激活突變引發(fā)SHP2蛋白相分離對小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響及其機(jī)制

劉 嘉,戴媛娟,汪思應(yīng)

SHP2是由PTPN11基因編碼的非受體型酪氨酸磷酸酶,PTPN11的激活突變與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),除了非小細(xì)胞性肺癌[1]、乳腺癌[2]、血液系統(tǒng)腫瘤[3]等常見腫瘤外,在人類的橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RMS)中也發(fā)現(xiàn)了PTPN11的激活突變[4]。肉瘤是一種復(fù)雜的間葉腫瘤,其發(fā)生的潛在分子機(jī)制仍未完全明了,其中大部分原因是對其細(xì)胞起源缺乏共識,但現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明它們來源間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)[5]。與此同時,相分離作為一種與腫瘤發(fā)生相關(guān)的機(jī)制被越來越多地提及,它是指生物體內(nèi)的大分子物質(zhì)之間由于多價相互作用而聚集在一起,形成生物分子冷凝物的現(xiàn)象[6]。有研究[7]提示激活突變的SHP2蛋白會在細(xì)胞內(nèi)形成大量的生物分子冷凝物,然而激活突變SHP2蛋白的相分離與人類橫紋肌肉瘤的發(fā)生之間的聯(lián)系還有待探究。該研究構(gòu)建SHP2E76K突變的小鼠模型,探究激活突變引發(fā)的SHP2蛋白相分離對小鼠MSC增殖能力的影響及其機(jī)制,以期為肉瘤的診斷和治療尋找新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 本研究所用Ptpn11E76K-neo/+小鼠(C57BL/6J品系),由美國埃默里大學(xué)血液/腫瘤系的瞿成奎教授贈予, Mx1-cre(C57BL/6J品系)小鼠購自上海南方模式生物研究中心,于安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)。本研究對照組小鼠為Mx1-cre; Ptpn11+/+(C57BL/6J品系),實(shí)驗(yàn)組小鼠為Mx1-cre; Ptpn11E76K/+(C57BL/6J品系)。該研究的動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:LLSC20210807)。

1.1.2主要試劑 瓊脂糖粉末購自北京蘭杰柯科技有限公司;鼠尾鑒定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒購自成都福際生物技術(shù)有限公司;胎牛血清購自美國普諾賽公司;高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、低糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基均購自美國Gibico公司;細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞計數(shù)板均購自美國康寧公司;SHP2抗體、p-ERK抗體、ERK抗體、p-AMPK抗體、AMPK抗體、p-mTOR 抗體、m-TOR抗體均購自美國CST公司;β-actin抗體購自美國Proteintech公司;SHP099購自美國Selleck公司;ET070由中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所提供;預(yù)染蛋白分子量Marker購自美國賽默飛公司;細(xì)胞總蛋白裂解液、CCK-8試劑盒、二甲亞砜、PBS粉末均購自美國Sigma公司。

1.1.3主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Eppendorf公司,型號:Galaxy170S);正置顯微鏡(日本OLYMPUS公司,型號:TMT2-21);倒置顯微鏡(日本尼康公司,型號:ECLIPSE TS100);細(xì)胞計數(shù)儀(江蘇卓微生物科技有限公司,型號:JIMBIO CL);普通PCR儀(德國Biometra公司,型號:2506261);多功能酶標(biāo)儀(型號:Varioskan)、低溫冷凍離心機(jī)(型號:Heraeus Megafuge 16)(美國賽默飛公司);生物安全柜(美國Labconco公司,型號:Type A2); 化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(美國 BIO-RAD公司,型號:ChemiDoc MP);電泳儀(德國 Eppendorf公司,型號:Powerpac Basic Power Supply)

1.2 方法

1.2.1小鼠尾部組織基因組DNA的提取 子鼠1周齡時,將小鼠尾部組織剪取長約0.2 cm的小段于1.5 ml EP管中,在EP管中加入50 μl Buffer MP,2 μl Foregene Protease Plus,65 ℃金屬浴30 min,然后95 ℃水浴5 min,8 000 r/min離心5 min。

