乳源五肽PGPIP緩解酒精性脂肪肝及其機(jī)制研究

黃九九,耿奇龍,李安琪,秦宜德,戚 楠

酒精性肝病在人類肝臟疾病中排名前列,根據(jù)肝臟損傷的病程差異可分為急性肝損傷和慢性肝損傷,其發(fā)病過程包括早期的肝臟脂肪化,脂肪性肝炎,一些患者最終可能發(fā)展成肝臟纖維化和肝癌。由于酒精性肝病的病因復(fù)雜,確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚,目前沒有明確預(yù)防或治療的方法[1]。生物活性肽和許多抗氧化劑或免疫抑制劑相比,分子量較小,易于通過腸道屏障而被吸收。天然牛乳來源的五肽脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-脯氨酸(prolin-glycine-proline-isoleucine-proline,PGPIP)位于A2β-酪蛋白的63～67殘基上,含有3個(gè)Pro,不易被蛋白酶分解,并且所有的氨基酸都是非極性疏水性氨基酸。疏水性氨基酸有助于維持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和功能,疏水相互作用也是多肽和脂蛋白之間結(jié)合的重要作用力[2]。慢性酒精喂養(yǎng)加急性酒精灌胃小鼠模型是由美國國立衛(wèi)生研究院酒精濫用與酒精中毒研究所(NIAAA)建立的。隨著喂養(yǎng)時(shí)間的延長,模型組小鼠發(fā)展出類似人類酒精性肝病的肝臟中性粒細(xì)胞浸潤和肝臟纖維化[3]。該研究擬建立NIAAA小鼠模型,并利用其研究乳源五肽PGPIP對(duì)酒精性脂肪肝的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只清潔級(jí),健康8周齡C57BL/6小鼠,購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(皖)2017-001]。分籠飼養(yǎng)于12 h/12 h晝夜交替,相對(duì)濕度45%～55%、溫度20～25 ℃的環(huán)境中,可自由飲水。

1.1.2主要試劑 對(duì)照和模型Lieber-DeCarli液體飼料(江蘇南通特洛菲公司);PGPIP(純度>98%)、qRT-PCR引物(上海生物工程有限公司);谷胱甘肽( glutathione,GSH)、蘇木精、4%的多聚甲醛和中性樹膠(江蘇碧云天生物技術(shù)公司);無水乙醇(上海蘇懿化學(xué)試劑公司);C/EBP同源蛋白質(zhì)(C/EBP-homologous protein,CHOP)、半胱天冬酶3(Caspase 3)、Cleaved Caspase 3、β-actin抗體(美國Abcam生物技術(shù)公司);磷酸化RNA-依賴蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(P-PERK)、PERK、磷酸化真核翻譯起始因子2α(P-eIF2α)、eIF2α、轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)和ATF6抗體(美國Cell Signaling生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1NIAAA小鼠模型肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因差異表達(dá)熱圖 NIAAA小鼠模型肝臟RNA測序數(shù)據(jù)來自美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的基因表達(dá)綜合(GEO)數(shù)據(jù)庫,檢索號(hào)GSE163444[4]。

1.2.2NIAAA小鼠模型的建立 C57BL/6小鼠進(jìn)行5 d的酒精飼料適應(yīng)期。對(duì)照組小鼠被喂養(yǎng)對(duì)照LD液體飼料5 d,實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)束適應(yīng)期開始喂養(yǎng)含1%酒精的Lieber-Decarli模型液體飼料,每天喂養(yǎng)的酒精濃度增加1%,直到達(dá)到5%的酒精濃度為止。隨后小鼠被允許自由飲食,對(duì)照組每天繼續(xù)喂養(yǎng)對(duì)照液體飼料,實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)5%酒精濃度的模型液體飼料,分別持續(xù)10 d。實(shí)驗(yàn)期間小鼠每天稱重,檢測健康狀況。在最后1天,實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行1次5 g酒精/kg體質(zhì)量的酒精灌胃,對(duì)照組小鼠則灌胃同等熱量的麥芽糖糊精。9 h后處死小鼠,收集肝臟組織和血清備用。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì) 所有小鼠隨機(jī)分成4組,每組10只小鼠,分別為:對(duì)照LD飼料喂養(yǎng)(對(duì)照組)、含酒精模型LD飼料喂養(yǎng)(模型組)、含酒精模型LD飼料喂養(yǎng),同時(shí)每天用GSH灌胃(GSH組)、含酒精模型LD飼料喂養(yǎng),同時(shí)每天用PGPIP灌胃(PGPIP組)。所有小鼠在慢性酒精液體飼料喂養(yǎng)加急性酒精灌胃后都存活下來。GSH組和PGPIP組,每天在最后1天酒精灌胃之前30 min的同樣時(shí)間,分別灌胃4×10-6mol/kg體質(zhì)量的GSH和PGPIP。對(duì)照組和模型組,每天灌胃同等體積的去離子水。

