城市與山村青少年腸道菌群及其代謝組學(xué)差異的研究

沈續(xù)航,蘇時(shí)雨,關(guān) 靜,沈繼龍,陳 熙

人體腸道內(nèi)存在大約100萬(wàn)億個(gè)微生物,包括細(xì)菌、真菌和寄生蟲等,遠(yuǎn)超人體自身的細(xì)胞總和。其中細(xì)菌為主要組成部分,主要存在于結(jié)腸尤其是結(jié)腸末端。它們與人體構(gòu)成一個(gè)精密協(xié)調(diào)、動(dòng)態(tài)平衡的生態(tài)系統(tǒng),在調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)、參與能量代謝、維持腸黏膜細(xì)胞形態(tài)和功能上發(fā)揮重要作用[1]。早在1980年改革開放初期,中國(guó)城鎮(zhèn)化水平只有19.4%,至2019年已超過(guò)60%[2]。隨著中國(guó)城鎮(zhèn)化水平的提升以及工業(yè)化的發(fā)展,城鎮(zhèn)青少年的飲食習(xí)慣和生活環(huán)境也發(fā)生了巨大變化。而腸道菌群的結(jié)構(gòu)與飲食習(xí)慣、生活環(huán)境等密切相關(guān)。大量的研究[3]表明,不健康的生活習(xí)慣可通過(guò)腸道菌群的失調(diào)而影響機(jī)體的內(nèi)穩(wěn)態(tài),增加慢性疾病的發(fā)病率。雖然近年來(lái)腸道菌群與健康/疾病的關(guān)系研究較多,然而有關(guān)在校青少年學(xué)生,尤其是中國(guó)城市和山村中學(xué)生菌群的特征、差異及其意義尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。該研究旨在分析城市和山村中學(xué)生腸道菌群及代謝產(chǎn)物的差異,揭示人體在生命早期建立健康的內(nèi)穩(wěn)態(tài)將直接影響其成年后的健康狀態(tài)或患病風(fēng)險(xiǎn),警示城市青少年應(yīng)通過(guò)調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)、合理提高運(yùn)動(dòng)量來(lái)改善腸道菌群結(jié)構(gòu)從而保持健康的身體、降低相關(guān)慢性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 病例資料合肥市蜀山區(qū)第五十中學(xué)東校八年級(jí)學(xué)生,隨機(jī)選取14例。學(xué)生均為合肥市區(qū)出生并入學(xué),所有的學(xué)生均無(wú)本市以外居住史。另外,在宣城市績(jī)溪縣伏嶺中心學(xué)校選擇八年級(jí)學(xué)生18例,學(xué)生均在當(dāng)?shù)厣酱宄錾⑷雽W(xué),無(wú)城市居住史。納入標(biāo)準(zhǔn):① 年齡13～14歲;② 既往無(wú)胃腸病史。排除標(biāo)準(zhǔn):① 近3個(gè)月內(nèi)服用過(guò)抗生素或益生菌;② 近1年內(nèi)有非居住地旅居史。

1.2 樣品收集晨起8:00左右,用無(wú)菌勺挑取排出的新鮮糞便1.0 g,一次性無(wú)菌糞便采集塑料杯儲(chǔ)存,每份標(biāo)本標(biāo)記姓名、年齡、性別置于干冰中轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 腸道菌群16S rDNA基因測(cè)序使用 MagPure Soil DNA LQ Kit基因組DNA抽提試劑盒,提取研究個(gè)體的糞便樣品DNA。針對(duì)16S rDNA基因的V3-V4高可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,上游引物為343F(5′- TACGGRAGGCAGCAG -3′)、下游引物為798R(5′- AGGGTATCTAATCCT-3′)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)AMPure XP beads純化后送上海歐易公司進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.4 LC/MS非靶向代謝產(chǎn)物檢測(cè)取出凍存的腸道內(nèi)容物樣本約60 mg裝入管中,加入內(nèi)標(biāo)(L-2-氯苯丙氨酸)20 μl,加入650 μl甲醇-水(4 ∶1)用研磨機(jī)進(jìn)行研磨;冰水浴超聲提取,-20 ℃靜置;離心(13 000 r/min,4 ℃),裝入200 μl上清液于LC-MS進(jìn)樣小瓶中揮干;用300 μl甲醇-水(1 ∶4)復(fù)溶;-20 ℃下靜置;離心(13 000 r/min,4 ℃),取150 μl的上清液-80 ℃下保存,以待后續(xù)LC- MS分析。將所有樣本的提取液等體積混合用作質(zhì)控樣本。所有提取試劑使用前均在-20 ℃進(jìn)行預(yù)冷。ACQUITY UPLC I-Class plus超高效液相串聯(lián)QE高分辨質(zhì)譜儀組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)作為分析儀器。色譜條件,色譜柱:ACQUITY UPLC HSS T3 (100.0 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱溫:45 ℃;流速:0.35 mL/min;進(jìn)樣量:2 μl;流動(dòng)相: A-水(含0.1%甲酸),B-乙腈(含0.1%甲酸)。

