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    長(zhǎng)鏈非編碼RNA Hotair 在CKD小鼠腎臟纖維化中的作用及機(jī)制研究

    2023-12-12 02:53:54劉琳任燕陳茂盛王敏敏
    浙江醫(yī)學(xué) 2023年22期
    關(guān)鍵詞:小鼠水平

    劉琳 任燕 陳茂盛 王敏敏

    慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD)是由多種疾病引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)與功能不可逆損害的共同終點(diǎn)。CKD 的共同病理表現(xiàn)是腎臟纖維化,其特點(diǎn)是腎小球硬化、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化[1]。在各種病因?qū)е碌腃KD 背景下,腎小管上皮細(xì)胞合成細(xì)胞因子、活性氧等大量炎癥產(chǎn)物,招募炎癥細(xì)胞至腎間質(zhì)并啟動(dòng)與間質(zhì)成纖維細(xì)胞的相互作用。隨著間質(zhì)纖維化的發(fā)展,損傷的腎小管上皮細(xì)胞失去再生能力并發(fā)生凋亡從而導(dǎo)致腎小管萎縮和無(wú)功能腎小球的形成[2]。目前延緩腎臟纖維化的治療手段十分有限。2007 年Rinn 等[3]首先通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)Hotair 位于第12條染色體上,長(zhǎng)度約為2.2 kb。Hotair 參與調(diào)控多種生物學(xué)行為,如細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞遷移、上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、腫瘤進(jìn)展等[4]。Yu 等[5]研究表明Hotair 在肝纖維化中表達(dá)增加,可能參與肝纖維化的調(diào)控,但是其在腎臟纖維化中的作用還不是十分清楚。表觀遺傳修飾在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用[6]。多梳抑制復(fù)合體2(polycomb repressive complex 2,PRC2)是一種重要的染色質(zhì)修飾復(fù)合物,由包括胚胎外胚層發(fā)育蛋白(embryonic ectoderm development,EED)、Zeste12 同源物抑制因子(suppressor of Zeste 12 homolog,SUZ12)、Zeste增強(qiáng)子同源物2(enhancer of Zeste homolog 2,EZH2)的核心亞基及其他輔助因子組成[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)Hotair 可與PRC2 及賴氨酸特異性去甲基化酶1(histone lysine-specific demethylase 1,LSD1)結(jié)合,從而作為分子支架協(xié)調(diào)PRC2 和LSD1 靶向染色質(zhì)進(jìn)行表觀遺傳調(diào)控[8]。本研究通過在CKD 小鼠模型中干擾lncRNA Hotair 的表達(dá),以探究其在腎臟纖維化中的作用及機(jī)制,為尋找新的腎臟纖維化治療方法提供參考。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠36 只,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠予12 h光照-12 h黑夜循環(huán),自由飲食和飲水,隔日換墊料。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(批準(zhǔn)文號(hào):2017KT041)。

    1.2 試劑和儀器 RNA 提取試劑盒(貨號(hào):AG21024)購(gòu)自中國(guó)艾科瑞生物公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):R333)購(gòu)自南京諾唯贊公司;qRT-PCR 試劑盒(貨號(hào):RK21203)購(gòu)自武漢ABclonal 公司。SUZ12(貨號(hào):ab175187,兔抗)、LSD1(貨號(hào):ab129195,兔抗)、EZH2(貨號(hào):ab307646,兔抗)、EED(貨號(hào):ab240650,兔抗)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)(貨號(hào):ab5831,兔抗)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)(貨號(hào):ab231303,兔抗)、膠原蛋白1A1(collagen Ⅰα1,COL1A1)(貨號(hào):ab260043,兔抗)、膠原蛋白4A1(collagen Ⅳα1,COL4A1)(貨號(hào):ab6586,兔抗)抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(貨號(hào):AF7021,兔抗)和羊抗兔二抗(貨號(hào):S0001)均購(gòu)自美國(guó)Affinity 公司;肌酐檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):EKF60677)購(gòu)自加拿大Biomatik 公司;尿素氮檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):BC1535)購(gòu)自中國(guó)索萊寶公司。Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司;VeritiPro PCR 儀和ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems 公司;DM IL LED 倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica 公司;FluorChem E 成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Techne公司。

