基于腦-腸軸探討電針與雙歧桿菌對(duì)單純性肥胖大鼠腸源性信號(hào)物質(zhì)及脂代謝的影響

頡媛媛,錢虹宇,謝順鎧,許 婧

肥胖病是由于體內(nèi)攝入大于消耗,造成脂肪堆積和(或)分布異常,進(jìn)而導(dǎo)致體質(zhì)量增加的慢性疾病,是造成2型糖尿病和各種心血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素[1]。至2016年,全球18歲以上(含18歲)的人群接近20億人超重,且其中約1/3系肥胖[2]。目前針對(duì)肥胖的療法多樣,但療效存在參差,而針灸治療肥胖療效確切,安全性高,專家推薦意見為A(證據(jù)極有效)[3]。

中醫(yī)理論強(qiáng)調(diào)整體觀,以藏象理論為基礎(chǔ),認(rèn)為腦腸二者之間在生理及病理方面密切相關(guān)[4]。腦-腸軸是中樞系統(tǒng)和胃腸道系統(tǒng)構(gòu)成的雙向信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)[5]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是腦-腸軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)的核心,整合并向外周組織發(fā)出腦部及胃腸道傳達(dá)的信號(hào)胃腸道系統(tǒng)接收信號(hào),共同調(diào)節(jié)能量平衡從而達(dá)到控制體質(zhì)量的目的[6]。該實(shí)驗(yàn)研究通過對(duì)比電針與雙歧桿菌對(duì)單純性肥胖大鼠生存狀態(tài)、腸源性信號(hào)物質(zhì)[腸嗜鉻細(xì)胞(enterochromaffin cell,ECC)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、組胺(histamine,HIS)]水平、血脂[三酰甘油(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)]水平等的影響,驗(yàn)證電針療法的優(yōu)效性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購入體質(zhì)量在40～60 g范圍內(nèi)的4周齡SPF級(jí)SD大鼠60只(雌雄各半)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均來自于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,喂養(yǎng)條件為12 h明暗交替,室溫22～25 ℃,濕度40%～70%。動(dòng)物購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,期間飼以基礎(chǔ)飼料,自由攝食飲水。

1.2 主要試劑與儀器ELISA試劑盒購自武漢Elabscience公司;六胺銀染液套裝購自武漢Servicebio公司;生化試劑盒購自深圳Mindray公司;雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊購自晉城海斯制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字S19993065);G6850-Ⅱ型電針儀購自上海華誼醫(yī)用儀器有限公司;電子天平購自上海越平科學(xué)儀器(蘇州)制造有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、渦旋混合器、臺(tái)式高速微量離心機(jī)購自美國賽洛捷克公司;數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器購自常熟朗越儀器制造有限公司;全自動(dòng)生化分析儀購自深圳邁瑞醫(yī)療器械有限公司。

1.3 模型制備及分組

1.3.1模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后,按照隨機(jī)原則,將大鼠按1～60編號(hào),采用隨機(jī)數(shù)字法進(jìn)行初次分組,其中50只為高脂組,給予高脂飼料(配方:每200 g普通大鼠飼料中添加豬油50 g,白糖150 g,奶粉20 g,雞蛋1個(gè))進(jìn)行喂養(yǎng),其余10只為普食組,給予普通飼料(配方:水分94 g/kg、蛋白質(zhì)190 g/kg、脂肪51 g/kg、粗纖維36 g/kg、灰分62 g/kg、鈣11.3 g/kg、磷8.6 g/kg),造模期間大鼠自由攝食飲水,待高脂組體質(zhì)量大于普食組體質(zhì)量 20%者定為單純性肥胖大鼠[7]。

1.3.2分組 飼養(yǎng)8周后,造模成功30只(雌雄各半),將其隨機(jī)二次分組分為模型組、電針組、雙歧桿菌組,每組10只(雌雄各半);普食組的10只(雌雄各半)作為空白組。

1.4 干預(yù)措施

1.4.1空白組 繼續(xù)飼以普通飼料,與電針組同法捆綁固定,7 g/kg生理鹽水灌胃,1次/天,6次/周。

1.4.2模型組 繼續(xù)飼以高脂飼料,與電針組同法捆綁固定,7 g/kg生理鹽水灌胃,1次/天,6次/周。

1.4.3電針組 繼續(xù)飼以高脂飼料,選取雙側(cè)天樞、豐隆,穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]的動(dòng)物穴位圖譜。將該組大鼠以仰臥位固定在鼠臺(tái)上,露出其腹部與后肢。將治療穴位 2 cm×2 cm面積區(qū)域的毛發(fā)剃除干凈,并酒精棉球?qū)﹄娽樠ㄎ贿M(jìn)行消毒;使用針灸針刺入皮下25 mm左右,以平補(bǔ)平瀉法運(yùn)針約1 min后,連接電針治療儀,選用頻率為2 Hz,強(qiáng)度為1.5 V的連續(xù)波,觀察大鼠下肢及針柄變化,以輕微節(jié)律抽搐為度,留針30 min,7 g/kg生理鹽水灌胃1次/天,6次/周,兩側(cè)穴位交替治療。