1.5 16S rDNA測(cè)序分析原始數(shù)據(jù)為FASTQ格式,對(duì)樣品進(jìn)行去雜和去除序列中的嵌合體序列,Vsearch軟件將相似度≥97%的序列歸為一個(gè)操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs),物種比對(duì)注釋由RDP classifier軟件操作完成。之后,采用偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)對(duì)兩組的樣本結(jié)果進(jìn)行組與組之間相似性分析。用R軟件分析腸道菌群α多樣性、β多樣性及兩地中學(xué)生的腸道優(yōu)勢(shì)菌屬。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用R語(yǔ)言和SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,正態(tài)定量資料采用t檢驗(yàn)或者ANOVA檢驗(yàn),非正態(tài)定量資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。組間腸道菌群α多樣性差異分析、菌群豐度差異分析使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)(非配對(duì))。組間腸道菌群β多樣性分析采用基于Bray-curtis距離矩陣的主成分分析(principal component analysis,PCA)。代謝組學(xué)的分析中,使用PLS-DA和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)對(duì)不同組別的代謝物進(jìn)行分析,變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)值大于1、P<0.05的代謝物鑒定為組間差異代謝物。用Pearson相關(guān)系數(shù)衡量?jī)蓚€(gè)代謝物之間的線性相關(guān)程度。代謝通路的變化通過(guò)鑒定出的組間差異代謝物比對(duì)到京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)查詢,通路富集分析P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OTU水平的venn分析使用Vsearch軟件,對(duì)質(zhì)控得到的優(yōu)質(zhì)序列valid tags按照97%的相似度進(jìn)行OTU分類,繪制venn圖。兩組32個(gè)樣本共產(chǎn)生5 780個(gè)OTU;其中2組共有的OTU為3 915個(gè),城市與山村青少年特有的OTU分別為783個(gè)和1 082個(gè)。見圖1。

圖1 不同分組糞便樣本在OTU水平上的venn分組

2.2 Alpha多樣性、Beta多樣性分析通過(guò)Wilcoxont檢驗(yàn)、PCA對(duì)山村青少年腸道菌群多樣性進(jìn)行分析,兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1和圖2。

表1 不同組別多樣性指標(biāo)分析比較

圖2 兩組中學(xué)生糞便菌群多樣性對(duì)比

2.3 菌群差異分析城鄉(xiāng)青少年腸道菌群在屬水平上的結(jié)構(gòu)有較大差異(圖3)。經(jīng)Wilcoxont檢驗(yàn)分析,差異較大的菌屬包括Lachnoclostridium(t=2.479,P<0.05)、糞厭氧棒狀桿菌(Anaerostipes)(t=3.028,P<0.05)、瘤胃球菌(RuminococcaceaeUCG-002)(t=-2.435,P<0.05)、巴恩斯菌(Barnesiella)(t=-2.109,P<0.05)和真桿菌(Eubacterium)(t=3.028,P<0.05)等。

圖3 兩組之間屬水平上的腸道菌群差異

2.4 多元分析代謝組差異為了探究城鄉(xiāng)中學(xué)生糞便代謝物之間的差異,對(duì)兩組用偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),結(jié)果顯示兩組間糞便代謝物差異明顯(圖4A)。R2X(cum):0.494;R2Y(cum):0.894;Q2(cum):0.214。利用火山圖可以對(duì)P值,可視化VIP和Fold Change值,篩選差異代謝產(chǎn)物(圖4B)。與城市青少年組對(duì)比紅色、藍(lán)色點(diǎn)代表山村青少年組中顯著上調(diào)、下調(diào)的差異代謝產(chǎn)物;灰色點(diǎn)代表差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)系數(shù)衡量2個(gè)代謝物之間的線性相關(guān)程度,紅色表示正相關(guān),藍(lán)色表示負(fù)相關(guān)(圖4C)。通過(guò)KEGG(https://www.kegg.jp)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索差異代謝物的相關(guān)代謝通路,基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析,山村中學(xué)生明顯高于城市中學(xué)生的代謝通路包括花生四烯酸代謝、血小板活化、5-羥色胺代謝、維生素的消化吸收、初級(jí)膽汁酸代謝(P<0.05)(圖4D)。