    1.3 方法

    1.3.1 模型制備、分組與處理 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、CKD 組、CKD+短發(fā)夾RNA-對(duì)照(hort hairpin RNA-control,sh-Ctrl)組、CKD+短發(fā)夾RNA-Hotair(short hairpin RNA-Hotair,sh-Hotair)組4 組,每組9 只。對(duì)照組喂食正常飼料,CKD 組、CKD+sh-Ctrl 組、CKD+sh-Hotair 組均予0.2%腺嘌呤飼料喂養(yǎng)造模,造模6 周后進(jìn)行下一步處理。CKD+sh-Ctrl 組和CKD+sh-Hotair 組分別予尾靜脈注射100 μL(1011基因拷貝)包裝了對(duì)照shRNA 和HotairshRNA 的腺相關(guān)病毒,對(duì)照組和CKD 組予尾靜脈注射100 μL 0.9%氯化鈉注射液。

    1.3.2 標(biāo)本留取 小鼠造模6 周后開始每周測(cè)量1 次體重,觀察8 周后予水合氯醛麻醉,經(jīng)心臟取血0.8~1.0 mL,室溫析出血清后,3 000 r/min 離心10 min,取上層血清。頸椎脫位法處死小鼠后進(jìn)行解剖,迅速取出小鼠腎臟,去除腎包膜。取1/4 腎組織清洗后以4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后切片行后續(xù)HE 染色和Masson 染色。取1/4 腎組織,將腎皮質(zhì)液氮冷凍研磨提取RNA。另1/2 腎組織,取腎皮質(zhì)保存于-80 ℃冰箱提取蛋白行后續(xù)檢測(cè)。

    1.3.3 肌酐水平檢測(cè) 根據(jù)肌酐檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行如下操作:配置標(biāo)準(zhǔn)品,加入酶標(biāo)板。取5 μL 小鼠血清加入待測(cè)樣品孔中。每孔加入225 μL 酶A 溶液,混合均勻后于37 ℃孵育5 min,酶標(biāo)儀讀取546 nm處的吸光度A1。每孔加入75 μL 酶B 溶液,37 ℃孵育5 min,酶標(biāo)儀讀取546 nm處的吸光度A2。肌酐水平(μmol/L)=樣品(A2-A1)/標(biāo)準(zhǔn)品(A2-A1)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

    1.3.4 尿素氮水平檢測(cè) 根據(jù)尿素氮檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行如下操作:配置尿素氮標(biāo)準(zhǔn)品,將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)血清樣品加入離心管,分別加入試劑一60 μL 和試劑二110 μL,混勻后于37 ℃孵育10 min。隨后每孔加入試劑三120 μL 和試劑四90 μL,混勻后于37 ℃孵育30 min,加入蒸餾水90 μL。從上述反應(yīng)液中吸取200 μL于酶標(biāo)板測(cè)定630 nm 處吸光度。根據(jù)試劑盒提供公式計(jì)算尿素氮水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,取平均值。

    1.3.5 Hotair 及PRC2 復(fù)合物(EZH2、SUZ12、EED)、LSD1 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR 法。取腎皮質(zhì)按照RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取RNA,使用NanoDrop 測(cè)定RNA 的濃度與純度。此后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用qRT-PCR 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)Hotair 及其他基因的表達(dá),以GAPDH 為內(nèi)參。 反應(yīng)體系為:2×SYBR Green Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 7.2 μL,共20 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min,隨后95 ℃5 s 變性,60 ℃30 s 擴(kuò)增,共循環(huán)40 次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Hotair及其他基因mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