1.4.4雙歧桿菌組 繼續(xù)飼以高脂飼料,與電針組同法捆綁固定,雙歧桿菌溶液灌胃治療。雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊用生理鹽水以100 mg/ml配制,現(xiàn)配現(xiàn)用,7 g/kg灌胃[9],1次/天,6次/周。

1.5 取材及檢測(cè)

1.5.1取材 治療結(jié)束后,大鼠禁食不禁水12 h,以1%戊巴比妥鈉(30 ml/kg)予腹腔注射麻醉后,開腹收集大鼠腹主動(dòng)脈血液4 ml左右,1 500 r/min 4 ℃離心15 min,使用移液槍將上層血清移至EP管中,-80 ℃保存?zhèn)溆?另外,迅速取出結(jié)腸組織、下丘腦組織等樣本,置于液氮中備用。

1.5.2體質(zhì)量檢測(cè) 固定每周一上午9:00測(cè)量大鼠體質(zhì)量、攝食量并記錄。

1.5.3ELISA檢測(cè) 5-HT、HIS等指標(biāo)采用ELISA法測(cè)定。結(jié)腸、下丘腦組織標(biāo)本研磨勻漿取上清液待用,提前20 min取出試劑盒和樣本,平衡至室溫;配制所需要的試劑及工作液;微孔板法測(cè)定各指標(biāo)水平。

1.5.4銀染色檢測(cè) 通過對(duì)結(jié)腸組織標(biāo)本石蠟切片脫蠟至水、媒染劑染色、工作液配制、組織酸化、孵育染色、顯色、六胺銀染液處理、復(fù)染、脫水封片、顯微鏡鏡檢等程序測(cè)定結(jié)腸ECC陽性細(xì)胞水平。

1.5.5生化檢測(cè) 通過對(duì)血清標(biāo)本BCA定量處理之后采用生化儀對(duì)TC、TG、LDL、HDL水平進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生存狀態(tài)造模前各組大鼠活動(dòng)度、毛發(fā)光澤度均較正常;造模后,除空白組外,其余各組大鼠活動(dòng)度、毛發(fā)光澤度降低;治療結(jié)束后,各治療組大鼠活動(dòng)度、毛發(fā)光澤度好轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量造模前,各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;干預(yù)前,與空白組比較,其他各組大鼠體質(zhì)量升高(P<0.05),模型組、電針組、雙歧桿菌組體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;干預(yù)后,與空白組比較,模型組體質(zhì)量升高(P<0.05);與模型組比較,電針組與雙歧桿菌組體質(zhì)量明顯降低(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,電針組較雙歧桿菌組體質(zhì)量降低明顯。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量

2.3 各組大鼠攝食量干預(yù)前,各組大鼠攝食量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.48,P>0.05);干預(yù)后,與模型組比較,電針組與雙歧桿菌組攝食量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=89.32,P<0.05),且電針組較雙歧桿菌組攝入量下降明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠干預(yù)前后攝食量比較

2.4 各組大鼠腸源性信號(hào)物質(zhì)

2.4.1各組大鼠結(jié)腸ECC陽性細(xì)胞水平 干預(yù)后,與空白組比較,模型組大鼠結(jié)腸ECC陽性細(xì)胞水平升高(P<0.05);與模型組比較,電針組、雙歧桿菌組大鼠結(jié)腸ECC陽性細(xì)胞水平降低(P<0.05),且電針組較雙歧桿菌組降低明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組大鼠干預(yù)后結(jié)腸ECC陽性細(xì)胞水平方差分析F=366.35。見圖2、3。

圖2 各組大鼠干預(yù)后結(jié)腸ECC陽性細(xì)胞水平

圖3 各組大鼠結(jié)腸ECC銀染色照片 ×400

2.4.2各組大鼠結(jié)腸與下丘腦5-HT、HIS水平 干預(yù)后,與空白組比較,模型組大鼠結(jié)腸及下丘腦中5-HT、HIS升高(P<0.05);與模型組比較,電針組、雙歧桿菌組大鼠結(jié)腸及下丘腦中5-HT、HIS降低(P<0.05),且電針組相關(guān)指標(biāo)較雙歧桿菌組降低明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組大鼠干預(yù)后結(jié)腸和下丘腦5-HT水平方差分析F=2 933.36、807.78;結(jié)腸和下丘腦HIS水平方差分析F=826.19、103.66。皮爾遜相關(guān)性檢驗(yàn)顯示結(jié)腸中ECC水平與5-HT、HIS在0.01級(jí)別(雙尾)相關(guān)性顯著,相關(guān)系數(shù)Γ值為0.85、0.98。見圖4、5。