1.2.2PCR擴(kuò)增反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行的基因型鑒定 小鼠基因型鑒定引物序列: E76KNeo Forward,5′-TGGGAAGACAATAGCAGGCA-3′;E76KNeo Reverse,5′-CCCACTCACCTTGTCATGTA-3′; Mx1-cre Forward,5′-GACCAGGTTCGTTCACTC-3; Mx1-cre Reverse,5′- TAGCGCCGTAAATCAAT-3′。PCR反應(yīng)體系:2×PCR反應(yīng)緩沖液10 μl,前引物0.5 μl,后引物0.5 μl,超純水5 μl,DNA模板4 μl,總體積20 μl。PCR反應(yīng)程序:E76K擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?① 94 ℃、3 min;② 94 ℃、30 s;③ 55 ℃、30 s;④ 72 ℃、30 s;⑤ 72 ℃、5 min;⑥ 4 ℃保持。②～④為循環(huán)反應(yīng),循環(huán)數(shù)為32。Mx1-cre擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?① 94 ℃、3 min;② 94 ℃、30 s;③ 58 ℃、30 s;④ 72 ℃、60 s;⑤ 72 ℃、5 min;⑥ 4 ℃保持。②～④為循環(huán)反應(yīng),循環(huán)數(shù)為28。瓊脂糖凝膠電泳:瓊脂糖1.5 g,5×TAE緩沖液2 ml,雙蒸水98 ml,溴化乙啶(EB)5 μl,DNA 樣本10 μl,電泳電壓90 V,時間40 min,凝膠成像儀成像。

1.2.3Mx1-cre;Ptpn11E76K/+小鼠的獲得 取經(jīng)PCR鑒定的基因型Mx1-cre;Ptpn11E76K/+的小鼠,待其長至4周齡時按照20 μg/只的劑量腹腔注射pI-pC,每隔1 d注射1次,共3次,注射完成后30 d左右即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.4原代骨髓MSC的分離 取基因型為Mx1-cre;Ptpn11+/+和Mx1-cre;Ptpn11E76K/+的雄性小鼠,脫頸處死后放入75%的乙醇中消毒10 min,在生物安全柜內(nèi),按照無菌操作原則分離其股骨和脛骨,用PBS清洗,剪去兩側(cè)干骺端,用1 ml注射器吸取PBS反復(fù)沖洗骨髓腔直至骨髓腔發(fā)白為止,收集骨髓沖洗液置于15 ml離心管中;1 000 r/min離心5 min后去上清液,用含10%FBS的低糖DMEM完全培養(yǎng)基吹打沉淀,制成單細(xì)胞懸液,以1×105個/ml為密度將細(xì)胞接種在大皿中,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);2 d后半換液,5 d后全換液,之后每2～3 d換1次液,當(dāng)細(xì)胞長至80%進(jìn)行傳代,傳至第3代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.5MSC的鑒定 在24孔板中放入細(xì)胞爬片,取正在培養(yǎng)的第3代Ptpn11E76K/+和Ptpn11+/+MSC消化后制成單細(xì)胞懸液并計數(shù),保持每孔液體體系為0.5 ml,每孔種入2×104個細(xì)胞,每組3個復(fù)孔,共兩組,在37 ℃、5%CO2濃度條件下培養(yǎng)48 h,之后吸棄各孔培養(yǎng)基,加入4%的多聚甲醛固定0.5 h,室溫下用10%的山羊血清封閉1 h,用含有1%BSA和0.25% Triton X-100的PBS以200 ∶1的比例稀釋一抗(Sca-1),每孔加入200 μl,4 ℃孵育過夜(超過12 h),用上述試劑以1 000 ∶1稀釋二抗,每孔加入200 μl,避光條件下在常溫孵育1.5 h,用DAPI室溫避光染細(xì)胞核5 min,滴加抗熒光淬滅劑封片,風(fēng)干并拍照計數(shù)。

