LINC00092對神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖、遷移和侵襲的影響

楊金亮,李 佳,安 靜,郗玉巧,葉 雷,程宏偉

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種極易惡化的,起源于神經(jīng)組織中膠質(zhì)細胞的腫瘤[1]。患者初期一般表現(xiàn)為頭痛、嘔吐和視力視野改變,隨著疾病的進一步加深,會出現(xiàn)持續(xù)性頭痛、癲癇發(fā)作、記憶力下降和腦疝等顯著癥狀[2]。亞硝基化合物、遺傳、電離輻射、腦部疾病史等已被廣泛認為是影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的主要因素[3],但具體的病因尚不完全明確。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞具有免疫逃逸能力,機體很難對其產(chǎn)生特異性殺傷,從而有效避免了免疫系統(tǒng)的抑制和清除。由于個體差異,不同患者的腫瘤病類型往往也存在著很大的區(qū)別。因此,迫切需要了解神經(jīng)膠質(zhì)瘤進展的關(guān)鍵分子機制,以制定更有效的治療方法。該研究中,首先利用數(shù)據(jù)庫對LINC00092在泛癌中的表達以及臨床意義進行了相關(guān)分析。接著通過體外實驗分析了LINC00092對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響,以及LINC00092對胰島素樣生長因子2結(jié)合蛋白1(insulin-like growth factor 2 binding protein 1,IGF2BP1)的調(diào)控作用。研究旨在闡明LINC00092在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的調(diào)控機制,可能為診斷和治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供新的靶標。

1 材料與方法

1.1 公共數(shù)據(jù)庫分析LINC00092在泛癌中的表達和預后基因型-組織表達數(shù)據(jù)庫(genotype-tissue expression,GTEx;http://commonfund.nih.gov/GTEx/)包含了大量健康人體組織的RNA測序數(shù)據(jù),常在癌癥的研究中與癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫聯(lián)合使用?；赥CGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的樣本信息,檢測了LINC00092在泛癌中表達。借助R軟件,對LINC00092在泛癌中的總體生存(overall survival,OS)預后進行了單變量Cox回歸分析,繪制了森林圖,并并計算了相應的P值和95%置信區(qū)間下的風險比(HR)。

1.2 細胞培養(yǎng)從中國科學院上海細胞庫購買該實驗所用到的膠質(zhì)瘤細胞(U87),將其放置在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle mediun,DMEM)中,并往該培養(yǎng)基中添加1%的青-鏈霉素。在含有5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞,培養(yǎng)條件37 ℃。

1.3 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染對于細胞的轉(zhuǎn)染,首先將U87細胞以每孔1×105的密度添加到6孔板中。LINC00092的過表達質(zhì)粒購自上海Genechem公司,以空載體pcDNA3.1作為陰性對照。其次,按照說明書,通過Lipofactamine 2000對細胞進行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。

1.4 熒光定量PCR技術(shù)使用TRIzol試劑提取U87細胞中的總RNA,通過測量260和280 nm處的相對吸光度來評估RNA質(zhì)量,通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA。在通過SYBR Green的方法對互補DNA進行熒光定量PCR檢測。在Applied Biosystems 7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)中進行檢測。隨后借助2-ΔΔCt的方法計算相對表達水平。

1.5 細胞增殖實驗對于細胞的增殖實驗,使用CCK-8試劑盒進行檢測。首先將轉(zhuǎn)染后的U87細胞以2×103的密度接種在96孔板中,檢測前每個孔中加入10 μl的CCK-8溶液,37 ℃孵育2 h。通過酶標儀分別在0、24、48、72和96 h檢測細胞在450 nm處的吸光度,并描繪生存力曲線以此來觀察細胞增殖的活力。

1.6 細胞遷移和侵襲實驗利用Transwell對U87細胞進行遷移和侵襲的檢測。首先,將轉(zhuǎn)染后的U87細胞用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋,添加到Transwell小室的上層腔室,對于侵襲實驗,在Transwell中加入基質(zhì)膠,而遷移實驗則不需要。之后在Transwell的下層腔室中添加含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。經(jīng)過一段時間的孵育后,取出小室,用棉簽擦除上層腔室多余的細胞。隨后用多聚甲醛固定遷移和侵襲的細胞,并用0.1%的結(jié)晶紫進行染色。最后通過光學顯微鏡觀察細胞遷移和侵襲的數(shù)量,進行比較分析。

