Survivin基因沉默誘導宮頸癌細胞凋亡的實驗設計

劉艷紅， 李 靜， 王 娜， 張 驥， 李 坤

（四川大學a.基礎化學實驗教學中心；b.化學學院，成都 610064）

0 引 言

癌癥是惡性腫瘤細胞快速增殖導致的一種系統(tǒng)性疾病。傳統(tǒng)的癌癥治療方法主要有手術(shù)治療、化療和放射治療。但由于手術(shù)治療難以精準地切除所有癌細胞，而化療和放射治療存在毒副作用強、腫瘤細胞容易出現(xiàn)耐藥性等不足，導致癌癥的治療和術(shù)后效果不佳［1］。近年來，核酸類藥物的出現(xiàn)為癌癥的治療帶來了新的希望［2］。

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是由雙鏈RNA（dsRNA）分子在細胞中高效特異性結(jié)合同源mRNA，從而引起靶基因降解現(xiàn)象。目前發(fā)現(xiàn)具有誘導RNA沉默功能的核酸分子有3 類，即內(nèi)源性微小miRNA（microRNA，miRNA）、小干擾RNA（Small interefering RNA，siRNA）和發(fā)夾RNA（shRNA）。其中，siRNA 是人工合成的長度為21 ～25 bp 的雙鏈RNA分子（導鏈和隨從鏈），經(jīng)運載體傳輸進入細胞后，被DICER酶處理，隨從鏈被降解，導鏈組裝到RNA誘導產(chǎn)生的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC）中，與信使RNA（mRNA）的特定基因序列進行堿基互補配對形成新的雙鏈。隨后，RISC 中Argonaute 2 蛋白對雙鏈進行切割，導致靶基因被降解，最終達到基因表達沉默的目的［3-6］。由于siRNA對靶基因降解的特異性、高效性和安全性，使得siRNA成為惡性腫瘤、遺傳性疾病、神經(jīng)類疾病和病毒感染等領域研究最為活躍的核酸類藥物之一［7-8］。2018 年，全球首個siRNA 類藥物Onpattro 上市，到2022 年，siRNA類藥物已增加至5 個［9］。siRNA藥物的快速發(fā)展進一步推動了精準化、個性化基因治療在臨床應用。

由BIRC5 基因編碼的Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中最小的成員，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最有效的凋亡抑制蛋白。Survivin蛋白通過抑制半胱天冬酶的活性，發(fā)揮抗凋亡作用。動物組織分布研究顯示，Survivin具有高度的腫瘤組織表達和分布特異性，在幾乎所有的腫瘤細胞中有表達，而在正常終末分化組織中幾乎不表達，為此，在癌癥篩查檢測研究中，Survivin常被作為惡性腫瘤早期病變的標志物。Survivin 在癌細胞中的高表達可以降低癌細胞對化療藥物和放射治療的敏感性，抑制癌細胞的凋亡［10-11］。另外，Survivin 表達的上調(diào)與腫瘤復發(fā)和不良預后密切相關［12］。Norouzi 等［13］研究顯示，降低Survivin基因表達，有效提高了4T-1 細胞對抗腫瘤藥物阿霉素的敏感性，抑制了腫瘤細胞的增殖。

現(xiàn)以BIRC5 基因為靶點，通過傳輸特異性siRNA，有效敲低了Survivin蛋白的表達，探討Survivin蛋白水平下調(diào)對Hela 細胞凋亡的影響。實驗將siRNA 分子的遞送、基因表達水平檢測、細胞周期和細胞凋亡檢測等實驗技術(shù)進行了系統(tǒng)性設計，完整展現(xiàn)了基因干擾實驗研究的全過程，對于學生基礎科學思維的訓練和實踐探究能力的培養(yǎng)具有重要的意義。

1 實驗試劑和儀器

1.1 實驗試劑

聚乙烯亞胺（PEI，25KD）美國Sigma-Aldrich 公司；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、OPTI-MEM 培養(yǎng)基、Hoechst 33342、胎牛血清、SYBR Green 預混液、瓊脂糖和BCA蛋白檢測試劑盒，美國賽默飛世爾科技公司；Survivin siRNA （siSur）序列（正義鏈：5′-AGTCTGGCGTAAGATGATGGATTTG-3′；反義鏈5′-CACAGCAGTGTTTGAAATGACAGG-3′）， GAPDH siRNA 序列（siGAPDH），EGFP siRNA（siEGFP），Negtive siRNA，Survivin和GAPDH qPCR 引物，廣州銳博生物科技有限公司；Gelred、肝素鈉GreenNucTM活細胞Caspase-3 活性檢測試劑盒和Caspase-3 活性檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Tris-base、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉（SDS）、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗儀器

