中藥組方對PRRS 防控效果的評價

張 帥 ，代 飛 ，王敬友 ，趙云環(huán) ，王榮申 ，宮新城 ，范京惠 ＊，左玉柱 ＊

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北科星藥業(yè)有限公司，河北 石家莊 050200；3.石家莊市動物疫病預(yù)防控制中心，河北 石家莊 050300）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起的一種烈性傳染病，俗稱“豬藍(lán)耳病”，臨床以引起母豬的繁殖障礙以及不同年齡段豬只呼吸道疾病為主要特征。PRRS為免疫抑制性疾病，感染豬免疫系統(tǒng)受損、免疫力下降，易繼發(fā)其他病原體感染，使得臨床癥狀加重。目前我國流行的PRRSV 毒株主要是NADC-30 like、NADC-34 like 等類高致病性毒株。由于減毒活疫苗的廣泛使用，返強(qiáng)毒株普遍存在，且PRRSV 存在多個譜系毒株，毒株頻繁重組，造成了豬場毒株呈現(xiàn)多樣性和復(fù)雜性。此外，PRRSV 可通過感染豬只的唾液、鼻腔分泌物、糞尿及精液排出，妊娠后期感染的母豬還可通過乳汁排毒，一旦感染，將造成豬場大面積傳播，使防控難度大大增加，嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

從中獸醫(yī)學(xué)角度分析，導(dǎo)致該疾病高發(fā)的原因是“虛邪共濟(jì)”。天氣炎熱之時，氣候較為潮濕，生豬外感濕熱化火，機(jī)體易升降失常、肺氣不宣以及陰陽失調(diào)。同時，處于哺乳期的仔豬在感染PRRSV 時發(fā)病率和死亡率較高，主要因?yàn)樽胸i五臟處于“虛”時，抵御病毒能力較差，容易出現(xiàn)病毒乘虛而入的情況，導(dǎo)致邪盛正衰，治療難度大，加之傳染性較強(qiáng)，因此極易出現(xiàn)高感染率和死亡率。PRRS 屬于溫?zé)岵〉姆懂牐詰?yīng)用中獸醫(yī)理論進(jìn)行疾病治療時還應(yīng)遵循清肺止咳、清熱解毒的治療原則，同時做好消炎抑菌、扶正祛邪等工作，以獲得理想的治療效果。中獸藥中，黨參具有健脾益肺、養(yǎng)血生津之效，白術(shù)可健脾燥濕、安胎抗炎，茯苓利水滲濕、健脾寧心，知母清熱瀉火、滋陰潤燥。幾種中藥組成方劑，可加強(qiáng)脾胃的運(yùn)化功能，提高機(jī)體免疫力，在PRRS 防控方面將具有良好的應(yīng)用前景。

為了研制一種防控PRRS 的有效中藥組方，本研究利用中獸醫(yī)原理，結(jié)合PRRS 對豬體的危害，以黨參、白術(shù)、茯苓、知母等6 種藥物組方，選擇斷奶仔豬進(jìn)行治療效果和預(yù)防效果試驗(yàn)。治療效果試驗(yàn)中，用藥組仔豬在與PRRSV 陽性豬同群飼養(yǎng)7 d 后用藥；預(yù)防效果試驗(yàn)中，用藥組仔豬在與PRRSV陽性豬同群飼養(yǎng)開始即用藥，同時分別設(shè)與PRRSV 陽性豬同群飼養(yǎng)，但不用藥的陽性對照，以及未感染的陰性對照。對各實(shí)驗(yàn)組仔豬進(jìn)行血液、組織中的病毒載量分析，發(fā)現(xiàn)該藥物的使用，在一定程度上抑制了PRRSV 在仔豬體內(nèi)的增殖，對PRRS 有一定的治療和預(yù)防作用。從仔豬的臨床表現(xiàn)及生長狀況分析，發(fā)現(xiàn)該藥物越早使用越有利于減輕PRRS 癥狀，對豬場PRRS 進(jìn)行有效防控。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

18 頭25日齡斷奶仔豬，無PRRSV 及其他病原體感染，且PRRSV 抗體陰性。

1.2 主要試劑耗材

PRRSV、豬乙腦病毒（JPEV）、豬瘟病毒（CSFV）實(shí)時熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒，豬細(xì)小病毒（PPV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)2 型病毒（PCV2）實(shí)時熒光定量PCR 檢測試劑盒，購自湖南國測生物技術(shù)有限公司；PRRSV ELISA 抗體檢測試劑盒，購自愛德士瑞士生物科技有限公司；DNA/RNA 核酸提取及純化試劑盒，購自湖南冠牧生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器

