褪黑素調(diào)控自噬抑制肝星狀細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究

陳滌非,揭 磊,黃啟鳴,徐德祥,任曉非,洪汝濤

肝纖維化( hepatic fibrosis,HF)是各類致病因素引起肝臟損傷-修復(fù)反應(yīng)的結(jié)果,其主要病理改變?yōu)楦蝺?nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過度沉積,是多種慢性肝病向肝硬化進(jìn)展的共同基礎(chǔ)[1]。研究[2]表明,活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)在HF發(fā)展的進(jìn)程中起到舉足輕重的作用。研究[3]表明,血小板源性生長因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)是較強(qiáng)致炎因子之一,在HSCs激活中起重要作用。在這一過程中,溶酶體發(fā)揮積極作用[4]。有文獻(xiàn)[5]提示,自噬在HF進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,但其具體機(jī)制還不清楚。HF作為肝病發(fā)展的共同通路,逆轉(zhuǎn)HF是至關(guān)重要的,如果通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬,減少HSCs活化,增強(qiáng)對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)和再生,就可以減緩病程甚至逆轉(zhuǎn)HF。該課題組前期研究表明,在肝組織中,褪黑素(melatonin,MEL)可以抑制自噬從而減輕HF[6]。目前自噬與HSCs增殖關(guān)系及MEL對(duì)其抑制作用除該課題組外尚未見報(bào)道,該研究將進(jìn)一步研究MEL抑制HSCs增殖與抑制自噬水平的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑HSC T-6(永生系細(xì)胞,武漢普諾賽公司);DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(杭州四季青生物有限公司);PDGF-BB(美國PeproTech公司);抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3b(microtubule-associated protein 1 light chain-3b,LC3b)抗體、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)兔抗鼠單克隆抗體、抗β-actin抗體(美國Abcam公司);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)、青霉素、鏈霉素、胰酶消化酶、雙重縮氨酸法(bicinchoninic acid assay,BCA)試劑盒、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);MEL(美國Sigma公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting Kit-8,CCK-8)、山羊抗小鼠辣根酶標(biāo)記IgG(H+L)、4%多聚甲醛、1%四氧化鋨(合肥Biosharp生物科技公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞株復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至70%～80%融合后傳代,取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)用3～4代細(xì)胞,共設(shè)置5組:對(duì)照組、模型組、MEL(低、中、高劑量)處理組。HSCs接種于96孔培養(yǎng)板(濃度5×104/L),每孔設(shè)6個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁,約70%～80%細(xì)胞融合,換用無血清的DMEM培養(yǎng)基,以使細(xì)胞同步化于G0期,再培養(yǎng)24 h后除對(duì)照組外各組加入PDGF-BB(終濃度10 ng/ml)、MEL處理組加入MEL(低劑量組為 1 nmol/L,中劑量組為1 μmol/L,高劑量組為0.1 mmol/L),孵育48 h后加入CCK-8(10 g/L)20 μl,繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)2 h,小心吸棄培養(yǎng)液。酶標(biāo)儀測波長為570 nm處的吸光度(A)值。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)同上述CCK-8分組,將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞長至單層80%左右時(shí),同步化處理,各分組加入處理因素(PDGF-BB和MEL,濃度同CCK-8),培養(yǎng)48 h,小心吸棄培養(yǎng)液,加入PBS反復(fù)吹打細(xì)胞至細(xì)胞基本脫落,離心(650 r/min,5 min),棄去上清液,加入細(xì)胞裂解液并反復(fù)吹打細(xì)胞使細(xì)胞與裂解液充分混勻,靜置30 min離心,提取總蛋白。蛋白定量后每組上樣10 μg,進(jìn)行12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜封閉。將一抗稀釋至所需濃度(兔抗鼠LC3b 1 ∶2 000、兔抗鼠α-SMA 1 ∶1 000、 β-actin 1 ∶3 000),4 ℃孵育過夜。洗膜3次后,加入二抗,將其濃度稀釋至1 ∶8 000,洗脫二抗,ECL發(fā)光顯色。同時(shí)檢測β-actin表達(dá)作為內(nèi)參。拍照掃描后Image J圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析,計(jì)量以平均吸光度值×面積來表示,以LC3 b/內(nèi)參β-actin的灰度值比值作為相對(duì)表達(dá)量。