1.2.4組織學(xué)分析 取小鼠新鮮肝臟放置4%多聚甲醛中固定24 h以上。固定結(jié)束后放入自動(dòng)組織脫水機(jī)中脫水,石蠟包埋機(jī)包埋,石蠟切片厚度為5 μm,切片烘干后脫蠟。蘇木精染細(xì)胞核,鹽酸酒精分化,碳酸鋰反藍(lán),伊紅染細(xì)胞質(zhì)。中性樹膠封片觀察。

1.2.5油紅O染色 通過油紅O染色確定肝臟脂肪化。取小鼠新鮮肝臟置于4%多聚甲醛中固定24 h以上。將固定好的小鼠肝組織置于蔗糖溶液中脫水,PBS清洗組織表面的蔗糖溶液,OCT包埋劑包埋肝組織。切片厚度為10 μm,干冰冷凍后,切片置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ图tO工作液按照3 ∶2比例配置,取30 ml油紅O染色儲(chǔ)備液與20 ml的去離子水混勻,靜置10 min后,過濾,現(xiàn)配現(xiàn)用。冰凍切片用油紅O工作液避光染色10 min,異丙醇分化,蘇木精染細(xì)胞核,鹽酸酒精分化,碳酸鋰反藍(lán)。甘油明膠封片觀察。

1.2.6透射電鏡分析 取材器械提前在4 ℃冰箱內(nèi)預(yù)冷,取新鮮小鼠肝臟,切成大小為1 mm3左右或橫切面為1 mm2的長條形,將組織放入2.5%戊二醛固定液內(nèi)于4 ℃冰箱內(nèi)前固定,磷酸緩沖溶液漂洗,1%鋨酸于4 ℃冰箱內(nèi)后固定,滲透包埋后,切片厚度為70 nm,枸櫞酸鉛染色,透射電鏡觀察拍照。

1.2.7qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 各處理組小鼠肝臟組織剪碎研磨后用TRIzol試劑盒提取組織總RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。目的基因的mRNA表達(dá)水平用GAPDH作為內(nèi)參定量測定。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,目的引物序列見表1,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得Ct值,目的基因mRNA的表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法定量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.8Western blot實(shí)驗(yàn) 取新鮮小鼠肝臟,剪切成細(xì)小的碎片,按照每20 mg組織加入200 μl RIPA裂解液裂解。裂解液經(jīng)過蛋白濃度定量后,等量的蛋白(20 μg)加到上樣孔中進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。Western blot轉(zhuǎn)膜后,用含5%的脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h,一抗1 ∶1 000 TBST稀釋后4 ℃孵育過夜。TBST洗3次后,辣根酶標(biāo)記的二抗1 ∶1 000 TBST稀釋后37 ℃孵育1 h,顯色。

2 結(jié)果

2.1 NIAAA小鼠模型肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因差異表達(dá)分析為了探索NIAAA小鼠模型肝臟中酒精代謝對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響,選取酒精代謝酶細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)和非折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)經(jīng)典通路相關(guān)基因,根據(jù)已有的GEO數(shù)據(jù)庫中RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類熱圖分析,其中對(duì)照組和模型組各選取3只小鼠肝臟樣本數(shù)據(jù),結(jié)果如圖1所示,對(duì)照組和模型組樣本之間生物重復(fù)性較好,ATF4、CHOP、ATF6和PERK基因在對(duì)照組肝臟樣本中表達(dá)相對(duì)較低,而在模型組樣本中表達(dá)相對(duì)較高。

