磷酸鈣納米顆粒介導(dǎo)干擾LMO4對(duì)皮膚鱗癌細(xì)胞增殖的影響

項(xiàng)明華,郭立鈺,涂珍珍,王 月,周海勝

納米顆粒作為運(yùn)送基因或藥物的載體,在生物醫(yī)學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。磷酸鈣納米顆粒(calcium phosphate nanoparticles, NP)作為一種新型的非病毒載體,可用于包裹目的基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞[1]。LIM結(jié)構(gòu)域蛋白4(lim-domain protein 4,LMO4)是有2個(gè)串聯(lián)重復(fù)排列的、富含有半胱氨酸-組氨酸的LIM結(jié)構(gòu)域,故屬于LMO蛋白家族成員。LMO4作為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,不與DNA分子直接發(fā)生作用,而是協(xié)助其他轉(zhuǎn)錄因子以調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[2]。研究[3-6]表明在胚胎發(fā)育過(guò)程中,LMO4調(diào)控生殖細(xì)胞、表皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移。多項(xiàng)研究[7-9]表明上皮來(lái)源的多種腫瘤如乳腺癌、胰腺癌、肺癌和食管癌等腫瘤細(xì)胞中LMO4的表達(dá)顯著增加,與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡存在密切關(guān)系。為了探討LMO4在皮膚鱗癌中作用和機(jī)制,分析皮膚鱗癌組織和細(xì)胞系中LMO4的表達(dá)水平,構(gòu)建表達(dá)靶向干擾LMO4的shRNA,利用NP包裹這種表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染皮膚鱗癌細(xì)胞,觀察其增殖能力并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑十二烷基硫酸納(sodium dodecyl sulfate, SDS)、瓊脂糖、枸櫞酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈣和泡沫消除劑(聚醚F68)均為國(guó)產(chǎn)化學(xué)試劑(化學(xué)分析純),購(gòu)自北京索來(lái)寶科技有限公司;高糖DMEM培養(yǎng)基和青-鏈霉素雙抗試劑購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;細(xì)胞周期素蛋白(Cyclin)D1和E1抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technologies公司;GAPDH抗體、LMO4抗體、細(xì)胞周期素蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)2和4均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;檢測(cè)細(xì)胞增殖的噻唑藍(lán)試劑盒(thiazolyl blue, MTT)、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司;引物(表1)均由上海生工生物工程有限公司合成;TRIzol試劑盒和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自大連寶生生物公司。

表1 檢測(cè)目的基因引物

1.2 組織、細(xì)胞系與載體人皮膚鱗癌組織來(lái)自安徽省立醫(yī)院皮膚科,在完成臨床組織病理分析后剩余的標(biāo)本;人正常皮膚組織來(lái)自安徽省立醫(yī)院泌尿外科門(mén)診包皮環(huán)切手術(shù)后遺棄的組織標(biāo)本。人皮膚鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431和永生化的人角質(zhì)形成細(xì)胞系(human immortalized epidermal cells, HaCat)均為所在研究室保存。干擾LMO4的干擾序列shRNA-L1和L2為研究室設(shè)計(jì),載體GV248、干擾LMO4質(zhì)粒shRNA-L1和shRNAc-L2均為課題組保存。

1.3 方法

1.3.1NP制備 根據(jù)文獻(xiàn)[1]提供方法制備N(xiāo)P。制備過(guò)程描述如下:將50 ml的0.05 mol/L氯化鈣、10 ml 1% SDS和10 ml 1% F68混合,持續(xù)攪拌24 h以制備均勻的微乳液A;同時(shí)將50 ml的0.025 mol/L磷酸氫二鈉、50 ml的0.025 mol/L枸櫞酸鈉、10 ml 1% SDS和10 ml 1% F68混合,攪拌24 h以制備均勻的微乳液B。再將微乳液B以10 ml/h 的速度緩慢加入到微乳液A中,并在35 ℃攪拌72 h,以促進(jìn)兩種微乳液充分混合。將混合液15 000 r/min離心15 min獲得納米顆粒,75%乙醇洗滌4次,加入15 ml去離子水進(jìn)行超聲勻化(頻率22 kHz,功率120 W)1 h。獲得的納米顆粒溶液置于-70 ℃冰箱中快速冷凍2 h,再轉(zhuǎn)入冷凍干燥箱放置48 h,從而獲得NP粉末備用。