    表1 引物序列

    1.3.6 PRC2 復(fù)合物、LSD1 及腎皮質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白COL1A1、COL4A1、α-SMA 和E-cadherin 表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 法。取保存的腎皮質(zhì)稱量后加入裂解液,冰上超聲破碎組織,13 000 r/min 離心5 min,取上清液行BCA 蛋白定量。以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳法分離目的蛋白,300 mA 恒流下轉(zhuǎn)膜90 min至聚偏二氟乙烯膜,3%BSA 封閉1 h 后按說(shuō)明書稀釋倍數(shù)加入對(duì)應(yīng)的SUZ12、LSD1、EZH2、EED、α-SMA、E-cadherin、COL1A1、COL4A1 和GAPDH 抗體,4 ℃過夜孵育。洗滌3 次后于相應(yīng)的二抗中孵育1 h 后再次洗滌3 次,隨后進(jìn)行顯影,得到對(duì)應(yīng)條帶,并使用Image J 軟件評(píng)估各個(gè)泳道的灰度值。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=各組灰度值/對(duì)照組平均灰度值。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 干擾lncRNA Hotair 對(duì)CKD 小鼠體重與腎功能的影響 與對(duì)照組比較,CKD 組和CKD+sh-Ctrl 組小鼠的體重隨年齡增長(zhǎng)顯著降低,血清肌酐和尿素氮水平均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。與CKD+sh-Ctrl 組比較,CKD+sh-Hotair 組小鼠體重有明顯升高(均P<0.01),但仍低于對(duì)照組;血清肌酐和尿素氮水平均降低(均P<0.01),但仍高于對(duì)照組,見圖1。

    圖1 干擾lncRNA Hotair 對(duì)CKD 小鼠體重與腎功能的作用(A:4 組小鼠體重的變化;B:4 組小鼠肌酐水平比較;C:4 組小鼠尿素氮水平比較)

    2.2 干擾lncRNA Hotair 對(duì)CKD 小鼠模型腎臟形態(tài)及組織學(xué)的影響 與對(duì)照組比較,CKD 組小鼠腎臟明顯萎縮,而CKD+sh-Hotair 組小鼠的腎臟大小及形態(tài)有明顯改善,見圖2A(插頁(yè))。HE 染色和Masson 染色顯示CKD 組小鼠腎組織部分小管擴(kuò)張,腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),腎間質(zhì)纖維化,而CKD+sh-Hotair 組較CKD+sh-Ctrl 組明顯改善,見圖2B-C(插頁(yè))。

    圖2 干擾lncRNA Hotair 對(duì)CKD 小鼠模型腎臟形態(tài)及組織學(xué)的影響(A:4 組小鼠腎臟形態(tài);B:4 組小鼠腎臟HE 染色;C:4 組小鼠腎臟Masson 染色)

    2.3 4 組小鼠腎皮質(zhì)lncRNA Hotair 表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較,CKD 組小鼠腎皮質(zhì)lncRNA Hotair 表達(dá)水平升高(P<0.01)。與CKD+sh-Ctrl 組比較,CKD+sh-Hotair 組小鼠腎皮質(zhì)lncRNA Hotair 表達(dá)水平降低(P<0.01),敲低效果滿意,見圖3。

    圖3 4 組小鼠腎皮質(zhì)lncRNA Hotair 表達(dá)水平比較

    2.4 干擾lncRNA Hotair對(duì)腎皮質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,CKD 組小鼠腎皮質(zhì)COL1A1、COL4A1、α-SMA 蛋白表達(dá)水平均升高,而E-cadherin蛋白表達(dá)水平下降。與CKD+sh-Ctrl 組比較,CKD+sh-Hotair 組小鼠腎皮質(zhì)COL1A1、COL4A1、α-SMA 蛋白表達(dá)水平均下降,E-cadherin 蛋白表達(dá)水平恢復(fù),見圖4。

    圖4 干擾lncRNA Hotair 對(duì)腎皮質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

    2.5 干擾lncRNA Hotair 對(duì)PRC2 復(fù)合物和LSD1 的影響 與對(duì)照組比較,CKD 組小鼠腎皮質(zhì)LSD1、EZH2、EED mRNA 和蛋白表達(dá)水平均升高,而SUZ12 mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。與CKD+sh-Ctrl 組比較,CKD+sh-Hotair 組小鼠腎皮質(zhì)LSD1、EZH2、EED mRNA 和蛋白表達(dá)水平均降低,SUZ12 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),見圖5。