圖1 NIAAA小鼠模型肝臟RNA測序基因差異表達(dá)熱圖

2.2 各處理組對(duì)小鼠酒精性肝損傷的病理學(xué)影響HE常規(guī)染色如圖2所示,正常對(duì)照組小鼠在中央靜脈周圍分布著放射狀的肝細(xì)胞,形成肝細(xì)胞索。肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞索排列整齊。模型組小鼠肝細(xì)胞索排列紊亂,肝細(xì)胞出現(xiàn)重度脂肪變性,表現(xiàn)為大脂肪泡和小脂肪泡相間的混合型脂肪病變。此外,肝小葉間可見不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤。GSH組小鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度和模型組類似。PGPIP組小鼠肝細(xì)胞脂肪病變程度比模型組和GSH組小鼠明顯減輕,肝小葉結(jié)構(gòu)完整。

2.3 各處理組對(duì)小鼠肝臟脂滴積累的影響油紅O染色如圖3所示,正常對(duì)照組小鼠肝臟中可見較少的脂滴,與之相比,模型組小鼠肝臟中有明顯的脂滴積累,表現(xiàn)為大小不同程度的混合型脂滴,GSH組小鼠肝臟與模型組相似,但脂滴的尺寸有所減少。PGPIP組小鼠肝臟脂滴數(shù)目與模型組和GSH組相比明顯減少,與對(duì)照組類似。

圖3 各處理組對(duì)慢性酒精性脂肪肝模型脂滴積累的影響 ×200

2.4 各處理組對(duì)肝細(xì)胞顯微形態(tài)的影響為了進(jìn)一步分析酒精代謝引起的脂滴積累對(duì)肝細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的影響并驗(yàn)證PGPIP的作用效果,對(duì)各處理組小鼠肝臟進(jìn)行透射電子顯微鏡分析。結(jié)果如圖4所示,對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)膜邊界明顯,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰,呈橢圓形,周圍圍繞著許多大小不等的線粒體,線粒體的周圍可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。細(xì)胞內(nèi)僅有少量的脂滴存在,且脂滴的尺寸較小。模型組小鼠肝細(xì)胞細(xì)胞膜邊界模糊,肝細(xì)胞胞質(zhì)空間被許多較大的脂滴占據(jù)(大于5 μm),此外還有一些小的脂滴。肝細(xì)胞細(xì)胞核有明顯的形態(tài)改變,可能是由于周圍大脂滴的擠壓所致。與模型組類似,GSH組小鼠肝細(xì)胞中也有較大的脂滴(大于5 μm)。PGPIP組小鼠肝細(xì)胞脂滴的數(shù)目和尺寸明顯減少,細(xì)胞核重新恢復(fù)成橢圓形,細(xì)胞內(nèi)可見許多線粒體和線粒體周圍的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

圖4 各處理組對(duì)慢性酒精性脂肪肝模型肝細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)的影響 ×1 600

2.5 PGPIP調(diào)節(jié)肝臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)通過qTR-PCR,分析各處理組小鼠肝臟組織中和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的CHOP和Bip mRNA的表達(dá)。通過Western blot分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的P-PERK、PERK、P-eIF2α、eIF2α、ATF4、ATF6、CHOP、Cleaved Caspase 3和Caspase 3蛋白。結(jié)果如圖5所示,與對(duì)照組相比,模型組中CHOP mRNA表達(dá)水平顯著增加,PGPIP恢復(fù)了表達(dá)水平的改變。與對(duì)照組相比,模型組中P-PERK、P-eIF2α、ATF4、ATF6、CHOP、Cleaved Caspase 3和Caspase 3蛋白的表達(dá)水平顯著增加,但PERK、eIF2α的蛋白表達(dá)水平并沒有顯著性改變。PGPIP肽能夠顯著恢復(fù)酒精誘導(dǎo)的上述蛋白表達(dá)水平的增加,并且PGPIP對(duì)PERK和eIF2α的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響。此外,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組中P-PERK/PERK和P-eIF2α/eIF2α的磷酸化水平顯著增加,然而PGPIP恢復(fù)了磷酸化水平的改變。因此,PGPIP對(duì)PERK-eIF2α-ATF4通路有較大影響,且對(duì)ATF6和Cleaved Caspase 3蛋白的表達(dá)有顯著性的效果。

