靶向骨肉瘤PD-1/PD-L1信號(hào)通路探針的實(shí)驗(yàn)研究

黃海峰,鄒 歡,王 煉,楊先騰,朱 華,李?yuàn)檴?/p>

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤,研究[1]表明,合并肺部轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者的1、2、5年生存率逐年下降(93.3% ～ 11.5%)。免疫治療可能是骨肉瘤治療的新希望,因此,阻斷骨肉瘤患者的程序性死亡受體-1/程序性死亡受體配體-1(programmed death receptor-1 /programmed death receptor ligand-1,PD-1/PD-L1)信號(hào)通路可以作為治療骨肉瘤患者的重要策略。PD-L1單抗特異性作用于腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1蛋白受體,從而阻礙T細(xì)胞上的PD-1受體與腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1配體結(jié)合,進(jìn)一步起到抑制T細(xì)胞免疫逃逸的功能。惡性腫瘤患者的PD-1/PD-L1的表達(dá)水平與免疫治療的作用呈正相關(guān),與預(yù)后呈負(fù)相關(guān),因此,抗PD-L1單克隆抗體可以逆轉(zhuǎn)PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的阻斷作用。用于治療惡性腫瘤的PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑已經(jīng)被視為腫瘤學(xué)的一項(xiàng)革命性創(chuàng)新[2]。PD-L1是在惡性腫瘤細(xì)胞膜上高度表達(dá)的跨膜蛋白[3]。已經(jīng)有研究[4]表明,PD-L1過表達(dá)預(yù)示惡性腫瘤愈后不佳,但接受PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的惡性腫瘤患者生存期會(huì)更長。該研究報(bào)道了靶向PD-L1的124I-anti-PD-L1單克隆抗體分子探針的成功合成,并進(jìn)一步通過微型正電子發(fā)射斷層顯像/計(jì)算機(jī)斷層成像(micro positron emission tomography/ computed tomography, Micro-PET/CT)實(shí)時(shí)評(píng)估了OS-732骨肉瘤小鼠模型中的PD-L1受體蛋白表達(dá)的狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)瘤株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物OS-732皮下荷瘤鼠:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所。18～20 g BALB/c裸鼠,5～6周齡,SPF級(jí)(無特定病原體),雌性:北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。18～20 g KM小鼠, 5～6周齡,SPF級(jí)(無特定病原體),雌性: 北京華阜康生物科技股份有限公司

1.2 主要試劑同位素124I-I2和anti-PD-L1抗體由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供; PD-L1抗體(TA809809S,美國Origene公司);二抗:山羊抗兔IgG/HRP聚合物(PV-6002,北京中杉金橋生物公司)。

1.3 方法

1.3.1Anti-PD-L1抗體毒性實(shí)驗(yàn) PBS組(對(duì)照組)及anti-PD-L1組(給藥組)各5只KM小鼠(隨機(jī)分組),小鼠尾靜脈分別注射50 μg anti-PD-L1或者同體積PBS,每周2次,連續(xù)4周。每周2次稱取小鼠體質(zhì)量,第8次給藥后6 d,即31 d后處死小鼠,取肝、腦、肺、腎組織,行HE染色;組織學(xué)層面確定肝、腦、肺、腎有無損傷。所有動(dòng)物摘眼球取血,分離血清,測定肌酐(creatinine,CREA)、尿素(urea,UREA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST),在生化指標(biāo)層面確定有無肝腎損傷。

1.3.2皮下荷瘤鼠動(dòng)物模型的建立 正常飼養(yǎng)待OS-732皮下荷瘤鼠皮下腫瘤生長直徑達(dá)1 cm時(shí)處死,選擇生長良好的腫瘤組織,用手術(shù)刀將腫瘤組織切割成3～4 mm3大小的組織塊,以特制的組織接種器將腫瘤組織移植到BALB/c裸鼠右側(cè)腋窩皮下,待OS-732皮下荷瘤鼠腫瘤直徑達(dá)到 0.8～1.0 cm后再進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合醫(yī)院動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的相關(guān)指導(dǎo)方針(貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)號(hào):2020384號(hào))。

1.3.3PD-L1的免疫組化染色 取OS-732皮下荷瘤鼠的腫瘤組織行免疫組化染色。石蠟切片脫蠟處理,組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù),阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,血清封閉,加一抗二抗,DAB顯色,復(fù)染細(xì)胞核,脫水封片,蘇木精染細(xì)胞核為藍(lán)色,DAB顯出的陽性表達(dá)為棕黃色。