1.3.2NP包被DNA及包裹效率分析 將制備的NP分別與shRNA-L1、shRNA-L2按照質(zhì)量比10 ∶1、5 ∶1混合后,加入0.05 mol/L的氯化鈣重懸,室溫放置30 min,10 000 r/min離心10 min,收集沉淀備用。將上清液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析納米顆粒包裹DNA的效果。確定包裹方案,包裹載體GV248,作為納米顆粒介導(dǎo)的載體DNA(nanoparticles mediated vectors,NP/sh-V);包裹的NP/shRNA-L1和NP/shRNA-L2混合,制備納米顆粒介導(dǎo)的干涉LMO4混合液(nanoparticles mediated interfering LMO4, NP/sh-L)。制備好的納米包裹DNA液于4 ℃保存、備用。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人皮膚鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431細(xì)胞和人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCat細(xì)胞均使用含10%熱失活的FBS和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基,放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照脂質(zhì)體Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)操作步驟,包裹shRNA-L1、shRNA-L2,并將二者混合形成脂質(zhì)體介導(dǎo)的干涉LMO4(liposome mediated interfering LMO4, Lip/sh-L);同時(shí)使用脂質(zhì)體包裹載體GV248(Lip/sh-V),分別轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞。將納米顆粒包裹的NP/sh-L或NP/sh-V加入A431細(xì)胞,進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)量和DNA量與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染保持一致。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h,更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR(RT-qPCR) 根據(jù)TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR 反應(yīng)條件為94 ℃變性4 min,按照94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共32個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸8 min。每個(gè)樣品均設(shè)置β-actin作為內(nèi)參基因。

1.3.5免疫組織化學(xué) 脫蠟處理組織切片,枸櫞酸鹽修復(fù)抗原,內(nèi)源性過(guò)氧化物酶進(jìn)行封閉。兔源抗體LMO4在4 ℃孵育過(guò)夜;次日依次滴加反應(yīng)增強(qiáng)液和增強(qiáng)型酶標(biāo)記二抗,室溫孵育30 min,DAB顯色,蘇木精染細(xì)胞核,自來(lái)水沖洗染料,烘干后使用中性樹(shù)脂封閉玻片;顯微鏡觀察和拍片。

1.3.6蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min;細(xì)胞裂解液置于100 ℃水浴 10 min,使蛋白發(fā)生變性;進(jìn)行12%聚丙烯酰胺-SDS電泳分離蛋白質(zhì);再以170 mA穩(wěn)定電流轉(zhuǎn)膜1.5 h;含5%脫脂牛奶的封閉液封閉40 min;分別加入對(duì)應(yīng)的抗體4 ℃孵育過(guò)夜;次日漂洗后加入酶標(biāo)記二抗室溫孵育6 h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光曝光顯影。

1.3.7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 用DMEM制備2×105/ml的細(xì)胞懸液,在96孔板中每孔接種500個(gè)細(xì)胞,接種后12 h(細(xì)胞貼壁),在12、24、36、48 h等4個(gè)時(shí)間點(diǎn),根據(jù)MTT時(shí)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。每孔加入10 μl新配制好的MTT溶液,在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h,每孔加入100 μl的甲臜溶液,在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育,直至甲臜完全溶解,在490 nm測(cè)定吸光度值(A490)。

1.3.8細(xì)胞周期分析 按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,簡(jiǎn)要描述如下:收集細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,離心后去除上清液,在細(xì)胞中加入70%預(yù)冷乙醇 500 μl 固定4 ℃過(guò)夜;去除固定液、洗滌細(xì)胞,細(xì)胞沉淀中加入100 μl RNase A溶液,重懸細(xì)胞,37 ℃水浴 30 min;再加入400 μl的碘化丙啶染色液混勻,4 ℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

2.1 LMO4在皮膚組織和細(xì)胞中表達(dá)利用收集的皮膚鱗癌組織和正常人皮膚組織,進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。結(jié)果顯示(圖1A):LMO4表達(dá)定位在細(xì)胞核。在正常人皮膚組織中的表達(dá)水平較低,主要分布在表皮的基底層細(xì)胞,棘層、顆粒層和角化層等位置均沒(méi)有檢測(cè)到LMO4表達(dá);而在皮膚鱗癌組織中,LMO4的表達(dá)水平顯著增加。