高速冷凍離心機(jī)，上海力申科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；熒光定量PCR 儀，西安天隆科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)動物檢測

對18 頭25日齡斷奶仔豬，進(jìn)行耳緣靜脈采血，使用DNA/RNA核酸提取及純化試劑盒提取核酸，實(shí)時熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒進(jìn)行PRRSV、JPEV、CSFV 檢測，實(shí)時熒光定量PCR 檢測試劑盒進(jìn)行PPV、PRV 和PCV2 檢測，以確定試驗(yàn)仔豬無以上病原體感染；使用PRRSV ELISA 抗體檢測試劑盒進(jìn)行PRRSV 抗體檢測，以確定試驗(yàn)仔豬PRRSV 抗體陰性。

1.5 試驗(yàn)分組及用藥

治療效果試驗(yàn)中，仔豬隨機(jī)分為PRRSV 陽性對照組、用藥組和陰性對照組，每組3 頭。陽性對照組和用藥組仔豬均為與已知PRRSV陽性豬同群飼養(yǎng)自然感染，用藥組仔豬與陽性豬同群飼養(yǎng)7 d 后開始用藥，每頭3 g/d，拌料飼喂；陰性對照組不做感染和用藥處理，各組仔豬飼養(yǎng)條件相同。預(yù)防效果試驗(yàn)中，仔豬隨機(jī)分為PRRSV 陽性對照組、用藥組和陰性對照組，每組3 頭。陽性對照組和用藥組仔豬均為與已知PRRSV 陽性豬同群飼養(yǎng)自然感染，用藥組仔豬在與PRRSV陽性豬同群飼養(yǎng)開始即用藥，每頭3 g/d，拌料飼喂；陰性對照組不做感染和用藥處理，各組仔豬飼養(yǎng)條件相同。

1.6 臨床指標(biāo)觀察

陽性對照組和用藥組與已知PRRSV 陽性豬同群飼喂開始記為試驗(yàn)第1 天，連續(xù)14 d 觀察并記錄試驗(yàn)仔豬的精神狀態(tài)、采食量、體溫、死亡率等臨床指標(biāo)。

1.7 臨床材料采集

對兩批試驗(yàn)仔豬試驗(yàn)第7、10、13 天進(jìn)行耳緣靜脈采血，做好相關(guān)記錄；14 d 后采集肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織進(jìn)行研磨，并做好分組相關(guān)記錄，8 000 r/min 離心10 min，分離組織研磨液上清，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8 PRRSV 檢測

對于試驗(yàn)進(jìn)行第7、10、13 天采集的血液，使用DNA/RNA 核酸提取及純化試劑盒提取核酸，通過實(shí)時熒光定量RT-PCR 檢測血液中PRRS 病毒血癥情況；對于分離的感染14 d 組織研磨液上清，使用DNA/RNA 核酸提取及純化試劑盒提取核酸，通過實(shí)時熒光RT-PCR檢測組織中PRRSV 病毒載量。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 試驗(yàn)動物檢測結(jié)果

對18 頭25日齡斷奶仔豬，分別使用實(shí)時熒光定量RT-PCR 及實(shí)時熒光定量PCR 檢測試劑盒進(jìn)行PRRSV、JPEV、CSFV、PPV、PRV和PCV2 檢測，結(jié)果顯示PRRSV、JPEV、CSFV、PPV、PRV 和PCV2均為陰性（表1）；使用PRRSV ELISA 抗體檢測試劑盒進(jìn)行PRRSV抗體檢測，結(jié)果顯示18 頭試驗(yàn)仔豬PRRSV 抗體陰性（表2），表明該18 頭仔豬可用于試驗(yàn)。