1.7 細胞凋亡檢測對于細胞凋亡檢測,將轉(zhuǎn)染后的U87細胞48 h內(nèi)用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗2次,并用100 μl結(jié)合緩沖液重懸在避光環(huán)境中,對其進行膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素和碘化丙錠的雙重染色。隨后按照制造商提供的指示,通過流式細胞儀進行細胞凋亡分析。

1.8 蛋白質(zhì)印跡實驗利用RIPA裂解液從U87細胞中提取總蛋白,通過BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測量提取的蛋白質(zhì)濃度。隨后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜在5%脫脂乳中封閉3 h,與anti-IGF2BP1(1 ∶1 000)和anti-GAPDH(1 ∶10 000)在4 ℃的環(huán)境下孵育過夜。經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗后,利用ECL化學發(fā)光試劑盒檢測IGF2BP1的蛋白質(zhì)的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 LINC00092在泛癌中表達情況通過TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的樣本,分析了LINC00092在泛癌中的表達情況,如圖1A-D所示,LINC00092在絕大多數(shù)癌癥的腫瘤組織中低表達,如腎上腺皮質(zhì)癌(adrenal cortical carcinoma,ACC),膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BLCA),乳腺浸潤癌(breast invasive carcinoma,BRCA)和多形成性膠質(zhì)細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)等。此外,森林圖也展示了LINC00092在泛癌中的OS的單變量Cox回歸分析,根據(jù)P<0.05的前提,觀察到LINC00092在ACC(P=0.008 6)、BRAC(P=0.009 7)、GBM(P=0.013 3),腦低級腦膠質(zhì)瘤(LGG)(P<0.000 1)、肝細胞肝癌(LIHC)(P=0.039 2)、肺腺癌(LUAD)(P=0.040 5)中具有顯著的預后價值(圖2)。

圖1 公共數(shù)據(jù)庫檢測LINC00092在泛癌中表達情況

圖2 LINC00092對TCGA泛癌中OS的單因素Cox回歸結(jié)果

2.2 LINC00092抑制U87細胞的發(fā)展并調(diào)控IGF2BP1的表達在LINC00092的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞實驗中,首先基于熒光定量PCR技術(shù)檢測到經(jīng)pcDNA3.1轉(zhuǎn)染后的LINC00092在U87細胞中的表達上調(diào)(圖3A)。CCK-8試劑盒也檢測到,與對照組(pcDNA)相比,過表達LINC00092組(pcDNA3.1-LINC00092)U87細胞的增殖活力降低(P<0.01)(圖3B)。Transwell的結(jié)果也顯示與對照組(pcDNA)相比,過表達LINC00092組(pcDNA3.1-LINC00092)U87細胞的遷移和侵襲數(shù)量降低(P<0.000 1)(圖4A、B)。反之,流式細胞術(shù)檢測到與對照組(pcDNA)相比,過表達LINC00092組(pcDNA3.1-LINC00092)的U87細胞的凋亡增加(P<0.05),如圖5所示。因此,推斷LINC00092作為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抑癌因子,上調(diào)其在膠質(zhì)瘤細胞中的表達后腫瘤細胞的活力降低。此外,熒光定量PCR技術(shù)檢測到與對照組(pcDNA)相比,過表達LINC00092組(pcDNA3.1-LINC00092)的IGF2BP1的表達降低(P<0.01),而蛋白質(zhì)印跡實驗則顯示過表達LINC00092后IGF2BP1蛋白的表達也下降(P<0.05)(圖6A、B)。這表明了LINC00092能夠通過靶向IGF2BP1的表達,影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的生長過程。