1.2.6細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 在24孔板中放入細(xì)胞爬片,取正在培養(yǎng)的第3代Ptpn11E76K/+和Ptpn11+/+MSC消化后制成單細(xì)胞懸液并計數(shù),每孔種入2×104個細(xì)胞,每組3個復(fù)孔,共6組;4～6 h后,對照組和實(shí)驗(yàn)組分別換上完全培養(yǎng)基和加了相應(yīng)濃度的分子變構(gòu)抑制劑(SHP099和ET070的濃度均為20 μmol/L)的培養(yǎng)基,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,期間每24 h更換相應(yīng)的培養(yǎng)基;48 h后,吸棄各孔培養(yǎng)基,后續(xù)操作參照1.2.5項(xiàng)進(jìn)行。

1.2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 消化離心的細(xì)胞沉淀用RIPA重懸,置于冰上30 min,每4～5 min振蕩3～5 s,在4 ℃條件下以12 000 r/min離心20 min,吸出上清液轉(zhuǎn)移至新1.5 ml EP管;用BCA方法測蛋白濃度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;按照5×上樣緩沖液體積:蛋白體積為1 ∶4,加入上樣緩沖液,99 ℃水浴加熱蛋白10 min;制備SDS-PAGE凝膠,根據(jù)BCA結(jié)果上樣后進(jìn)行電泳和PVDF膜轉(zhuǎn)膜,用5%的脫脂牛奶封閉1 h以上,分別將膜置于稀釋好的一抗中,4 ℃條件下孵育過夜,TBST洗膜,室溫孵育二抗1 h,洗膜后顯影。

1.2.8CCK-8實(shí)驗(yàn) 取狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行離心消化并計數(shù),將細(xì)胞懸液調(diào)制濃度為1×104/ml,96孔板每孔加入200 μl細(xì)胞懸液,每組5個復(fù)孔,每板6組,需要4個96孔板(0、24、48、72 h);鋪板后4～6 h后實(shí)驗(yàn)組和對照組分別換成加變構(gòu)抑制劑的完全培養(yǎng)基和普通完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)至相應(yīng)時間點(diǎn)后取出檢測(0 h的無需繼續(xù)培養(yǎng)),期間每24 h更換每個孔相應(yīng)的培養(yǎng)基;當(dāng)達(dá)到相應(yīng)時間時,取出孔板,在各孔中加入20 μl CCK-8溶液,培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2～4 h;孵育結(jié)束后,用酶標(biāo)儀檢測其在480 nm處吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定結(jié)果將工具鼠Mx1-cre與Ptpn11E76K-neo/+的C57BL/6小鼠雜交,得到的小鼠通過基因型鑒定確定得到Mx1-cre;Ptpn11+/+(2、10、15、18、19、21、24、25、26號)和Mx1-cre;Ptpn11E76K/+(3、4、7、9、10號)小鼠。見圖1。

圖1 小鼠基因型鑒定結(jié)果

2.2 MSC細(xì)胞形態(tài)及鑒定分離Mx1-cre;Ptpn11+/+和Mx1-cre;Ptpn11E76K/+兩種基因型小鼠的MSC并進(jìn)行體外傳代培養(yǎng),在培養(yǎng)過程中觀察到MSC呈集落式貼壁生長,細(xì)胞呈梭形,放射狀排列,并伸出長短不一粗細(xì)不均的突起并且伴隨傳代數(shù)增加,細(xì)胞形態(tài)趨于統(tǒng)一。見圖2A。細(xì)胞免疫熒光檢測顯示,第3代細(xì)胞的表面抗原蛋白均表達(dá)干細(xì)胞表面抗原Sca-1(圖2B、C),由此可確定分離所得細(xì)胞為MSC。