表1 18 頭仔豬病原體檢測結(jié)果

表2 18 頭仔豬PRRSV ELISA 抗體檢測結(jié)果

2.2 臨床指標(biāo)觀察結(jié)果

治療效果試驗(yàn)仔豬，試驗(yàn)開始后的第1 天和第2 天，采食量正常，精神狀態(tài)良好，體溫正常；陽性對照組和用藥組第3 天開始出現(xiàn)輕微咳嗽、鼻腔潰瘍及呼吸道癥狀，采食量下降，精神沉郁；第6 天開始，陽性對照組有2 頭仔豬體溫升高，皮膚發(fā)紅；用藥組在用藥后臨床癥狀并未得到明顯轉(zhuǎn)歸；陰性對照組仔豬采食量、體溫和精神狀態(tài)均正常，未表現(xiàn)PRRS 的典型臨床癥狀。治療效果試驗(yàn)期間，各組均無仔豬死亡。

預(yù)防效果試驗(yàn)仔豬，試驗(yàn)開始后的第1 天和第2 天，各組均采食量正常，體溫正常，精神狀態(tài)良好，陽性對照組仔豬在試驗(yàn)第3 ～7 天出現(xiàn)嚴(yán)重便秘，咳嗽，背毛粗糙，采食量明顯下降，體溫升高，第9 天，死亡一頭仔豬，死亡率為33.33%；用藥組仔豬則僅表現(xiàn)輕微便秘，背毛光亮，采食量、體溫和精神狀態(tài)均正常，無死亡情況；陰性對照組仔豬，試驗(yàn)中所檢查的各項(xiàng)指標(biāo)均正常，未表現(xiàn)PRRSV 典型臨床癥狀，無死亡情況。

2.3 PRRSV 核酸檢測結(jié)果

對治療效果試驗(yàn)和預(yù)防效果試驗(yàn)仔豬第7、10、13 天采取的血液進(jìn)行實(shí)時熒光RT-PCR 檢測，結(jié)果顯示，兩批仔豬，試驗(yàn)第7 天均已感染PRRSV（圖1），治療效果試驗(yàn)中（圖1-A），陽性對照組和用藥組仔豬第10、13 天血液病毒載量均升高，但用藥組仔豬血液PRRSV 病毒載量低于陽性對照組仔豬，且病毒載量上升的速率低于陽性對照組仔豬，表明該方劑對PRRSV 增值有抑制作用，對PRRS的治療有一定效果。預(yù)防效果試驗(yàn)中（圖1-B），陽性對照組和用藥組仔豬第10、13 天血液病毒載量同樣升高，但用藥組仔豬血液PRRSV病毒載量同樣低于陽性對照組仔豬，預(yù)防效果與治療效果趨勢相似，表明該組方對PRRS 亦有一定的預(yù)防作用。陰性對照組檢測無Ct值，表明陰性對照組仔豬無PRRSV感染。

圖1 試驗(yàn)仔豬第7、10、13 天血液PRRSV 實(shí)時熒光RT-PCR 結(jié)果

對于試驗(yàn)進(jìn)行14 d 后的仔豬組織研磨液進(jìn)行實(shí)時熒光RT-PCR 檢測PRRSV，結(jié)果顯示（圖2），治療效果試驗(yàn)和預(yù)防效果試驗(yàn)仔豬用藥組組織研磨液中病毒量均明顯低于陽性對照組（P＜0.01），陰性對照組檢測無Ct 值，表明陰性對照組仔豬無PRRSV 感染。

圖2 仔豬第14 天組織研磨液PRRSV 實(shí)時熒光RT-PCR 結(jié)果

3 討論

PRRS 至今仍是威脅養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前防控PRRS 主要以接種疫苗為主，我國免疫2 ～3次PRRS 疫苗的豬場占67%，也正是疫苗高接種率造成了豬場大面積感染，尤以長期免疫弱毒活苗豬場為主。究其主要原因是豬只自身感染病毒毒株與PRRS 疫苗毒株，疫苗毒與野毒之間可能發(fā)生基因重組導(dǎo)致毒株多形性，加之疫苗毒在豬場循環(huán)和傳播，導(dǎo)致PRRS 的防控難度大大增加。PRRSV 可通過破壞呼吸道粘膜及纖毛、抑制肺泡巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)巨噬細(xì)胞的吞噬作用、改變T 淋巴細(xì)胞亞群來降低機(jī)體免疫機(jī)能，造成免疫抑制，從而繼發(fā)其他病原體感染。豬場常見疫病如PCV、PRV 以及支原體等感染與PRRSV 感染有密不可分的關(guān)系，因此，急需特效藥來預(yù)防和治療PRRS。孫耀貴等研究發(fā)現(xiàn)黨參可通過保護(hù)肝細(xì)胞、改善肝功能、提高免疫反應(yīng)及抗氧化等多種途徑共同增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能；潘美霖研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)可提高巨噬細(xì)胞增殖能力與吞噬能力，對PRRSV 具有阻斷、抑制、殺滅作用；尹天福等綜述了茯苓等中藥能調(diào)理母豬免疫平衡，維持藍(lán)耳病抗體水平穩(wěn)定和解除藍(lán)耳免疫抑制；冼瓊珍等采用對PRRSV 的阻斷、抑制和直接殺滅3 種方式觀察16 種中藥體外抗PRRSV 的作用發(fā)現(xiàn)，知母可用于抗PRRSV。以上中藥均表現(xiàn)出增強(qiáng)免疫力和抗PRRSV作用，為本研究將黨參、白術(shù)、茯苓、知母等6 味中藥進(jìn)行組方，在減抗替抗大背景下，用以防控PRRS 提供一種新的思路和方法。