1.5 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)同上述CCK-8分組,將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,融合度為80%左右時(shí)同步化處理24 h后分別加入各處理因素(PDGF-BB和MEL,濃度同CCK-8)培養(yǎng)48 h后使用TRIzol試劑提取HSCs總RNA,用紫外分光光度法測定RNA水平,A260/A280鑒定RNA純度。分別提取1 μg總RNA,經(jīng)RNA反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄體系:MgCl225 mmol/L 2.2 μl,10×PCR Buffer II 1.0 μl,dNTP 10 mmol/L 2.0 μl,Oligo(dt)18 50 μmol/L 0.5 μl, RNase Inhibiter 20 U/μl 0.25 μl,RNase-free H2O 1.85 μl,50 ng/μl RNA 2.0 μl,總體積 10 μl。反轉(zhuǎn)錄條件:25 ℃ 10 min, 48 ℃ 60 min, 95 ℃ 5 min,以此為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)系統(tǒng)采用SYBRG,按操作程序進(jìn)行,反應(yīng)總體系為20 μl,反應(yīng)條件為50 ℃ 120 s,1個(gè)循環(huán);95 ℃ 600 s,1個(gè)循環(huán);55 ℃ 15 s,40個(gè)循環(huán)。60 ℃ 60 s,標(biāo)記熒光,得出各樣本的初始拷貝數(shù)。所用引物序列為:LC3b,上游 CCCAGACATCAGGGAGTAATGG,下游 TCTATCGGATACTTCAGCGTCA;GAPDH,上游CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT,下游 AGCCTTC-TCCATGGTGGTGAAGAC;α-SMA,上游 CCCAGACA-TCAGGGAGTAATGG,下游 TCTATCGGATACTTCA-GCGTCA。實(shí)驗(yàn)過程中以GAPDH內(nèi)參基因作為實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的質(zhì)控。每組樣本一式2份,在指數(shù)期內(nèi)設(shè)定參數(shù)值,得到每個(gè)PCR反應(yīng)的循環(huán)域(cyclethreshold, Ct)值,即模板cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后達(dá)到某一熒光強(qiáng)度的循環(huán)次數(shù)。以每例細(xì)胞的目的片段與含內(nèi)參抗體片段的Ct值作為該標(biāo)本基因表達(dá)的相對(duì)數(shù)值,以對(duì)照組的表達(dá)量為100%計(jì)算其余各組的表達(dá)量。

1.6 透射電鏡觀察HSCs的超微結(jié)構(gòu)同上述 CCK-8分組,將生長狀態(tài)良好的HSCs均勻接種于6孔板中。融合度為80%左右時(shí)同步化處理24 h后分別加入各處理因素(PDGF-BB和MEL,濃度同CCK-8)培養(yǎng)48 h。干預(yù)完成后,各組細(xì)胞分別按細(xì)胞傳代培養(yǎng)的方法將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。1 000 r/min離心5 min,使細(xì)胞沉淀到離心管底部。棄掉上清液PBS,洗滌后加入4%多聚甲醛固定液固定 2 h。1 000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞,棄掉多聚甲醛固定液,留取細(xì)胞沉淀。沿著離心管的壁用勾針輕輕的把離心沉淀的細(xì)胞團(tuán)勾離管壁,加入1%四氧化鋨進(jìn)行處理。勾針輕輕取出細(xì)胞團(tuán),小心切成約1 mm3的小塊。脫水包埋浸透4 h。對(duì)固化的細(xì)胞小塊進(jìn)行超薄切片,厚度70 nm。枸櫞酸鉛染色。通過透射電鏡(Talos L120C G2美國賽默飛公司)觀察HSCs超微結(jié)構(gòu),每組內(nèi)每個(gè)樣本挑選3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù),以圖片下方2 μm標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn),統(tǒng)計(jì)每張圖片內(nèi)自噬溶酶體個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 MEL對(duì)PDGF-BB激活的HSCs細(xì)胞增殖的影響結(jié)果顯示:與對(duì)照組比較,PDGF-BB促進(jìn)模型組HSCs活化、增殖(P<0.01);與模型組比較,MEL可以抑制HSCs增殖(P<0.01)。見表1。