圖2 成功分離并培養(yǎng)Ptpn11+/+和Ptpn11E76K/+ MSC

2.3 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察變構(gòu)抑制劑SHP099和ET070對Ptpn11E76K/+激活突變的MSC內(nèi)的SHP2的相分離現(xiàn)象的影響細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示,與Ptpn11+/+組相比,Ptpn11E76K/+組MSC在顯微鏡下可觀察到更多的SHP2蛋白由相分離而產(chǎn)生的生物分子冷凝物,且兩組MSC細(xì)胞內(nèi)形成的冷凝物的數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3A,t=21.62,P<0.000 1);與Ptpn11E76K/+組相比較,Ptpn11E76K/++SHP099組和Ptpn11E76K/++ET070組的MSC在顯微鏡下可見的SHP2蛋白由相分離而產(chǎn)生的生物分子冷凝物明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B,tSHP099=20.54,tET070=23.88,P<0.000 1)。Western blot實(shí)驗(yàn)表明,野生型和突變型MSC以及添加變構(gòu)抑制劑SHP099和ET070作用之后,細(xì)胞內(nèi)SHP2蛋白本身的表達(dá)水平幾乎沒有差異(圖3C)。

圖3 免疫熒光檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組SHP2蛋白由于相分離產(chǎn)生的冷凝物液滴數(shù)量并且通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組SHP2蛋白的表達(dá)差異

2.4 MSC中E76K突變的SHP2蛋白的相分離被抑制后干細(xì)胞的增殖能力的變化用CCK-8試劑盒檢測6個組細(xì)胞藥物作用后第0、24、48、72 h 4個時間段細(xì)胞生長密度及各組各個時間點(diǎn)吸光度值并進(jìn)行統(tǒng)計分析,如圖4所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與SHP2E76K突變組相比,SHP2WT組(t=10.36,P<0.01)、SHP2E76K+SHP099組(t=42.31,P<0.001)、SHP2E76K+ET070組(t=32.02,P<0.000 1)細(xì)胞的吸光度值均下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示MSC增殖能力較差。

圖4 MSC的SHP2發(fā)生E76K突變以及相分離被抑制之后細(xì)胞增殖能力的變化

2.5 抑制Ptpn11E76K/+突變的MSC中SHP2的相分離之后MSC ERK及AMPK-mTOR信號通路部分相關(guān)蛋白活化的改變提取藥物處理了48 h的野生型和突變型的MSC的總蛋白,通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測與細(xì)胞增殖和代謝相關(guān)的蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與Ptpn11+/+組相比,Ptpn11+/++SHP099組(t=22.2,P<0.000 1)、Ptpn11+/++ET070組(t=55.8,P<0.000 1)p-ERK蛋白表達(dá)減少;與Ptpn11E76K/+組相比,Ptpn11E76K/++SHP099組(t=96.87,P<0.000 1)、Ptpn11E76K/++ET070組(t=41.14,P<0.000 1)p-ERK蛋白表達(dá)減少(圖5B、C)。此結(jié)果提示SHP2相分離被抑制后Ptpn11E76K/+MSC ERK蛋白活化程度降低(圖5A)。AMPK-mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測顯示:mTOR蛋白、AMPK蛋白的相對表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5E、F)。而p-AMPK蛋白的相對表達(dá)統(tǒng)計結(jié)果顯示:與Ptpn11+/+組相比較,Ptpn11+/++SHP099組(t=4.573,P<0.05)、Ptpn11+/++ET070組(t=10.25,P<0.001)蛋白表達(dá)增加;與Ptpn11E76K/+組相比較, Ptpn11E76K/++SHP099組(t=174.3,P<0.000 1)、Ptpn11E76K/++ET070組(t=74.82,P<0.000 1)蛋白表達(dá)增加(圖5G)。p-mTOR蛋白的相對表達(dá)統(tǒng)計結(jié)果顯示:與Ptpn11+/+組相比,Ptpn11+/++SHP099組(t=46.98,P<0.000 1)、Ptpn11+/++ET070組(t=38.27,P<0.000 1)蛋白表達(dá)減少;與Ptpn11E76K/+組相比, Ptpn11E76K/++SHP099組(t=37.39,P<0.000 1)、Ptpn11E76K/++ET070組(t=113.3,P<0.000 1)蛋白表達(dá)減少(圖5H);p70s6k蛋白的相對表達(dá)統(tǒng)計結(jié)果顯示:與Ptpn11+/+組相比,Ptpn11+/++SHP099組(t=47.00,P<0.000 1)、Ptpn11+/++ET070組(t=19.38,P<0.000 1)蛋白表達(dá)減少;與Ptpn11E76K/+組相比,Ptpn11E76K/++SHP099組(t=43.29,P<0.000 1)、Ptpn11E76K/++ET070組(t=49.63,P<0.000 1)蛋白表達(dá)減少(圖5I)。此結(jié)果提示,SHP2相分離被抑制后,Ptpn11E76K/+MSC AMPK蛋白被活化,并且mTOR的磷酸化被抑制,導(dǎo)致下游蛋白p70s6k表達(dá)減少(圖5D)。

