內(nèi)嗎啡肽2對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)μ-阿片受體表達(dá)的影響

謝雨杉,劉海帆,孫 騊,萬(wàn)法萍

神經(jīng)病理性痛(neuropathic pain,NP)是神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性損傷或功能障礙所引起的疼痛,阿片類(lèi)藥物對(duì)NP的治療效果不理想[1]。研究[1]表明,背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)中μ-阿片受體(μ-opioid receptor,MOR)表達(dá)下調(diào)是阿片類(lèi)藥物療效不佳的主要原因之一。MOR屬于G蛋白偶聯(lián)受體,與配體結(jié)合后,發(fā)生受體內(nèi)化和脫敏現(xiàn)象[1]。研究[2]表明,Rab7是胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵調(diào)控因子,與疼痛狀態(tài)下的MOR表達(dá)量降低有關(guān)。

內(nèi)嗎啡肽-2(endomorphin-2,EM2)是MOR的內(nèi)源性激動(dòng)劑,參與病理性痛的形成[3]和鎮(zhèn)痛過(guò)程[4]。研究[5]表明,EM2可誘導(dǎo)MOR羧基末端第375位絲氨酸(Ser375)發(fā)生快速磷酸化,此過(guò)程在其復(fù)敏中發(fā)揮重要作用。糖尿病性痛大鼠脊髓中,EM2不僅增加了磷酸化MOR的表達(dá)量,還促進(jìn)MOR的表達(dá)[3],提示在鎮(zhèn)痛過(guò)程中,EM2可促進(jìn)MOR的功能恢復(fù)。因此,該研究以NP模型為研究對(duì)象,初步探討在EM2介導(dǎo)的鎮(zhèn)痛過(guò)程中,大鼠DRG內(nèi)MOR的表達(dá)變化及胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)其表達(dá)的影響,以加深對(duì)內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)功能的理解。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康成年SD大鼠,雄性,初始體質(zhì)量200～220 g,由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control組)、病理性痛組(SNI-NS組)和藥物組(SNI-EM2組),每組10只。動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作均符合徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求和規(guī)定(倫理號(hào):202208S027)。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1主要儀器 Von Frey纖維絲購(gòu)自美國(guó)Stoelting公司,PE-10導(dǎo)管(i.d. 0.28 mm,o.d. 0.64 mm)購(gòu)自美國(guó)Scientific Industries公司,熒光共聚焦顯微鏡(型號(hào):STELLARIS 5)購(gòu)自日本Olympus公司,微量進(jìn)樣針購(gòu)自上海高鴿工貿(mào)有限公司。

1.2.2主要試劑 MOR抗體(貨號(hào):ab17394,ab10275)、Rab7抗體(貨號(hào):ab137029)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,Ser375MOR抗體(貨號(hào):CSB-PA168551)購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司,actin抗體(貨號(hào):20536-1-AP)購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,山羊抗兔IRDye 800CW二抗(貨號(hào):V926-32211)購(gòu)自徐州微科曼得生物工程有限公司,溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosome-associated membrane proteins 1,LAMP1)抗體(貨號(hào):bs-1970R)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,Alexa488驢抗豚鼠IgG(貨號(hào):706-545-148)購(gòu)自美國(guó)Jackson公司,Alexa594驢抗兔IgG(貨號(hào):#8889)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司,EM2(貨號(hào):GC10059)購(gòu)自美國(guó)GlpBio公司。

1.3 方法

1.3.1病理性痛模型的制備 該研究參照Decosterd et al[6]的方法,制備坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(spared nerve injury,SNI)誘導(dǎo)的NP模型。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后,切開(kāi)左側(cè)大腿背側(cè)皮膚,鈍性分離股二頭肌,暴露坐骨神經(jīng)及其3個(gè)分支:脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)和腓腸神經(jīng),雙重結(jié)扎并離斷脛神經(jīng)和腓總神經(jīng),保留并避免牽拉腓腸神經(jīng),逐層縫合手術(shù)切口。術(shù)后對(duì)切口進(jìn)行常規(guī)消毒抗炎處理直至愈合。