圖3 LINC00092對U87細胞增殖的影響

圖4 LINC00092對U87細胞遷移和侵襲的調(diào)控 ×200

圖5 LINC00092對U87細胞凋亡的影響

圖6 LINC00092下調(diào)IGF2BP1在U87細胞中的表達

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,其5年病死率在全身腫瘤中僅次于胰腺癌和肺癌,往往導致高致殘率。當前關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的治療主要是以手術(shù)切除為主,但因腫瘤難以完全切除,一般還以綜合治療即放療、化療等為輔,從而延長患者的5年生存以及遏制腫瘤的復發(fā)率[4-5]。隨著生物科學技術(shù)的發(fā)展,基因、免疫等新型療法也逐步應用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究中[6]?？紤]到患者的個體差異性較大,腫瘤發(fā)病部位的不同,并且神經(jīng)膠質(zhì)瘤具有高異質(zhì)性和治療抵抗的特點,臨床治療效果也會有所不同,部分患者的預后往往較差。因此,基于生物信息學的方法對公共數(shù)據(jù)庫中的神經(jīng)膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)進行探究,能夠為尋找有效治療靶點提供新思路。

在當前的臨床生物學領(lǐng)域,通過生物信息學的方法對TCGA數(shù)據(jù)庫中的癌癥進行了遺傳學、表觀遺傳學等研究,以此掌握癌癥發(fā)病機制[7-8]。相關(guān)研究表明lncRNA可在癌癥診斷與預后中作為有效生物標志物,為癌癥的預防、治療提供了有價值的線索。該研究基于公共數(shù)據(jù)庫評估得到LINC00092在多個癌癥的腫瘤樣本中顯著低表達,并且對ACC、BRCA、LUAD等腫瘤具有顯著的預后價值。尤其重要的是分析結(jié)果顯示LINC00092在LGG和GBM中低表達,而單因素Cox分析顯示LINC00092在LGG和GBM中是危險預后因素(HR>1)。通過數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果顯示LINC00092可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤預后中的重要標志物。

作為一種長鏈非編碼RNA,LINC00092參與一些疾病發(fā)展過程中的調(diào)控,并與一些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。Chen et al[9]研究表明LINC00092主要在心臟成纖維細胞中表達,可通過抑制糖酵解來減弱人心臟成纖維細胞激活。Li et al[10]在甲基化驅(qū)動基因與乳腺癌的研究中通過分析顯示LINC00092在乳腺癌中低表達,是導致乳腺癌的不良預后的因素,上調(diào)其表達能夠顯著抑制乳腺癌細胞的增殖和細胞周期。其他研究還指出LINC00092在肺腺癌中低表達,下調(diào)LINC00092表達會對肺腺癌的遷移和侵襲產(chǎn)生影響,并且LINC00092可能與肺腺癌的不良預后有關(guān)[11]。然而,關(guān)于LINC00092在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的作用機制還不明確,該研究旨在進一步闡明LINC00092在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用機制,LINC00092可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的重要標志物。

在體外細胞實驗中,通過CCK-8、Transwell和流式細胞術(shù)的方法顯示上調(diào)LINC00092在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的表達會導致U87細胞增殖、遷移受到顯著抑制,并加速U87細胞的凋亡進程,這表明LINC00092在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的中發(fā)揮著抑癌作用。此外,結(jié)合網(wǎng)站ENCORI: The Encyclopedia of RNA Interactomes. (sysu.edu.cn) 預測得到LINC00092可能調(diào)控IGF2BP1的表達。通過qRT-PCR和Western blot的方法檢測到LINC00092負向調(diào)控IGF2BP1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的表達水平。IGF2BP1是一種蛋白質(zhì)編碼基因,與甲狀腺肉瘤和結(jié)直腸癌、卵巢癌等疾病相關(guān)[12]。研究[13]表明IGF2BP1的過表達促進膠質(zhì)瘤細胞進展,microRNA-4500通過靶向該基因能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的發(fā)展。Wang et al[14]的研究表明miR-873通過下調(diào)IGF2BP1的表達能達到同樣抑制膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的效果。因此,LINC00092可能通過靶向IGF2BP1的表達影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展,該研究存在一定的局限性,在后續(xù)的研究中,將進一步通過實驗闡明LINC00092靶向IGF2BP1作用機制。