表1 MEL對(duì)激活的HSCs增殖的影響

2.2 MEL對(duì)PDGF-BB激活的HSCs LC3b蛋白的影響Western blot結(jié)果顯示模型組HSCs中LC3b蛋白表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組明顯增加(P<0.05);相對(duì)于模型組,在MEL干預(yù)的處理組中,LC3b蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 MEL對(duì)LC3b蛋白表達(dá)的影響

2.3 MEL對(duì)PDGF-BB激活的HSCs α-SMA蛋白的影響Western blot結(jié)果顯示模型組HSCs中α-SMA蛋白表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組明顯增加(P<0.05);相對(duì)于模型組,在MEL干預(yù)的處理組中,α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05;P<0.01)。見圖2。

圖2 MEL對(duì)α-SMA蛋白表達(dá)的影響

2.4 MEL對(duì)PDGF-BB激活的HSCs LC3b mRNA表達(dá)水平的影響qRT-PCR結(jié)果顯示模型組HSCs中LC3b mRNA表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組顯著增加(P<0.01);相對(duì)于模型組,在MEL干預(yù)的處理組中,LC3b mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 MEL對(duì)LC3b mRNA表達(dá)的影響

2.5 MEL對(duì)PDGF-BB激活的HSCs α-SMA mRNA

表達(dá)水平的影響qRT-PCR結(jié)果顯示模型組HSCs中α-SMA mRNA表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組明顯增加(P<0.05);相對(duì)于模型組,在MEL干預(yù)的處理組中α-SMA mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 MEL對(duì)α-SMA mRNA表達(dá)的影響

2.6 MEL對(duì)PDGF-BB激活的HSCs自噬溶酶體的影響圖5A雙核膜結(jié)構(gòu)清晰,核周隙正常,核內(nèi)染色質(zhì)未見明顯凝集。胞質(zhì)內(nèi)可見少量自噬溶酶體。圖5B雙核膜結(jié)構(gòu)清晰,核周隙正常,核內(nèi)染色質(zhì)未見凝集,胞質(zhì)內(nèi)可見大量自噬溶酶體。圖5C雙核膜結(jié)構(gòu)清晰,核周隙正常,核內(nèi)染色質(zhì)可見輕度邊集化。胞質(zhì)內(nèi)可見少量自噬溶酶體。圖5D雙核膜結(jié)構(gòu)清晰,核周隙正常,核內(nèi)染色質(zhì)未見明顯凝集,胞質(zhì)內(nèi)自噬溶酶體數(shù)量顯著降低。

圖5 各組HSCs超微結(jié)構(gòu) ×50 000

透射電鏡結(jié)果顯示模型組HSCs中自噬溶酶體相對(duì)于對(duì)照組明顯增加(P<0.05);相對(duì)于模型組,在MEL(1 μmol/L; 0.1 mmol/L)干預(yù)的處理組中自噬溶酶體顯著減少(P<0.01),與模型組比較,MEL(1 nmol/L)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6。

圖6 MEL對(duì)自噬溶酶體數(shù)量表達(dá)的影響

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝病引起的病理過程,肝硬化是HF的最終結(jié)局,并伴隨多種并發(fā)癥及肝功能紊亂,具有很高的病死率[6]。近年來,相關(guān)研究[7]表明,HF甚至是早期肝硬化是可以逆轉(zhuǎn)的。相關(guān)研究[8]表明,HSCs是ECM形成的主要來源,且HSCs激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞是HF發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。HSCs的激活伴有NF-kb轉(zhuǎn)錄因子的激活及cymb基因表達(dá)增強(qiáng),而cymb蛋白可結(jié)合α-SMA基因調(diào)控區(qū),表達(dá)α-SMA。所以α-SMA作為HSCs活化的主要標(biāo)志物,與HSCs活化的程度及數(shù)量呈正相關(guān)[9]。CCK-8實(shí)驗(yàn)?zāi)壳笆且环N方便、快速和準(zhǔn)確的細(xì)胞代謝活性評(píng)估工具,可以用于定量評(píng)估細(xì)胞增殖和存活率。該實(shí)驗(yàn)采用HSC-T6進(jìn)行體外培養(yǎng),用PDGF-BB激活HSCs,通過CCK-8和有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),從細(xì)胞和分子水平表明,HSCs數(shù)量和活性明顯增強(qiáng),HSCs α-SMA蛋白質(zhì)、mRNA表達(dá)水平明顯增高,說明PDGF-BB已活化HSCs,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。