圖4 各組大鼠干預(yù)后結(jié)腸與下丘腦5-HT水平

圖5 各組大鼠干預(yù)后結(jié)腸與下丘腦HIS水平

2.5 各組大鼠血脂水平干預(yù)后,與空白組比較,模型組大鼠血清TC、TG、LDL水平升高, HDL水平降低(P<0.05);與模型組比較,電針組血清TC、TG、LDL水平降低(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,HDL水平雖升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),雙歧桿菌組干預(yù)后血清TC、TG水平降低(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,LDL 、HDL水平雖有改變,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),且電針組較雙歧桿菌組的血脂相關(guān)指標(biāo)更接近空白組。各組大鼠干預(yù)后TC、TG、LDL、HDL水平方差分析F=4.59、3.78、2.50、1.64。見圖6。

圖6 各組大鼠干預(yù)后血脂水平

3 討論

研究[10]表明電針治療高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖療效確切,具有安全性高、價(jià)格低廉,患者接受度高等特點(diǎn)。腧穴是電針的施術(shù)部位,準(zhǔn)確選穴是電針取效的關(guān)鍵之一。有研究[11]顯示在治療肥胖的腧穴處方配伍規(guī)律中,天樞穴和豐隆穴是針灸治療肥胖的有效腧穴配伍。天樞穴和豐隆穴均是足陽明胃經(jīng)腧穴,天樞穴是大腸經(jīng)的募穴,位于人體上下之氣交合處,為升清降濁之樞紐;豐隆穴是胃經(jīng)的絡(luò)穴,一絡(luò)通兩經(jīng),屬陽而絡(luò)陰,二者結(jié)合使用可健脾和胃,調(diào)和腸胃,調(diào)暢中焦。雙歧桿菌是放線菌門中最主要的一種有益菌,對(duì)腸道功能甚至機(jī)體的平衡都有很大的影響,但其作為一種活性菌,不便于儲(chǔ)存,且長期服用可能會(huì)導(dǎo)致腸道產(chǎn)生依賴性而使機(jī)體本身的菌群失活。該實(shí)驗(yàn)選擇高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠模型是因其與人類肥胖類型相似,具有較高的研究價(jià)值。課題組前期研究表明針灸可以對(duì)機(jī)體的基礎(chǔ)代謝活動(dòng)起到良性調(diào)節(jié),加速脂肪代謝,還可抑制胃腸活動(dòng),降低食欲和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,調(diào)節(jié)腸道微生物的物種豐度。該實(shí)驗(yàn)研究基于腦-腸軸,以腸內(nèi)分泌系統(tǒng)的信號(hào)中轉(zhuǎn)和傳遞為切入點(diǎn),觀察顯示長期高糖高油飲食可誘導(dǎo)健康大鼠腸源性信號(hào)物質(zhì)的變化并通過腦-腸軸向中樞遞呈,使之自下而上刺激下丘腦對(duì)機(jī)體作出反應(yīng),大鼠攝食增加,代謝減緩,發(fā)生肥胖。電針和雙歧桿菌療法均可改善因高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖狀態(tài),提高肥胖大鼠的生存水平,且電針的治療效應(yīng)與雙歧桿菌相比在調(diào)整相關(guān)腸源性信號(hào)物質(zhì)水平刺激下丘腦控制攝食方面優(yōu)勢(shì)明顯,可加快脂代謝,減輕體質(zhì)量,是治療肥胖的優(yōu)勢(shì)手段。針灸治療疾病強(qiáng)調(diào)整體觀,其起效機(jī)制具有多層面、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),現(xiàn)代研究也表明針灸療法對(duì)肥胖患者的代謝水平、胃腸道系統(tǒng)等多個(gè)機(jī)體系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用,而當(dāng)前多數(shù)開展的研究切入點(diǎn)較散在,探索針灸治療肥胖的整體效應(yīng)機(jī)制將會(huì)成為更進(jìn)一步的目標(biāo),有助于為針灸治療肥胖提供有力的研究證據(jù)支持。

該實(shí)驗(yàn)研究尚存在一些不足,如實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)未加入假電針組進(jìn)行對(duì)比研究、僅做了觀察性的研究未進(jìn)行深層次的機(jī)制研究等,導(dǎo)致結(jié)果較局限。需要在后續(xù)工作中加以深入研究。