    圖5 干擾lncRNA Hotair 對(duì)PRC2 和LSD1 的影響(A:4 組小鼠腎皮質(zhì)SUZ12 mRNA 表達(dá)水平比較;B:4 組小鼠腎皮質(zhì)LSD1 mRNA表達(dá)水平比較;C:4 組小鼠腎皮質(zhì)EZH2 mRNA 表達(dá)水平比較;D:4 組小鼠腎皮質(zhì)EED mRNA 表達(dá)水平比較;E:4 組小鼠腎皮質(zhì)SUZ12、LSD1、EZH2、EED 蛋白表達(dá)的電泳圖)

    3 討論

    lncRNA 是一類長(zhǎng)度超過200 nt 的非編碼RNA 分子,通過介導(dǎo)染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白的翻譯和翻譯后的蛋白修飾等發(fā)揮作用[9]。目前已發(fā)現(xiàn)多種lncRNA 參與調(diào)控糖尿病腎病[10-11]、間質(zhì)性腎炎[12]、急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)[13]等疾病的腎臟纖維化過程。lncRNA Hotair 在多種癌癥[14-15]和心臟[16]、肝臟纖維化[5]中表達(dá)上調(diào),已被證明是一種潛在的治療靶點(diǎn),但是其在腎臟纖維化中的作用仍有待進(jìn)一步探索。

    本研究構(gòu)建了腺嘌呤誘導(dǎo)的CKD 小鼠模型[17],發(fā)現(xiàn)Hotair 表達(dá)上調(diào),與Zhou 等[18]在UUO 小鼠模型中發(fā)現(xiàn)Hotair 表達(dá)上調(diào)相一致。通過尾靜脈注射腺相關(guān)病毒敲低Hotair,腎纖維化病理及生化指標(biāo)均顯著改善,且可減少細(xì)胞外基質(zhì)蛋白COL1A1、COL4A1 和α-SMA的表達(dá),說(shuō)明其在腎纖維化過程中發(fā)揮重要作用。

    此前研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳修飾在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用[6]。PRC2 是一種重要的染色質(zhì)修飾復(fù)合物,由包括EED、SUZ12、EZH2 的核心亞基及其他輔助因子組成[7]。PRC2 可以在組蛋白H3 的27 位賴氨酸上沉積一個(gè)或多個(gè)甲基(分別為H3K27me1、H3K27me2和H3K27me3),并通過適當(dāng)?shù)幕虺聊瑏?lái)發(fā)揮功能[7]。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Hotair 可招募PRC2 至靶基因,從而通過促進(jìn)甲基化使基因沉默[14]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Hotair 的5'端與PRC2 結(jié)合,而3'端與LSD1 結(jié)合,從而作為分子支架協(xié)調(diào)PRC2 和LSD1 靶向染色質(zhì),偶聯(lián)組蛋白H327位賴氨酸甲基化和4 位賴氨酸去甲基化[8]。EZH2 在糖尿病腎病[19-20]、高尿酸誘導(dǎo)的CKD 腎臟纖維化[21]中發(fā)揮重要作用。EZH2 在UUO 小鼠模型和CKD 患者培養(yǎng)的腎成纖維細(xì)胞中高表達(dá),可通過下調(diào)Smad7 和PTEN的表達(dá)激活促纖維化信號(hào)通路[22]。在AKI 向CKD 轉(zhuǎn)變的過程中,抑制EZH2 可減輕EMT 并阻斷M2 巨噬細(xì)胞極化來(lái)改善AKI 后腎臟纖維化[23]。本研究發(fā)現(xiàn)EZH2、EED、LSD1 在腺嘌呤誘導(dǎo)的CKD 小鼠腎組織中也高表達(dá),與其他研究結(jié)果一致,并且敲低Hotair 能部分抑制其表達(dá)并緩解腎臟纖維化,說(shuō)明Hotair 可能通過其分子支架作用調(diào)控表觀遺傳修飾在CKD 纖維化進(jìn)程中發(fā)揮作用。

    綜上所述,lncRNA Hotair 在CKD 小鼠模型中表達(dá)升高,敲低Hotair 可緩解腎臟纖維化,可能與Hotair 作為PRC2 和LSD1 的分子支架介導(dǎo)的表觀遺傳修飾相關(guān),本研究為腎臟纖維化的治療提供了新的思路和潛在靶點(diǎn)。

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