TS-100 型倒置顯微鏡，日本尼康公司；流式細胞儀，美國BD 公司；熒光定量PCR 儀和二氧化碳培養(yǎng)箱，美國賽默飛世爾科技公司；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；多功能分子熒光成像系統(tǒng)，美國Azure Biosystems 公司；多功能酶標儀，瑞士帝肯公司等。

2 實驗方法

2.1 凝膠阻滯實驗

PEI與siRNA按照不同的質(zhì)量比1、3、5、10 和20分別進行復合，其中，siRNA的用量為0.142 8 μg。二者在室溫孵育20 min 后，加入上樣緩沖液混合均勻，點樣至2 %瓊脂糖凝膠中進行電泳，并通過凝膠成像系統(tǒng)成像。

2.2 血清穩(wěn)定性檢測

PEI與siRNA按照質(zhì)量比7.5 進行復合，復合過程見2.1。然后，在體系中加入50 %的血清（v／v），37 ℃分別孵育0、0.5、1、3、6 和24 h后，每管加入終濃度為2.5 mg／mL的肝素鈉，37 ℃放置1 h 后，加入上樣緩沖液，采用瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

2.3 PEI介導的siRNA轉(zhuǎn)染實驗

Hela細胞消化計數(shù)后，按照1 ×105個／孔的細胞數(shù)量接種于24 孔細胞培養(yǎng)板中，于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，進行轉(zhuǎn)染實驗。實驗設置空白對照組、Negtive 陰性對照組、siRNA 對照組和轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染組中，PEI／ siRNA 復合物的制備方法：①取一定體積的PEI用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至50 μL；②用Opti-MEM培養(yǎng)基將siRNA 稀釋至50 μL；③將稀釋后的siRNA滴加至稀釋好的PEI溶液中，輕輕混勻，室溫下繼續(xù)復合20 min。然后，將細胞培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，每孔400 μL。吸取PEI／siRNA復合物滴加至孔中，前后推板混合均勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，再將板內(nèi)的培養(yǎng)基更換新鮮的完全培養(yǎng)基（500 μL／孔），繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 蛋白和基因表達水平的檢測

PEI介導siEGFP 轉(zhuǎn)染48 h后，通過倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（EGFP）的表達。同時，采用流式細胞術(shù)檢測有血清和無血清條件下，Hela／EGFP 細胞株中EGFP 蛋白的表達情況。PEI／siSur 轉(zhuǎn)染48 h后，采用Trizol法提取細胞總RNA，并通過實時熒光定量PCR 法檢測Survivin 基因水平的表達情況。Survivin qPCR 的引物為正義鏈：5′-AGTCTGG CGTAAGATGATGGATTTG-3′；反義鏈：5′-CACAGCAGTGTTTGAAATGACAGG-3′。PCR 的反應條件為95℃預變性5 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 個循環(huán)。GAPDH 作為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt法計算目的基因Survivin在mRNA水平的相對表達。

2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

Hela細胞經(jīng)PEI／siSur 轉(zhuǎn)染48 h 后，用胰酶消化細胞，然后，將細胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL 的EP 管中，離心（1 000 r／min×5 min），棄上清。在收集到的細胞中加入預冷的70 %乙醇，每管1 mL，4 ℃固定24 h，1 000 r／min離心5 min，棄上清。用預冷的PBS緩沖液漂洗2次后，每管加入500 μL PI染色液（含50 μg／mL PI、50 μg／mL RNase A 和0.2% Triton X-100 的PBS緩沖液）室溫染色30 min，用流式細胞儀進行檢測。