圖4 城鄉(xiāng)青少年腸道代謝產(chǎn)物以及其相關(guān)代謝通路差異

3 討論

城鄉(xiāng)兒童因飲食生活習(xí)慣、成長(zhǎng)環(huán)境上的差異導(dǎo)致?lián)碛胁煌哪c道菌群結(jié)構(gòu)。有報(bào)道[4]顯示,城市青少年與農(nóng)村青少年相比平均每人日膳食能量、脂肪和蛋白質(zhì)的攝入量與功能占比均較高,而碳水化合物攝入量及供能以及膳食纖維占比則較低。碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)三大營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入失衡與糖尿病、血脂異常、心腦血管疾病、腫瘤等慢性病的發(fā)生以及其并發(fā)癥密切相關(guān)。膳食脂肪的供能比過(guò)高會(huì)導(dǎo)致超重肥胖等相關(guān)慢性病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)加大[5]。有研究[4]表明腸道菌群的構(gòu)成結(jié)構(gòu)在3歲以后已經(jīng)與成人高度相似且相對(duì)穩(wěn)定。該研究從腸道菌群結(jié)構(gòu)以及代謝產(chǎn)物兩方面的差異來(lái)進(jìn)行分析,期望能夠更加全面清晰的反映生活飲食習(xí)慣、生活環(huán)境不同的兩組青少年人群腸道微生態(tài)的差異以及其導(dǎo)致的終末代謝產(chǎn)物的差異,對(duì)未來(lái)改善青少年腸道菌群結(jié)構(gòu),在預(yù)防因腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡而導(dǎo)致的慢性疾病中提供指導(dǎo)作用。

對(duì)兩組青少年糞便樣本進(jìn)行測(cè)序分析后顯示,城市青少年腸道菌群在屬水平上Lachnoclostridium和Anaerostipes等占優(yōu)勢(shì)。有研究[6]表明,Anaerostipes和Lachnoclostridium菌屬的某些菌種在抑郁癥患者的腸道菌群中占比增高,并且與色氨酸和5-羥色胺的代謝有關(guān),可能預(yù)示著城市青少年有更大的精神壓力,比山村青少年有更高的抑郁癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)Lachnoclostridium菌屬在動(dòng)脈粥樣硬化患者中顯著增加,它能夠?qū)⒛憠A有效地轉(zhuǎn)化為微生物三甲胺(microbial trimethylamine,TMA),TMA裂解酶通過(guò)裂解TMA產(chǎn)生氧化三甲胺促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[7]。更為重要的是Liang et al[8]近期調(diào)查研究了1 012例包括健康人群、結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌患者糞便標(biāo)本,結(jié)果顯示,Lachnoclostridium菌屬可作為非侵入性的結(jié)直腸腺瘤以及結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)志物。該研究表明該菌屬在城市青少年人群中占比明顯增高。有研究[9]表明腸道菌群中的特定菌屬可作為結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因素,且與疾病預(yù)后相關(guān)。該現(xiàn)象與城市人群結(jié)直腸癌發(fā)病率高于農(nóng)村相符合,且近年來(lái)結(jié)直腸癌病人逐漸年輕化[10],警示城市青少年應(yīng)養(yǎng)成良好的生活飲食習(xí)慣,注意預(yù)防篩查結(jié)直腸病變。

與城市學(xué)生不同的是,山村青少年腸道菌群在屬水平上以瘤胃球菌(RuminococcaceaeUCG-002)、巴恩斯菌(Barnesiella)、真桿菌(Eubacterium)等菌屬為優(yōu)勢(shì)菌。Ruminococcaceae作為益生菌參與次級(jí)膽汁酸的產(chǎn)生,缺乏該菌可能會(huì)導(dǎo)致患腸道炎癥的概率增加,影響宿主的免疫系統(tǒng)[11]。Eubacterium菌屬與鞘氨醇水平呈正相關(guān)。鞘氨醇的在維持宿主脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起重要作用。Eubacterium產(chǎn)生丁酸,丁酸是短鏈脂肪酸的重要成員。丁酸的缺乏會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸炎的發(fā)生與病理加重[12]。同時(shí)有研究[13]表明,Eubacterium豐度下降也與自閉癥、阿爾茨海默病等精神疾病密切相關(guān)。

該研究代謝組學(xué)結(jié)果顯示,與城市中學(xué)生相比,山村中學(xué)生在花生四烯酸代謝、血小板活化、5-羥色胺代謝、維生素的消化吸收、初級(jí)膽汁酸代謝等通路的表達(dá)顯著上調(diào)。其中花生四烯酸代謝可以通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路,刺激腸道上皮細(xì)胞的更新再生,在維持腸道上皮完整性以及預(yù)防結(jié)腸炎中發(fā)揮重要作用[14];5-羥色胺代謝可調(diào)節(jié)認(rèn)知與記憶能力[15];已知初級(jí)膽汁酸代謝參與了免疫調(diào)節(jié)并維持免疫穩(wěn)態(tài)[16]。

該研究雖然樣本量不大,但是屬于兩組正常人群的對(duì)比觀察,而非是作為疾病的對(duì)照。后續(xù)的研究正在進(jìn)行中,包括加大樣本量和完善相關(guān)信息,為揭示城鄉(xiāng)青少年腸道菌群與代謝產(chǎn)物差異以及維護(hù)在校青少年健康提供可靠的依據(jù)。