1.3.2后足縮足反應(yīng)閾值(paw withdrawal threshold,PWT)的測(cè)定 測(cè)試前3天,將大鼠放入行為學(xué)測(cè)試平臺(tái)適應(yīng)環(huán)境,每天1 h。手術(shù)當(dāng)天、術(shù)后1、3、5、7 d以及給藥后1、3、5、7、9 d使用校準(zhǔn)的不同強(qiáng)度的Von Frey纖維絲測(cè)定大鼠的PWT值。測(cè)定時(shí),待大鼠安靜后,從最低刺激強(qiáng)度開(kāi)始,用纖維絲垂直刺激大鼠足底外側(cè)皮膚,持續(xù)3～5 s,當(dāng)大鼠出現(xiàn)抬足、舔足或躲避等行為視為陽(yáng)性反應(yīng)。每個(gè)刺激強(qiáng)度重復(fù)測(cè)試5次,相鄰兩次刺激時(shí)間間隔5 min以上,以能引起3次以上陽(yáng)性反應(yīng)的最低刺激強(qiáng)度作為PWT值。

1.3.3鞘內(nèi)置管和給藥 大鼠麻醉后,以?xún)蓚?cè)髂前上棘連線(xiàn)中點(diǎn)為中心,沿脊柱兩側(cè)作縱向切口,鈍性分離肌肉,暴露并去除第6腰椎棘突,將PE-10導(dǎo)管由腰5與腰6棘突間隙刺入蛛網(wǎng)膜下隙并向頭端推入約2 cm,置管過(guò)程中可見(jiàn)導(dǎo)管內(nèi)有清亮的腦脊液流出。固定導(dǎo)管,依次縫合肌肉和皮膚。置管術(shù)后的大鼠需分籠單獨(dú)飼養(yǎng)。

鞘內(nèi)給藥時(shí)用微量注射器將5 μl藥液或無(wú)菌生理鹽水緩慢推入PE-10導(dǎo)管內(nèi),推注結(jié)束后再推入10 μl無(wú)菌生理鹽水,使藥物充分注射至蛛網(wǎng)膜下隙。推入過(guò)程以使大鼠一直保持安靜狀態(tài)為宜。

1.3.4Western blot實(shí)驗(yàn) 大鼠麻醉后,迅速取出腰4～6節(jié)段的DRG。提取蛋白后,采用BCA法檢測(cè)上清液中的蛋白濃度。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉30 min后,將PVDF膜置于一抗中:MOR抗體(1 ∶1 000)、Rab7抗體(1 ∶1 000)、Ser375MOR抗體(1 ∶1 000)或actin抗體(1 ∶1 000),4 ℃搖床過(guò)夜。TBST漂洗3次,每次10 min。滴加相應(yīng)的二抗(1 ∶15 000),搖床上避光反應(yīng)2 h后,TBST漂洗3次,每次10 min。使用雙紅外激光成像系統(tǒng)掃描成像。

1.3.5免疫熒光組織化學(xué)染色 大鼠麻醉后,經(jīng)左心室、升主動(dòng)脈灌注200 ml生理鹽水后,灌注400 ml 4%多聚甲醛溶液,取腰4～6節(jié)段DRG后固定24 h,經(jīng)30%蔗糖溶液脫水后行冰凍切片。10% FBS室溫封閉30 min后,滴加一抗:MOR抗體(1 ∶500)、Rab7抗體(1 ∶200)或LAMP1抗體(1 ∶200),4 ℃孵育48 h,0.1 mol/L PBS漂洗3次,每次10 min。滴加二抗:Alexa488驢抗豚鼠IgG(1 ∶500)和Alexa594驢抗兔IgG(1 ∶500),室溫避光孵育4 h,0.1 mol/L PBS漂洗3次,每次10 min,熒光封片劑封片后,熒光共聚焦顯微鏡拍照采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 SNI對(duì)大鼠PWT值的影響坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷誘導(dǎo)的NP模型,可產(chǎn)生持久的機(jī)械痛行為學(xué)表現(xiàn),是研究NP常用的模型之一。該實(shí)驗(yàn)SNI模型大鼠在術(shù)后第3天術(shù)側(cè)PWT值與正常對(duì)照組比較明顯降低(分組,F=430.8,P<0.01),術(shù)后第7天降低至最低水平,且至少持續(xù)至術(shù)后第21天。手術(shù)對(duì)側(cè)的PWT值與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 SNI模型大鼠后足PWT的測(cè)定(n=6)