2.6 Caspase-3 活性檢測

2.6.1 原位染色檢測Caspase-3 活性

PEI／siSur 轉(zhuǎn)染48 h 后，吸去孔中培養(yǎng)基，加入PBS緩沖液，每孔500 μL。在不同處理組中分別加入5 μM Caspase-3 酶熒光底物，37 ℃孵育30 min 后，在倒置熒光顯微鏡下觀察并隨機選取3 ～6 個視野成像。熒光底物的最大激發(fā)和發(fā)射波長為500／530 nm。

2.6.2 熒光法測定Caspase-3 活性

細胞消化后離心收集，在每200 萬個細胞中加入100 μL細胞裂解液后，置于冰上裂解15 min，4 ℃離心（20 000 g ×10 min），吸取上清并測定蛋白濃度。然后，參照Caspase-3 活性檢測試劑盒說明書，將底物pNA進行稀釋，測定405 nm處的吸光值，并繪制標準曲線。按照Caspase-3 活性檢測方法分別加入檢測緩沖液、待測樣品和底物Ac-DEVD-pNA，37 ℃反應3 h后測定405 nm處的吸光值，并根據(jù)標準曲線，計算待測樣品中pNA的含量。

2.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標準差（X±s）表示，實驗結(jié)果用t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 PEI／siRNA復合物的穩(wěn)定性

由于siRNA是一種表面帶有較強負電荷的柔性生物大分子，很難通過擴散的方式進入細胞。另外，siRNA的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易被環(huán)境或血漿中的核酸酶降解。而高效、安全的運載體可以有效維持siRNA 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并將其傳輸?shù)郊毎校?4］。PEI 是具有高效基因轉(zhuǎn)染性能的陽離子聚合物，通過靜電相互作用的方式快速結(jié)合并壓縮核酸分子，形成穩(wěn)定的復合物，保護核酸分子免受核酸酶的降解［15］。實驗通過凝膠阻滯電泳分析了PEI與siRNA 復合的質(zhì)量比，結(jié)果顯示，當PEI／siRNA復合的質(zhì)量比為1 時，可以清晰地觀察到siRNA的條帶，當二者的質(zhì)量比為3 時，siRNA分子在凝膠電泳上的遷移完全被阻滯［見圖1（a）］，表明siRNA分子與PEI形成了穩(wěn)定的復合物。圖1（b）進一步探討了血清對siRNA分子穩(wěn)定性的影響，實驗結(jié)果顯示裸siRNA分子與血清孵育0.5 h 后，條帶的亮度明顯降低，孵育3 h 后，條帶消失，表明siRNA 分子被血清中的核酸酶降解。而PEI／siRNA 復合物與血清共孵育24 h后，依然可以清晰地觀察到核酸條帶。該結(jié)果表明PEI與siRNA復合后，有效阻斷了核酸酶對siRNA的降解，延長了siRNA在血清中穩(wěn)定的時間。

3.2 EGFP表達水平檢測

PEI與siRNA的復合質(zhì)量比可以影響siRNA傳輸?shù)男剩档桶谢虺聊男Ч?。實驗通過敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株Hela／EGFP 中報告基因EGFP 的表達，考察了PEI與siRNA不同復合質(zhì)量比對基因沉默的影響。其中Hela／EGFP穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞設為空白對照組。結(jié)果顯示，在空白對照組和siEGFP 組中可以觀察到大量的綠色熒光點，該綠色熒光點即為表達EGFP 的陽性細胞。而PEI／siEGFP按不同質(zhì)量比復合的轉(zhuǎn)染組中，綠色熒光蛋白的表達量明顯降低，其中，當PEI 與siEGFP 的復合質(zhì)量比為5 時，綠色熒光信號顯著減弱，當復合質(zhì)量比為7.5 時，視野中觀察到微弱的熒光信號，EGFP熒光蛋白幾乎不表達（見圖2），這是由于PEI 介導的siEGFP傳輸有效干擾了靶基因EGFP 的翻譯過程，敲低了EGFP蛋白的表達。該結(jié)果表明PEI復合siEGFP沉默基因表達的最佳復合質(zhì)量比為7.5。