為了研究LMO4在皮膚鱗癌發(fā)生中的作用和機(jī)制,選擇了正常人皮膚來(lái)源的角質(zhì)形成細(xì)胞HaCat和皮膚鱗癌細(xì)胞A431作為研究對(duì)象。首先在mRNA水平利用RT-qPCR方法對(duì)LMO4進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖1B):皮膚鱗癌A431細(xì)胞中LMO4的表達(dá)水平顯著增加,是正常HaCat細(xì)胞的4倍。進(jìn)一步在蛋白質(zhì)水平利用Western blot進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示(圖1C):LMO4在A431的表達(dá)水平較HaCat明顯增加。因此,LMO4在皮膚鱗癌組織和鱗癌細(xì)胞中均具有較高的表達(dá)水平,由此推測(cè)LMO4可能參與皮膚鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

2.2 納米顆粒包裹DNA效率和干擾效率根據(jù)人LMO4的mRNA序列和表達(dá)載體GV248結(jié)構(gòu),設(shè)計(jì)并構(gòu)建了2個(gè)可以表達(dá)干擾RNA的表達(dá)載體shRNA-L1和shRNA-L2(圖2A),用于干擾LMO4的表達(dá)。目的基因插入位置是在GV248載體的AgeI和EcoRI位點(diǎn)(圖2B)。將納米顆粒與DNA(shRNA-L1和shRNA-L2)按照質(zhì)量比(μg)為5 ∶1和10 ∶1的比例進(jìn)行混合,以包裹質(zhì)粒DNA。將這些包裹的DNA溶液進(jìn)行離心后,收集的上清液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,以檢測(cè)上清液中殘留DNA,從而判斷包裹效率。如圖2C顯示:在5 ∶1的上清液中殘留較多DNA,包裹效率較低;而在10 ∶1組的上清液中未見(jiàn)殘留DNA,顯示較好的包裹效果。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,將納米顆粒按照10 ∶1包裹DNA。

圖2 shRNA表達(dá)載體構(gòu)建及NP包裹DNA檢測(cè)

為了檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率和干涉效率,分別將納米顆粒包裹的DNA(NP/sh-L和NP/sh-V)和脂質(zhì)體包裹DNA (Lip/sh-L和Lip/sh-V)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)LMO4的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(圖3A):在Lip/sh-L組細(xì)胞和NP/sh-L組細(xì)胞中LMO4的表達(dá)水平,分別是A431細(xì)胞組的64%±12.5%和55.0%±14.3%,分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002 1,P=0.03)。但是Lip/sh-L組細(xì)胞與NP/sh-L組細(xì)胞相比,LMO4的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.21)。Western blot檢測(cè)結(jié)果脂質(zhì)體和NP轉(zhuǎn)染的干擾載體,都能降低LMO4的表達(dá)(圖3B)。灰度分析顯示(圖3C):Lip/sh-L組中LMO4的表達(dá)水平是A431組細(xì)胞的74.0%±4.5%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.024)。NP/sh-L轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞中LMO4的表達(dá)水平是A431細(xì)胞的51.0%±3.0%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)?？梢?jiàn)Lip/sh-L和NP/sh-L轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,LMO4的表達(dá)均得到有效抑制。

圖3 A431細(xì)胞LMO4干擾效率分析

2.3 干擾LMO4對(duì)A431細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響為了研究干擾LMO4的表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響,使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,結(jié)果顯示(圖4):在轉(zhuǎn)染后24、36和48 h,NP/sh-L組吸光度值(A490)分別為0.28±0.01、0.31±0.11、0.38±0.18;NP/sh-V組的A490分別為0.39±0.02、0.54±0.02、0.73±0.11。與A431組相比,NP/sh-L組A490在24 h(P=0.011)、36 h(P=0.002)和48 h(P=0.001)等時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此,A431細(xì)胞在干擾LMO4時(shí),其細(xì)胞的增殖能力顯著降低。

圖4 干擾LMO4對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

為了進(jìn)一步研究LMO4調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的機(jī)制,采用碘化丙啶染色DNA方法,通過(guò)流式細(xì)胞分析技術(shù)觀察細(xì)胞周期的變化。結(jié)果顯示(圖5A):在A431組細(xì)胞中,處于G0/G1期的細(xì)胞比例為30.76%±1.96%;NP/sh-L組細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例為39.82%±1.86%,二者相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。A431組細(xì)胞中S期的細(xì)胞的比例為50.65%±0.62%,NP/sh-L組細(xì)胞中S期細(xì)胞比例為39.56%±0.65%,二者相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。而G2/M期細(xì)胞在NP/sh-L組與A431組之間比較,二者的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.517)?？梢?jiàn)干擾LMO4可以阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。