PRRS 屬外感溫?zé)岵》懂牐R床發(fā)病豬主要表現(xiàn)為持續(xù)發(fā)熱、懷孕母豬流產(chǎn)和呼吸道癥狀等，中獸醫(yī)防治則以“增免解毒”、“清熱燥濕”、“健脾益肺”為原則。本研究以黨參、白術(shù)、茯苓、知母等6 味中藥組方，通過拌料的方式對PRRSV 自然感染仔豬進(jìn)行用藥，通過體溫、采食量等臨床指標(biāo)和血液、組織研磨液中的PRRSV 載量來評價其防控效果。研究發(fā)現(xiàn)，治療效果試驗(yàn)中的仔豬，在與已知PRRSV 陽性豬同群飼喂7 d 后開始用藥，用藥組與PRRSV陽性對照組均出現(xiàn)精神沉郁、咳嗽等癥狀，在用藥后并未出現(xiàn)明顯癥狀好轉(zhuǎn)，分析原因可能是此時用藥時間過晚，出現(xiàn)臨床癥狀表現(xiàn)后不容好轉(zhuǎn)。在PRRSV 檢測中，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)第7 天均已感染PRRSV，第10、13 天病毒量仍在上升，可能是由于PRRSV 仔豬體內(nèi)病毒增殖并未達(dá)到巔峰。但值得注意的是，用藥組仔豬PRRSV 載量上升的速率明顯緩于陽性對照組，表明該組方對于PRRSV 的增殖有一定減緩和抑制作用，對PRRS 的治療有一定效果；預(yù)防效果試驗(yàn)中，陽性對照組仔豬表現(xiàn)出明顯的PRRS 癥狀，而用藥組仔豬則精神正常，僅表現(xiàn)輕微便秘，其他臨床指標(biāo)同陰性對照仔豬。檢測仔豬血液PRRSV 載量時，發(fā)現(xiàn)用藥組在試驗(yàn)開始時病毒載量即低于陽性對照組，可能是在中藥作用下，機(jī)體免疫力增強(qiáng)，抑制了病毒入侵與增殖，且該抑制作用一直持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束，表明該組方對于PRRS 的預(yù)防可起到一定作用。對試驗(yàn)仔豬組織研磨液的PRRSV 檢測結(jié)果顯示，治療效果試驗(yàn)和預(yù)防效果試驗(yàn)的仔豬用藥組PRRSV 載量均明顯低于陽性對照組（P＜0.05），表明本研究的中藥組方對PRRS 的預(yù)防和治療均有一定的效果；治療和預(yù)防試驗(yàn)效果對比顯示，預(yù)防效果試驗(yàn)用藥組病毒載量和臨床癥狀改善程度均明顯強(qiáng)于治療效果試驗(yàn)（P＜0.05），因此，用藥越早，越有利于PRRS 的防控。

PRRSV 作為一種高度傳染性疾病，已成為全球養(yǎng)豬業(yè)面臨的主要難題之一。本研究通過黨參、白術(shù)、茯苓、知母等6 味中藥組方給藥PRRSV 感染仔豬，發(fā)現(xiàn)雖不能完全抑制PRRSV 的增殖，但收到了一定預(yù)防和治療效果，且該組方越早使用，越有利于抑制病毒增值，減輕PRRS 癥狀，為PRRS 的防控提供新的思路與幫助。