2.2 EM2的鎮(zhèn)痛作用該實(shí)驗(yàn)使用SNI術(shù)后7 d的NP大鼠,鞘內(nèi)注射不同劑量(1、5、10、20、40 μg)的EM2,給藥后每隔10 min測(cè)定大鼠術(shù)側(cè)后足PWT值,研究EM2作用的時(shí)程和量效變化。結(jié)果顯示,鞘內(nèi)注射1、5、10 μg的EM2對(duì)SNI的NP大鼠未產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用,20和40 μg EM2的鎮(zhèn)痛效果和時(shí)程變化相似,即EM2給藥10 min后的鎮(zhèn)痛效應(yīng)最顯著(時(shí)間,F=88.44,P<0.01),給藥20 min后藥效降低,給藥30 min后,EM2的鎮(zhèn)痛效應(yīng)消失,大鼠PWT值恢復(fù)至給藥前水平(圖2)。選擇達(dá)到鎮(zhèn)痛效應(yīng)的最小劑量作為多次給藥劑量,該實(shí)驗(yàn)EM2長(zhǎng)期給藥劑量為20 μg。

圖2 鞘內(nèi)注射EM2對(duì)SNI的NP大鼠鎮(zhèn)痛作用的時(shí)程和量效變化

病理性痛組和藥物組大鼠于術(shù)后第7天開(kāi)始進(jìn)行鞘內(nèi)注射,每天1次,連續(xù)10 d,每隔1天于注射結(jié)束10 min后測(cè)定大鼠的PWT值。與注射前比較,鞘內(nèi)注射生理鹽水對(duì)NP大鼠PWT值沒(méi)有明顯的影響。與病理性痛組比較,鞘內(nèi)注射EM2后,大鼠的PWT值明顯升高(分組,F=376.8,P<0.01),連續(xù)給藥10 d,EM2仍可有效緩解SNI的NP,且多次鞘內(nèi)注射EM2,未見(jiàn)明顯的鎮(zhèn)痛效果降低現(xiàn)象(表1和圖3)。

表1 三組大鼠后足縮足反應(yīng)閾值比較

圖3 EM2對(duì)SNI的NP大鼠后足PWT值的影響

2.3 EM2對(duì)SNI的NP大鼠DRG內(nèi)MOR表達(dá)的影響免疫熒光染色結(jié)果顯示,MOR免疫陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布于DRG的中、小直徑神經(jīng)元胞體和部分神經(jīng)纖維中(圖4A)。NP后,大鼠DRG內(nèi)MOR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯降低(F=26.19,P<0.001)(圖4A、B),鞘內(nèi)注射EM2后,MOR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯升高(F=26.19,P<0.001),Western blot結(jié)果與形態(tài)學(xué)結(jié)果變化相似,與正常對(duì)照組比較,病理性痛組大鼠DRG內(nèi)MOR的表達(dá)量下降(F=7.749,P<0.05)(圖4C、D),藥物組大鼠DRG內(nèi)MOR蛋白的表達(dá)量升高(F=7.749,P<0.05)(圖4C、D)。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)MOR磷酸化表達(dá)量的變化,結(jié)果顯示,病理性痛組大鼠DRG內(nèi)Ser375MOR蛋白的表達(dá)量較正常對(duì)照組降低(F=9.679,P<0.05),藥物組大鼠DRG內(nèi)Ser375MOR蛋白的表達(dá)量較病理性痛組升高(F=9.679,P<0.05)(圖4E、F)。