圖5 干擾LMO4對(duì)A431細(xì)胞周期的影響

為探討LMO4調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制,利用RT-qPCR方法對(duì)Cyclin D1、Cyclin E、CDK2和CDK4進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示NP/sh-L組細(xì)胞中Cyclin E和 CDK2較對(duì)照組明顯降低。其中,Cyclin E是NP/sh-V組細(xì)胞的0.36±0.03倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016);NP/sh-L組細(xì)胞中CDK2是NP/sh-V組細(xì)胞的0.49±0.02倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。干擾LMO4的表達(dá)對(duì)Cyclin D1和CDK4的表達(dá)沒(méi)有明顯影響(圖5B)。Western blot方法檢測(cè)Cyclin D1、Cyclin E及CDK2和CDK4等蛋白的表達(dá)變化,與RT-qPCR的結(jié)果一致(圖5C)。因此,LMO4可以通過(guò)調(diào)控Cyclin E和 CDK2表達(dá),影響細(xì)胞周期的變化。

3 討論

將目的基因轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞,常見(jiàn)的有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)染或病毒介導(dǎo)等方法,因操作過(guò)程較為繁瑣,要求具有較高的實(shí)驗(yàn)條件,且需要較高的實(shí)驗(yàn)成本,在應(yīng)用中受到一定限制。利用磷酸鹽和氯化鈣聚合形成直徑為23.5～34.5 nm的納米顆粒,具有易制備、實(shí)驗(yàn)成本低和較低的細(xì)胞毒性,且不具有免疫原性等優(yōu)點(diǎn)[1],具有一定應(yīng)用價(jià)值。在氯化鈣修飾制備的納米顆粒時(shí),改變了納米顆粒表面帶電性,包裹帶負(fù)電的DNA時(shí)能提高包裹效率[10]。利用此方法制備的納米顆?？梢杂行О蓴_載體DNA,與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移相比,其轉(zhuǎn)染效率和干擾效率具有較好的一致性。

LMO4作為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,協(xié)助其他轉(zhuǎn)錄因子以調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[2]。由于胚胎發(fā)育時(shí)LMO4參與調(diào)控表皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移[3-6];而在正常皮膚組織中,LMO4僅僅在基底層細(xì)胞中表達(dá),其功能是參與維持角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化和遷移,保持表皮層細(xì)胞的更新[11]。有研究[12-14]表明在上皮組織來(lái)源的腫瘤,如乳腺癌、非小細(xì)胞型肺癌、鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌等腫瘤中,LMO4的表達(dá)水平均顯著增加,且LMO4參與調(diào)控這些腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移。因此,LMO4與腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)證實(shí)LMO4在皮膚鱗癌組織顯著增加;細(xì)胞水平檢測(cè)也表明LMO4在皮膚鱗癌細(xì)胞中表達(dá)水平較正常皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞顯著增加。提示LMO4可能參與調(diào)控皮膚鱗癌的發(fā)生。

在皮膚鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431中靶向干擾LMO4的表達(dá),結(jié)果顯示敲低LMO4的表達(dá),能顯著抑制A431細(xì)胞的增殖。在干擾LMO4表達(dá)的細(xì)胞中,G2/M期細(xì)胞沒(méi)有受到影響,而主要變化是G0/G1期細(xì)胞數(shù)量顯著增加,S期細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞明顯減少。因此,干擾LMO4表達(dá),有利于細(xì)胞周期停滯在G0/G1期。已知調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的主要是周期素蛋白包括有 A、B、D和E等5種類(lèi)別。其中,Cyclin D1和E主要調(diào)控細(xì)胞G1期到S期,Cyclin D1能激活CDK4調(diào)控G1期細(xì)胞生長(zhǎng);Cyclin E激活CDK2調(diào)控S期的染色體復(fù)制[12]。在A431細(xì)胞中干擾LMO4時(shí),Cyclin E表達(dá)顯著降低,同時(shí)伴隨CDK2表達(dá)減少;而Cyclin D1和CDK4的表達(dá)變化不明顯。這些結(jié)果與細(xì)胞周期的變化具有一致性。有研究[15]表明在乳腺癌細(xì)胞中敲低LMO4后,Cyclin D1和E的表達(dá)顯著降低,導(dǎo)致細(xì)胞停留在G2/M期,這可能是LMO4在不同類(lèi)型腫瘤細(xì)胞中作用機(jī)制存在差異性。