3 討論

肝臟是人體酒精代謝的主要器官,肝細(xì)胞中負(fù)責(zé)酒精代謝的酶類主要有兩種,乙醇脫氫酶和CYP2E1。CYP2E1主要定位于肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還發(fā)揮許多重要的生物學(xué)功能,包括胞質(zhì)共翻譯蛋白質(zhì)折疊,調(diào)節(jié)鈣離子平衡和脂類的生物合成。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的氧化還原環(huán)境是通過GSH氧化還原產(chǎn)物的比率來維持的。在慢性重度酒精性肝病患者體內(nèi),CYP2E1基因被大量誘導(dǎo)表達(dá),催化乙醇轉(zhuǎn)變成乙醛,同時(shí)生成大量活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)[5]。過量的ROS能夠氧化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂質(zhì),改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的氧化還原環(huán)境,導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤[6]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中錯(cuò)誤折疊/未折疊的蛋白質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊機(jī)器之間平衡被打破,導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊/未折疊的蛋白質(zhì)聚集,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí),GSH氧化還原產(chǎn)物的比率改變,進(jìn)一步增加ROS產(chǎn)生,改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的氧化還原環(huán)境。

肝細(xì)胞中脂質(zhì)積累是酒精性肝病早期的主要特征之一,積累的脂質(zhì)主要以磷脂單層膜包裹的脂滴的形式存在,脂滴中心則是由富含三酰甘油的疏水的中性脂質(zhì)組成的內(nèi)核。參與三酰甘油合成的脂肪酸的來源,有食物來源的,脂肪組織經(jīng)過脂解后釋放進(jìn)入血液的,以及肝細(xì)胞通過脂肪酸合成途徑生成的。慢性飲酒會(huì)促進(jìn)脂肪組織脂解,并且促進(jìn)肝細(xì)胞合成脂肪酸[3]。在肝細(xì)胞中,脂肪酸被運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)合成三酰甘油,繼而從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以脂滴的形式出芽進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[7]。過多的脂肪酸進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng),超出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的三酰甘油合成載量,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在酒精性肝病小鼠模型中,肝細(xì)胞特異性敲除主要表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶1,一種三酰甘油合成的限速酶,會(huì)促進(jìn)肝臟脂肪酸合成,生成過多的脂肪酸繼而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,而降低肝臟脂肪酸水平能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[8]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí),啟動(dòng)UPR,通過減少蛋白質(zhì)翻譯,增加蛋白質(zhì)折疊,以及促進(jìn)錯(cuò)誤折疊/未折疊的蛋白質(zhì)降解,恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡。UPR包含3種經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,被3種通常稱為UPR感受器的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白起始,包括肌醇需求酶1-α(IRE1α)、PERK、ATF6。在生理?xiàng)l件下,UPR感受器的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔面結(jié)構(gòu)域和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)固有伴侶相互作用并結(jié)合,特別是BiP/GRP78蛋白。當(dāng)未折疊/錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積累在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi),它們就結(jié)合并飽和Bip,競爭性使BiP從UPR感受器的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔面結(jié)構(gòu)域解離,繼而導(dǎo)致后者寡聚化并激活。PERK激活后,通過磷酸化激活eIF2α,選擇性誘導(dǎo)激活A(yù)TF4。已有研究[9]報(bào)道酒精性肝病小鼠模型在肝臟中激活PERK/eIF2α/ATF4信號(hào)通路,并誘導(dǎo)脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá),導(dǎo)致肝臟脂肪化,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)促進(jìn)脂肪酸的合成。轉(zhuǎn)錄因子ATF4和ATF6激活后進(jìn)入細(xì)胞核,誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)[10-13]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡過程中,CHOP表達(dá)并在細(xì)胞核內(nèi)積累[14]。CHOP并不直接誘導(dǎo)凋亡,而是激活Caspase 3起始凋亡通路[15]。剪切后激活的Caspase 3切割細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的活性蛋白質(zhì),導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。凋亡的肝細(xì)胞作為損傷相關(guān)的分子模式進(jìn)一步促進(jìn)酒精性肝病的發(fā)展。目前的結(jié)果顯示PGPIP顯著性減少PERK/eIF2α通路磷酸化水平和ATF6表達(dá)水平,導(dǎo)致CHOP表達(dá)顯著性減少。減少的CHOP表達(dá)導(dǎo)致Caspase 3的激活減少,因此減少了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,從而緩解酒精性脂肪肝。綜上所述,PGPIP在酒精性肝病的防治過程中起到較大作用,且PGPIP具有副作用小、成本低廉、分子量小、不易引起免疫反應(yīng)、可口服等多種方式給藥等優(yōu)點(diǎn),但其更為詳細(xì)的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。