圖4 EM2對(duì)SNI的NP大鼠DRG內(nèi)MOR表達(dá)的影響

2.4 胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制對(duì)EM2鎮(zhèn)痛過(guò)程中的MOR表達(dá)變化的影響該實(shí)驗(yàn)使用免疫熒光單標(biāo)染色和Western blot方法,研究了正常對(duì)照組、病理性痛組及藥物組大鼠DRG內(nèi)Rab7的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組比較,病理性痛組中Rab7的表達(dá)量明顯增高(FIF=22.67,P<0.05;FWestern blot=12.19,P<0.01)。鞘內(nèi)注射EM2后,藥物組中的Rab7的表達(dá)量較病理性痛組降低(FIF=22.67,P<0.01;FWestern blot=12.19,P<0.05)(圖5)。進(jìn)一步對(duì)3組大鼠DRG神經(jīng)元進(jìn)行MOR與Rab7免疫熒光雙重標(biāo)記染色。結(jié)果顯示:SNI的NP大鼠DRG內(nèi)MOR/Rab7免疫雙標(biāo)陽(yáng)性產(chǎn)物占Rab7陽(yáng)性標(biāo)志物或MOR陽(yáng)性標(biāo)志物的比例較正常對(duì)照組均明顯升高(FRab7=10.76,P<0.01;FMOR=5.08,P<0.05),當(dāng)給予EM2處理后,MOR/Rab7免疫雙標(biāo)陽(yáng)性產(chǎn)物占Rab7陽(yáng)性標(biāo)志物或MOR陽(yáng)性標(biāo)志物的比例較病理性痛組均明顯降低(FRab7=10.76,P<0.05;FMOR=5.08,P<0.05)(圖6)。

圖5 EM2對(duì)SNI的NP大鼠DRG內(nèi)Rab7表達(dá)的影響

圖6 免疫熒光雙標(biāo)染色檢測(cè)MOR與Rab7雙標(biāo)陽(yáng)性產(chǎn)物

溶酶體相關(guān)膜蛋白1 (lysosomal associated membrane protein 1,LAMP1)分布于自噬細(xì)胞器和內(nèi)溶酶體細(xì)胞器,可作為溶酶體標(biāo)志物。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較,病理性痛組大鼠DRG內(nèi)MOR/LAMP1免疫雙標(biāo)陽(yáng)性產(chǎn)物占LAMP1或MOR免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的比例均增高(FLAMP1=6.215,P<0.05;FMOR=7.681,P<0.01)。鞘內(nèi)注射EM2后,與病理性痛組比較,藥物組大鼠DRG內(nèi)MOR/LAMP1免疫雙標(biāo)陽(yáng)性產(chǎn)物占LAMP1或MOR免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的比例均明顯降低(FLAMP1=6.215,P<0.05;FMOR=7.681,P<0.05)(圖7)。

3 討論

DRG是外周感覺(jué)性信息傳遞至中樞的第一站。DRG神經(jīng)元內(nèi)的MOR,是內(nèi)源性阿片系統(tǒng)的重要組成部分,也是臨床上阿片類(lèi)藥物作用的主要受體。既往研究[7]表明,在阿片類(lèi)藥物治療效果欠佳的NP和糖尿病NP等動(dòng)物模型DRG神經(jīng)元內(nèi)MOR的表達(dá)量降低,但是在阿片類(lèi)物質(zhì)鎮(zhèn)痛效果較好的炎性痛模型中,脊髓背角和DRG神經(jīng)元內(nèi)MOR的表達(dá)量增加,提示MOR的表達(dá)量與阿片類(lèi)藥物的鎮(zhèn)痛療效密切相關(guān)。