1.3.4124I-anti-PD-L1單克隆分子探針的制備 在1.5 ml EP 管中依次加入20 μl anti-PD-L1(5 mg/ ml)、200 μl PB(0.1 mol/L、pH 7.0)溶液和250 μl含74 MBq124I-I2的溶液,而后加入12 μl(1 mg/ml)NBS反應(yīng)60 s,再向其中加入200 μl 10% HSA終止反應(yīng),最后PD-10脫鹽柱純化產(chǎn)物。

1.3.5Micro-PET/CT骨肉瘤PD-L1的成像 通過喂食0.5% KI溶液阻斷荷OS-732骨肉瘤裸鼠甲狀腺對(duì)碘的攝取,時(shí)間點(diǎn)為注射分子探針前3天。3只荷OS-732骨肉瘤的裸鼠尾靜脈注射18.5 MBq124I-anti-PD-L1單克隆分子探針,并在注射探針后的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(注射探針后2、24 、48 h)進(jìn)行Micro-PET/CT骨肉瘤PD-L1成像。

2 結(jié)果

2.1 Anti-PD-L1抗體毒性試驗(yàn)

2.1.1動(dòng)物體質(zhì)量變化 所有KM小鼠在給藥期間活動(dòng)、進(jìn)食等一般狀態(tài)良好,體質(zhì)量均有一定程度的上升。首次給藥當(dāng)天記為D0,第8次給藥后6 d,即D31,anti-PD-L1抗體組的動(dòng)物體質(zhì)量與PBS組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.8,P=0.58)。所有動(dòng)物體質(zhì)量變化情況見圖1。

圖1 給藥后KM小鼠體質(zhì)量變化趨勢圖

2.1.2HE結(jié)果 第8次給藥后6 d,即D31,每組取3只動(dòng)物的肝、腦、肺、腎4個(gè)組織,蘇木精-伊紅染色檢測組織的病變情況,結(jié)果顯示PBS組與anti-PD-L1組均無明顯病變,典型HE染色結(jié)果見圖2,其中肝(圖2A、B):兩組肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞索排列整齊,肝小竇結(jié)構(gòu)清晰,均未見炎性細(xì)胞浸潤及細(xì)胞變性壞死。腦(圖2C、D):兩組神經(jīng)元染色成橢圓形或圓形,數(shù)量豐富,均排列規(guī)則致密,基質(zhì)豐富,染色均勻。肺(圖2E、F):兩組肺泡大小均勻,結(jié)構(gòu)正常,均未見肉芽腫等明顯增生,未見炎性細(xì)胞浸潤及細(xì)胞變性壞死。腎(圖2G、H):兩組腎小球均勻分散在皮質(zhì)內(nèi),結(jié)構(gòu)完整,均未見明顯病變;髓質(zhì)內(nèi)小管均未見明顯病變。

圖2 HE染色結(jié)果圖 ×100A、C、E、G:PBS組;B、D、F、H:anti-PD-L1組

2.1.3生化指標(biāo)結(jié)果 第8次給藥后6 d,即D31,分別取PBS組與anti-PD-L1組KM小鼠外周血分離血清,比色法檢測血清中CREA、UREA、ALT及AST的含量。結(jié)果顯示,anti-PD-L1組KM小鼠各指標(biāo)與PBS組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 anti-PD-L1給藥后KM小鼠各指標(biāo)的變化情況

2.2 荷瘤鼠骨肉瘤PD-L1的免疫組化染色OS-732骨肉瘤荷瘤鼠動(dòng)物模型成功構(gòu)建(圖3A),同時(shí)免疫組化染色(immunohistochemistry,IHC)證實(shí)骨肉瘤組織細(xì)胞膜表面的PD-L1受體蛋白表達(dá)為陽性,即PD-L1受體免疫組化染色為棕色(圖3E)。