圖5 Western blot檢測各組MSC細(xì)胞總蛋白中ERK通路、AMPK-mTOR通路部分蛋白的表達(dá)情況及統(tǒng)計圖

3 討論

據(jù)相關(guān)報道[4],在橫紋肌肉瘤中發(fā)現(xiàn)了Ptpn11的激活突變,但其機(jī)制尚不清楚。Ptpn11是一種原癌基因,它編碼的SHP2蛋白是非受體蛋白酪氨酸磷酸酶家族的一員。SHP2蛋白的構(gòu)象在生理狀態(tài)下自我抑制,幾乎沒有催化活性,當(dāng)Ptpn11發(fā)生突變導(dǎo)致SHP2蛋白活性異常時,蛋白的蛋白酪氨酸磷酸酶結(jié)構(gòu)域暴露,從而使酪氨酸磷酸酶活性的作用發(fā)揮出來[8]。研究[7,9-10]表明在SHP2異常突變中,E76K突變?yōu)榈?6位的谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?其SHP2的磷酸酶催化活性相較于其他突變較高,是目前Ptpn11突變中最活躍的激活突變之一。而肉瘤的發(fā)生與MSC的惡性轉(zhuǎn)化之間有密切聯(lián)系,MSC的轉(zhuǎn)化主要通過敲除抑癌基因、過表達(dá)癌基因和給藥影響信號通路等方法實(shí)現(xiàn)[5,11]。近年來,大量研究表明癌癥的發(fā)生與原致癌蛋白相分離有關(guān)[12-14],但是肉瘤的發(fā)生發(fā)展與蛋白相分離是否有關(guān),目前還沒有相關(guān)研究報道。

課題組既往的實(shí)驗(yàn)[3]表明,SHP2E76K突變細(xì)胞增殖能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型細(xì)胞,而細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化總是伴隨惡性增殖。本研究利用了Ptpn11E76K/+激活突變類型小鼠,分離與肉瘤發(fā)生密切相關(guān)的MSC作為實(shí)驗(yàn)工具,通過使用兩種分子構(gòu)象抑制劑(SHP099和ET070)抑制SHP2E76K激活突變蛋白的相分離,檢測相分離被抑制之后突變細(xì)胞增殖能力的變化及相應(yīng)蛋白表達(dá)的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SHP2E76K激活突變后蛋白在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了更多相分離,并且由此刺激了ERK及AMPK-mTOR信號通路活化,促進(jìn)了MSC增殖。由于細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化總是伴隨著細(xì)胞增殖能力異常增強(qiáng),可以以此為切入點(diǎn),深入探究SHP2激活突變的蛋白產(chǎn)生的相分離與MSC惡性轉(zhuǎn)化之間關(guān)系,并可以進(jìn)一步研究肉瘤治療新的靶點(diǎn),為其臨床治療提供新的依據(jù)。