作為MOR的天然的內(nèi)源性配體,EM2能有效緩解炎性痛、癌性痛和NP[8],尤其對(duì)傳統(tǒng)鎮(zhèn)痛藥物不敏感的糖尿病NP具有較好的鎮(zhèn)痛效果[3]。該實(shí)驗(yàn)顯示多次注射EM2未見(jiàn)明顯的藥效降低。Wu et al[9]研究顯示,鞘內(nèi)注射攜帶EM2的重組腺病毒對(duì)SNI的NP具有較好的鎮(zhèn)痛效應(yīng),且沒(méi)有成癮和耐受等副作用,以上結(jié)果與該研究結(jié)果一致,但是作者未研究DRG或脊髓中MOR的表達(dá)與EM2介導(dǎo)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)之間的關(guān)系。體外研究顯示,EM2可對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y[10]和人乳腺癌細(xì)胞MCF7[11]中MOR的mRNA表達(dá)產(chǎn)生正向和負(fù)向的調(diào)節(jié)作用,推測(cè)這種調(diào)節(jié)的差異性是由于EM2對(duì)不同亞型腺苷酸環(huán)化酶活性的作用不同,抑制或促進(jìn)cAMP表達(dá),從而對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生不同影響。然而文中未探究EM2介導(dǎo)的MOR蛋白表達(dá)變化。研究[12]表明,在炎癥、神經(jīng)病變或骨損傷等病理狀態(tài)下,外周阿片受體的數(shù)量增加是阿片類(lèi)藥物鎮(zhèn)痛作用增強(qiáng)的原因之一。該實(shí)驗(yàn)在體研究中顯示,藥物組DRG內(nèi)MOR的表達(dá)量明顯升高,提示MOR的表達(dá)增加可能是EM2多次注射未見(jiàn)明顯藥效降低的原因。

MOR蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)大約有20個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)有助于受體脫敏和胞吞作用。研究[13]顯示,EM2對(duì)MOR具有高親和力,其與MOR結(jié)合后,可使Ser375MOR發(fā)生快速磷酸化[14]。該實(shí)驗(yàn)連續(xù)鞘內(nèi)注射EM2明顯增加SNI大鼠DRG內(nèi)Ser375MOR蛋白的含量,與上述結(jié)果一致。磷酸化后的受體與β-抑制蛋白2(β-arrestin 2)結(jié)合,形成MOR-β-arrestin 2復(fù)合體內(nèi)吞進(jìn)入胞內(nèi)。Rab蛋白是一類(lèi)小分子調(diào)節(jié)蛋白,廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞器膜中,其中Rab7是將內(nèi)吞囊泡運(yùn)輸至晚期溶酶體的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白,可作為受體降解失活的指標(biāo)[15]。該研究表明,SNI的NP大鼠DRG內(nèi)Rab7的表達(dá)增加,且MOR/Rab7和MOR/LAMP1免疫熒光雙標(biāo)產(chǎn)物占Rab7陽(yáng)性標(biāo)志物或LAMP1陽(yáng)性標(biāo)志物的比例增高。提示SNI的NP后DRG內(nèi)Rab7表達(dá)上調(diào),MOR進(jìn)入溶酶體發(fā)生降解,導(dǎo)致受體數(shù)量減少。這與Mousa et al[2]在糖尿病NP大鼠DRG的觀(guān)察的結(jié)果一致。鞘內(nèi)注射EM2后,藥物組大鼠DRG內(nèi)Rab7的表達(dá)較病理性痛組降低,MOR/Rab7和MOR/LAMP1免疫熒光雙標(biāo)產(chǎn)物占Rab7陽(yáng)性標(biāo)志物或LAMP1陽(yáng)性標(biāo)志物的比例降低。提示EM2作用后,內(nèi)吞的受體囊泡進(jìn)入溶酶體降解途徑減少,這可能是藥物組大鼠DRG神經(jīng)元中MOR表達(dá)增加的原因之一。

神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌環(huán)路是存在于動(dòng)物和人體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)是神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),由外周組織合成,逆行運(yùn)輸至脊髓和DRG的神經(jīng)元中。外周神經(jīng)損傷可阻斷NGF的運(yùn)輸,從而降低其在脊髓和DRG神經(jīng)元中的表達(dá)。EM2作為內(nèi)源性阿片肽,除了發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用,在神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)和分化過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用。阿片肽可促進(jìn)NGF的表達(dá)[16]。外源性NGF可增加初級(jí)神經(jīng)元MOR的表達(dá)[17],而Mousa et al[2]在糖尿病性痛大鼠DRG內(nèi)顯示NGF可以抑制胞內(nèi)Rab7的表達(dá),由此推測(cè),SNI的NP狀態(tài)下,神經(jīng)體液因素可能也參與了EM2與MOR結(jié)合后的受體胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。