自噬是真核細(xì)胞中廣泛存在的一種代謝過程。正常細(xì)胞中,胞內(nèi)衰老的細(xì)胞器及其他結(jié)構(gòu)被自噬體吞噬并轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體進(jìn)行β氧化,提供能量。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)/Atg8是目前研究中被最廣泛使用的分子標(biāo)志物。它參與了自噬體膜的形成,包括可相互轉(zhuǎn)化的兩種形式LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ。新合成的LC3經(jīng)過加工形成可溶形式的LC3 I,后者經(jīng)過泛素化加工修飾,與自噬體膜結(jié)合,成為膜結(jié)合形式的LC3 Ⅱ[10]。因而LC3 Ⅱ的含量或者LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比例與自噬體的數(shù)量呈正相關(guān),在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性。自噬的關(guān)鍵是自噬小體的形成,在透射電鏡觀察到自噬小體結(jié)構(gòu)是檢測自噬的金標(biāo)準(zhǔn)。

研究[1]表明,自噬與HF發(fā)生發(fā)展有關(guān),但其與HSCs關(guān)系不甚清楚。正常情況下,HSCs處于靜息或者未激活狀態(tài),胞質(zhì)中聚集著包含視黃醇和三酰甘油的脂滴[9]。當(dāng)存在損傷因子的刺激時(shí),HSCs中的脂滴會(huì)被自噬過程所識(shí)別,隨之被溶酶體降解,釋放游離脂肪酸[11],后者為HSCs轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞提供能量來源,進(jìn)而釋放促纖維化因子,如α-SMA和膠原蛋白[4]。上述研究表明脂滴的降解與HSCs的激活有密切的關(guān)系。有體內(nèi)研究[12]表明,抑制自噬可以引起脂滴在HSCs胞質(zhì)內(nèi)聚集,HSCs處于沉默狀態(tài),并且能減弱HF。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PDGF-BB處理后活化的HSCs LC3b蛋白質(zhì)、mRNA表達(dá)水平明顯增高,初步說明HSCs自噬水平上調(diào)。進(jìn)一步采用透射電鏡對(duì)PDGF-BB激活的HSCs進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)分析,顯示其自噬溶酶體數(shù)量顯著增加,提示PDGF-BB激活的HSCs自噬水平明顯上調(diào)。

MEL是一種具有多種生理功能的內(nèi)源性激素,特別是其抗氧化作用,已被證明能夠通過調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路來抑制HF的發(fā)展,包括影響ECM的合成和降解[13]。該課題組前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[6]表明MEL能抑制肝纖維化,同時(shí)下調(diào)自噬水平。在此基礎(chǔ)上,該研究進(jìn)一步探討在PDGF-BB激活的HSCs中,MEL抑制HSCs增殖與抑制自噬水平是否相關(guān)。該研究結(jié)果顯示,PDGF-BB處理的HSCs中,細(xì)胞增殖和活性明顯增強(qiáng), α-SMA、LC3b蛋白質(zhì)、mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體數(shù)量明顯增加,說明PDGF-BB能活化HSCs,同時(shí)上調(diào)自噬水平,而經(jīng)MEL處理后,HSCs增殖被抑制,其內(nèi)α-SMA、LC3b蛋白質(zhì)、mRNA表達(dá)水平明顯下降,HSCs內(nèi)自噬溶酶體數(shù)量顯著減少,說明MEL能抑制HSCs活化且下調(diào)其自噬水平。因此,MEL可以抑制HSCs的活化,其機(jī)制可能與MEL下調(diào)HSCs的自噬水平相關(guān),這為治療HF提供了新的臨床思路。但該實(shí)驗(yàn)僅為初步研究,有待于進(jìn)一步深入研究。研究[14]表明自噬參與HF的通路主要有TGF-β1/Smads通路,P13K/AKT/mTOR信號(hào)通路,RAF/MEK/ERK信號(hào)通路,但其確切的作用和功能機(jī)制有待進(jìn)一步研究。