圖3 OS-732骨肉瘤的Micro-PET/CT顯像及IHC染色

2.3 PD-L1的Micro-PET/CT顯像OS-732骨肉瘤荷瘤鼠在尾靜脈注射18.5 MBq124I-anti-PD-L1單克隆分子探針2 h后開始進(jìn)行Micro-PET/CT腫瘤顯像。根據(jù)腫瘤成像,可以看到在荷瘤鼠腫瘤部位沒有明顯的攝取,腫瘤區(qū)域未出現(xiàn)顯像,分子探針主要聚集在荷瘤鼠的心臟和肝臟中(圖3B)。當(dāng)Micro-PET/CT成像在注射后24 h時(shí),在骨肉瘤部位可以觀察到明顯的探針攝取,腫瘤區(qū)域已經(jīng)出現(xiàn)了清晰的成像(圖3C)。探針注射后48 h,荷瘤鼠肝臟中的殘留探針基本被代謝完畢,骨肉瘤部位表現(xiàn)明顯的高攝取(圖3D), 整個(gè)腫瘤成像清晰。

3 討論

PD-L1的腫瘤成像是一個(gè)熱門研究方向[5-6],與免疫有關(guān)的成像主要包括SPECT、PET、光學(xué)成像和MRI。每種成像方法在展示腫瘤形態(tài)和生理方面都有其固有的優(yōu)缺點(diǎn)。該研究表明124I-anti-PD-L1單克隆分子探針可用于體內(nèi)行靶向PD-L1受體蛋白的無創(chuàng)PET成像。

該研究通過毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證anti-PD-L1對(duì)動(dòng)物無明顯毒性,還通過免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PD-L1蛋白受體在OS-732腫瘤組織中的表達(dá),并為進(jìn)一步的成像實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備了可靠的腫瘤動(dòng)物模型。骨肉瘤荷瘤鼠通過尾靜脈注射124I-anti-PD-L1分子探針24 h后,腫瘤部位出現(xiàn)了良好的成像,這樣也就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的PD-L1受體的無創(chuàng)實(shí)時(shí)監(jiān)測,這種非侵入性成像具有簡便快捷,而且精準(zhǔn)度高的優(yōu)點(diǎn)。

目前用于檢測腫瘤組織中PD-L1表達(dá)的傳統(tǒng)方法都是侵入性的,例如IHC或Western blot。另外,當(dāng)獲取腫瘤標(biāo)本時(shí),存在醫(yī)源性腫瘤播散的風(fēng)險(xiǎn)。Kim et al[7]研究表明PD-L1受體蛋白在腫瘤中的存在,而PD-1蛋白主要在腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞中表達(dá)。大多數(shù)免疫療法的基本機(jī)制是激活免疫效應(yīng)物,例如T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。但是,免疫檢查點(diǎn)抑制劑,例如PD-1、PD-L1和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4),它們均能抑制T細(xì)胞的功能并促進(jìn)免疫逃逸。納武利尤單抗(nivolumab)是一種抗PD-1/PD-L1檢查點(diǎn)抑制劑,但是只有在15%～24%的患者中有效,可能與患者體內(nèi)相關(guān)受體蛋白表達(dá)量少有關(guān)。目前還沒有發(fā)現(xiàn)包括PD-L1在內(nèi)的并經(jīng)過驗(yàn)證的能夠準(zhǔn)確識(shí)別的可能對(duì)免疫檢查點(diǎn)療法產(chǎn)生反應(yīng)患者的生物標(biāo)志物[8]?？筆D-L1治療僅對(duì)某些患者有益。PD-1/PD-L1能夠抑制抗腫瘤免疫力,因此,在臨床環(huán)境中阻斷PD-L1受體蛋白可能會(huì)導(dǎo)致一部分患者發(fā)生強(qiáng)烈的抗腫瘤反應(yīng)[9]。服用抗PD-L1藥物后的患者,在常規(guī)治療后會(huì)得到更好的無進(jìn)展生存期[10]。

綜上所述,PD-L1的非侵入性成像意義重大,因?yàn)槊庖忒煼ㄔ赑D-L1陽性患者中更有效,篩選具有潛在PD-L1表達(dá)的腫瘤患者可進(jìn)一步幫助患者的免疫治療。此外,這項(xiàng)研究采用核醫(yī)學(xué)技術(shù)對(duì)患者的PD-L1受體蛋白表達(dá)進(jìn)行無創(chuàng)篩查提供了新的探針,有望提高患者對(duì)PD-L1免疫治療的反應(yīng)率。該研究表明,124I-anti-PD-L1分子探針可能為廣大骨肉瘤患者選擇PD-L1免疫治療提供新的策略,同時(shí)也將為該課題組進(jìn)一步的免疫治療研究奠定基礎(chǔ)。