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter 公司，型號：CytoFLEX）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取MG-63 細(xì)胞放置于37 ℃水浴中解凍后制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整為1×105/mL 的密度接種于含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長融合至80%時，棄掉上層培養(yǎng)液，消化處理，傳代培養(yǎng)和凍存細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將密度為1×105/mL 單細(xì)胞混懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長融合至約90%時，將siRNA 序列、CAPN1 siRNA 序列分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分為CAPN1 siRNA 組與siRNA 組，以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照組。

1.2.3 細(xì)胞CAPN1 mRNA 表達(dá)水平檢測 采用qRTPCR 法。應(yīng)用Trizol Reagent 試劑盒從MG-63 細(xì)胞中提取總RNA，檢測RNA 的純度和完整性，采用RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按照qRT-PCR 試劑盒說明標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系：10 μL 緩沖液，1 μL dNTP mix，1 μL TaqDNA 聚合酶，2 μL 上游引物，2 μL下游引物，1 μL cDNA，33 μL H2O；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，67 ℃退火15 s，45 個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算CAPN1 mRNA 相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 細(xì)胞增殖率檢測 采用MTT 比色法。將兩組MG-63 細(xì)胞按每孔1×104個細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔加入200 mL DMEM 培養(yǎng)基。每組細(xì)胞于接種后12、24、36、48 h 加入20 μL MTT 溶液孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO 溶液混勻使沉淀溶解，用酶標(biāo)儀檢測490 nm 處吸光度（optical density，OD）值。增殖率（%）=[（OD實驗組-OD對照組）/OD實驗組]×100%。

1.2.5 細(xì)胞侵襲率檢測 采用Transwell侵襲實驗。Transwell 孔徑8 μm，每孔加入稀釋后的Matrigel 50 μL，于37 ℃孵育4 h。對照組、siRNA 組和CAPN1 siRNA 組細(xì)胞接種到Transwell 小室中，稀釋成2×106個/mL，上室中每孔加入細(xì)胞懸浮液200 μL，下室中每孔加入細(xì)胞懸浮，培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，觀察細(xì)胞侵襲情況，使用Image J 軟件計算侵襲細(xì)胞數(shù)。侵襲率（%）=[（OD實驗組-OD對照組）/OD實驗組]×100%。

1.2.6 細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot 法。采用RIPA 裂解液提取MG-63 細(xì)胞，依據(jù)BCA 法測定蛋白濃度。按每泳道50 μg 蛋白進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。加入一抗后4 ℃孵育過夜。TBST 漂洗3 次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。采用TBST 洗滌3 次，每次洗滌10 min。ECL 液暗室發(fā)光顯影，使用Image J 軟件計算各個條帶的灰度值，內(nèi)參為β-actin。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組MG-63 細(xì)胞中CAPN1 mRNA 表達(dá)水平比較 3 組MG-63 細(xì)胞CAPN1 mRNA 表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中CAPN1 siRNA 組細(xì)胞CAPN1 mRNA 表達(dá)水平為0.34±0.06，低于對照組的0.98±0.05 和siRNA 組的0.97±0.04，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而對照組和siRNA 組細(xì)胞CAPN1 mRNA 表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 3 組MG-63 細(xì)胞增殖率比較 CAPN1 siRNA 組細(xì)胞在培養(yǎng)12、24、36 和48 h 的增殖率均低于對照組和siRNA 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而對照組和siRNA 組細(xì)胞在培養(yǎng)12、24、36 和48 h 的增殖率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 3 組MG-63 細(xì)胞增殖率比較（%）

2.3 3 組MG-63 細(xì)胞侵襲率比較 3 組MG-63 細(xì)胞侵襲率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中CAPN1 siRNA 組細(xì)胞侵襲率為（61.47±6.68）%，低于對照組的（94.34±2.67）%和siRNA 組的（93.54±2.98）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而對照組和siRNA 組細(xì)胞侵襲率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1（插頁）。

圖1 3 組MG-63 細(xì)胞侵襲情況的染色圖（A：對照組；B：siRNA 組；C：CAPN1 siRNA 組）

2.4 3 組MG-63 細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平比較 CAPN1 siRNA 組細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)水平低于對照組和siRNA 組，而Bax 蛋白表達(dá)水平高于對照組和siRNA 組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而對照組和siRNA 組Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖2 和表3。

表3 3 組MG-63 細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平比較

圖2 3 組MG-63 細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

骨肉瘤常見于血運豐富的四肢長骨干骺端，如脛骨近端、股骨遠(yuǎn)端等[7-9]。骨肉瘤臨床癥狀主要表現(xiàn)為局部疼痛和腫脹，偶爾伴關(guān)節(jié)活動障礙，存在較高的轉(zhuǎn)移傾向，并且早期很容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，特別是肺部轉(zhuǎn)移，病情發(fā)展迅速[10-13]。

CAPN 是一種有著類似催化結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)保守的半胱氨酸蛋白酶，參與體內(nèi)一系列細(xì)胞基本生理過程，包括細(xì)胞的增殖和凋亡、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞骨架重建等[14]。CAPN 家族包含十余種亞基，而其中CAPN1 表達(dá)最為廣泛，且最受關(guān)注。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CAPN 的表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程關(guān)系緊密，且研究發(fā)現(xiàn)腎細(xì)胞癌腫瘤、腦膜瘤組織及神經(jīng)鞘瘤組織中CAPN1 表達(dá)均明顯升高[15]。CAPN1 不僅與腫瘤細(xì)胞的增殖關(guān)系緊密，且與腫瘤細(xì)胞的遷移關(guān)系緊密。趙治艷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，siRNA 沉默CAPN1 可抑制膽囊癌細(xì)胞GBC-SD 增殖和遷移作用，可為治療膽管癌提供新的實驗依據(jù)。本研究表明，CAPN1 siRNA 組CAPN1 mRNA 表達(dá)水平低于對照組和siRNA 組，由此可見siRNA 沉默CAPN1 可下調(diào)CAPN1 表達(dá)；CAPN1 siRNA 組細(xì)胞在培養(yǎng)12、24、36 和48 h 的增殖率均低于對照組和siRNA 組，由此可見siRNA 沉默CAPN1 可抑制MG-63 細(xì)胞增殖；CAPN1 siRNA 組MG-63 細(xì)胞侵襲率低于對照組和siRNA 組，由此可見siRNA 沉默CAPN1 可抑制MG-63 細(xì)胞的侵襲。

研究發(fā)現(xiàn)，凋亡相關(guān)基因及其蛋白異常表達(dá)在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[17-18]。Bcl-2 和Bax 分別是起促凋亡和抗凋亡作用的蛋白。Bcl-2 在多種腫瘤中表達(dá)升高，而Bax 在多種腫瘤中表達(dá)降低。Bcl-2蛋白高表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖，避免出現(xiàn)凋亡；而Bax 蛋白可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長。本研究表明，CAPN1 siRNA 組細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)水平低于對照組和siRNA 組，而Bax 蛋白表達(dá)水平高于對照組和siRNA 組，由此可見siRNA 沉默CAPN1可下調(diào)Bcl-2 表達(dá)及上調(diào)Bax 表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，但其具體的作用機(jī)制尚未完全明確，還需后續(xù)深入探討，為治療骨肉瘤提供依據(jù)。

綜上所述，siRNA 沉默CAPN1 表達(dá)抑制了MG-63細(xì)胞增殖和侵襲能力，并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)有關(guān)。