圖2 EGFP表達的熒光成像圖

3.3 血清對siRNA基因傳輸?shù)挠绊?/h3>

實驗通過流式細胞術(shù)檢測了有血清和無血清條件下，PEI／siEGFP 對靶基因的沉默效率，進一步考察了血清對siRNA傳輸?shù)挠绊憽＝Y(jié)果如圖3所示，與空白對照組相比，在無血清轉(zhuǎn)染條件下，EGFP 蛋白的表達量下調(diào)了55.6%，而有血清轉(zhuǎn)染條件下，EGFP蛋白的表達量僅下降了38.4%，該結(jié)果表明有血清條件下，PEI／siRNA的轉(zhuǎn)染效率明顯降低。這是由于血清中大量存在的血清蛋白與PEI／siEGFP 結(jié)合，導致PEI／siEGFP復合物不穩(wěn)定，降低了siRNA的傳輸效率［16］。

3.4 Survivin基因水平檢測

PEI／siSur轉(zhuǎn)染Hela 細胞后，采用實時熒光定量PCR的方法檢測Survivin基因水平表達的情況。結(jié)果如圖4 所示，PEI 介導的SiSur 基因轉(zhuǎn)染組中，Survivin基因的表達水平僅為空白對照組的42% （P＜0.001）。表明PEI／siSur 的高效遞送有效降低了Survivin基因mRNA水平的表達。

圖4 qPCR檢測Survivin基因的表達

3.5 細胞周期檢測

Survivin在腫瘤組織中特異性分布和高表達抑制了腫瘤細胞的凋亡，研究顯示，在細胞有絲分裂過程中，Survivin可以與調(diào)節(jié)細胞周期的關鍵性激酶CDK1相互作用，穩(wěn)定有絲分裂期的細胞，抑制細胞死亡［17］。實驗通過分析腫瘤細胞的周期變化，探討敲低Survivin蛋白表達對細胞凋亡的影響。實驗結(jié)果見圖5，與空白對照組和陰性對照組相比，PEI／siSur 基因轉(zhuǎn)染后，細胞周期發(fā)生了明顯的變化，其中G0／G1 期的細胞比例顯著減少，而G2／M期的細胞比例顯著增加，且出現(xiàn)了明顯的細胞凋亡峰。該結(jié)果表明沉默Survivin 基因，下調(diào)Survivin蛋白表達后，Hela 細胞的細胞周期阻滯于G2／M期，細胞的凋亡率明顯增加。

圖5 Survivin基因沉默對細胞周期的影響

3.6 Caspase-3 活性檢測

Caspase-3 是細胞凋亡信號通路中的關鍵性激酶。當細胞凋亡通路被激活時，Procaspase-3 被剪切形成有活性的Caspase-3 激酶?；罨腃aspase-3 激酶剪切反應底物，去除與熒光染料耦鏈的DEVD 多肽，使熒光染料與細胞DNA結(jié)合，從而檢測到綠色熒光。實驗通過原位熒光染色探討了降低Survivin 蛋白表達對細胞凋亡信號通路的影響。結(jié)果見圖6（a），與空白對照組相比，PEI介導SiSur基因轉(zhuǎn)染組中檢測到明顯的綠色熒光，表明Survivin蛋白表達下調(diào)后，Caspase-3 激酶被激活。熒光檢測結(jié)果同樣顯示siSur 基因轉(zhuǎn)染組中，Caspase-3 激酶的活性顯著高于空白組和陰性對照組［見圖6（b）］，提示敲低Hela 細胞中Survivin 蛋白的表達后，Procaspase-3 剪切形成有活性的Caspase-3 激酶，細胞凋亡信號通路被激活。

圖6 Caspase-3的活性檢測

4 結(jié) 語

基于患者基因修正的精準治療是未來惡性腫瘤和先天性疾病治療重要策略，而核酸類藥物的持續(xù)性研究為個性化基因治療提供了更多可選擇的靶點。實驗通過基因干擾方法敲低了宮頸癌細胞中高表達的Survivin基因，結(jié)果表明下調(diào)Survivin 表達后，Hela 細胞的細胞周期發(fā)生了明顯變化，G0／G1 期細胞比例減少，G2／M期細胞比例顯著增加，且出現(xiàn)明顯的細胞凋亡峰，同時，與細胞凋亡相關的關鍵性激酶Caspase-3活化，細胞凋亡通路被激活。該研究表明Survivin 基因的高表達在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，敲低Survivin 表達促進了宮頸癌細胞的凋亡。Survivin基因有望成為未來宮頸癌治療重要靶點。