載藥ZIF-8對醫(yī)用高分子材料表面生物膜的清除性能分析

丁夢 宋凌杰 欒世方

1（中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所， 高分子物理與化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長春 130022）2（中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)與工程學(xué)院， 合肥 230026）

隨著人口老齡化程度加深以及醫(yī)療水平提升，全球市場對各類醫(yī)療器械的需求持續(xù)擴(kuò)大。據(jù)估計(jì)，至2025 年，全球醫(yī)療器械市場總規(guī)?？蛇_(dá)7667 億美元，僅中國市場就可達(dá)636 億美元[1]；其中，植介入醫(yī)療器械的全球市場需求于2022 年達(dá)到986 億美元，預(yù)計(jì)在2032 年將增至1663 億美元[2]。醫(yī)用高分子材料被廣泛應(yīng)用于植介入醫(yī)療器械的制備。例如，聚丙烯（PP）常用于制作各類修補(bǔ)片、輸血管、輸液管和導(dǎo)管等醫(yī)療耗材[3]；聚乙烯（PE）常用于制作人工器官、人工關(guān)節(jié)和矯形外科修補(bǔ)材料[4]；熱塑性聚氨酯（TPU）因其摩擦系數(shù)小、柔順性好以及安全性高的特點(diǎn)而被用于制作中央靜脈導(dǎo)管、內(nèi)窺鏡和導(dǎo)尿管等；同樣具有良好彈性和柔軟度的硅橡膠則廣泛應(yīng)用于制造人工顱骨、心臟瓣膜、人工耳和填充假體等[5]；硅橡膠具有極低的摩擦系數(shù)和優(yōu)良的化學(xué)性穩(wěn)性及生物相容性，用于制造心臟、肺、氣管和腹膜等多種人工器官[6]。然而，植介入高分子醫(yī)療器械相關(guān)的院內(nèi)感染是臨床常見的并發(fā)癥，導(dǎo)致住院時(shí)間延長，治療成本增加，甚至危及患者生命[7-9]。細(xì)菌生物膜的形成是發(fā)生醫(yī)療器械感染的關(guān)鍵，而且所有植介入醫(yī)療器械都有出現(xiàn)生物膜相關(guān)感染的風(fēng)險(xiǎn)，包括心臟起搏器、血液透析器、導(dǎo)尿管和中央靜脈導(dǎo)管等[10]。游離的細(xì)菌細(xì)胞在器械表面發(fā)生粘附后會(huì)自發(fā)分泌胞外聚合物基質(zhì)（EPS），將細(xì)菌包裹于內(nèi)部而形成生物膜，從而抵御外界殺菌劑和宿主免疫反應(yīng)的攻擊。此外，生物膜內(nèi)部細(xì)菌也會(huì)通過調(diào)整代謝狀態(tài)減輕抗生素的傷害[11]。因此，相比于游離細(xì)菌，生物膜內(nèi)部的細(xì)菌對殺菌劑的耐受能力可高出1000 倍，是造成久治不愈的慢性感染的主要原因[12]。植介入醫(yī)療器械相關(guān)的生物膜感染已成為亟待解決的全球性重大健康問題。

目前，臨床上最常用的醫(yī)療器械表面生物膜的預(yù)防和清除手段仍是抗生素治療，然而由于抗生素劑量有限且具有一定的副作用，醫(yī)療器械和周圍組織中的生物膜感染總是難以根治，而且抗生素治療同樣容易引起耐藥菌的出現(xiàn)和傳播，會(huì)進(jìn)一步加重細(xì)菌感染[13-14]。移除/置換手術(shù)能夠有效避免植介入器械部位的感染復(fù)發(fā)，但這種方法創(chuàng)傷程度高，不僅會(huì)對患者造成身心傷害，也會(huì)大幅增加患者和醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[15]。近年來，基于對細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的研究，利用納米藥物載體遞送殺菌劑而直接殺傷生物膜內(nèi)細(xì)菌的策略，為治療頑固性生物膜提供了新思路[16]。如上所述，生物膜EPS 能夠通過相互作用或者胞外酶攔截抗生素的滲透，采用尺寸和表面性質(zhì)可調(diào)控的納米載體能夠增強(qiáng)藥物的遞送，例如，正電性的納米載體能夠通過靜電相互作用增強(qiáng)對負(fù)電性生物膜的滲透，而粒徑小于350 nm 的納米粒子能夠通過孔道擴(kuò)散進(jìn)入生物膜[17]。此外，由于生物膜內(nèi)部具有與外界健康組織不同的理化性質(zhì)（微酸、乏氧和氧化還原狀態(tài)異常等）[18]，通過構(gòu)建刺激響應(yīng)型納米載體遞送抗生素，可以有效避免藥物過早釋放，同時(shí)提高局部藥物濃度，實(shí)現(xiàn)生物膜的清除[19]。因此，納米藥物載體的遞送策略有望成為解決醫(yī)療器械表面生物膜感染問題的新方法。

沸石咪唑酯框架-8（ZIF-8）是一種由Zn2+和2-甲基咪唑組成的金屬有機(jī)框架（MOF）材料，其制備條件溫和，尺寸可調(diào)，而且能夠通過原位封裝或后修飾負(fù)載多種小分子及大分子；此外，ZIF-8 在酸性環(huán)境中會(huì)自發(fā)降解，因此可作為刺激響應(yīng)藥物載體[20]。萬古霉素（Van）是一種對革蘭氏陽性菌有強(qiáng)殺菌作用的糖肽類抗生素，特別是臨床治療耐藥葡萄球菌感染有很好的療效[21]?；诖?，本研究通過一步法制備了負(fù)載Van的ZIF-8 納米藥物載體，并對其性質(zhì)進(jìn)行了表征，探究了其去除醫(yī)用高分子表面細(xì)菌生物膜的能力（圖1）。

圖1 沸石咪唑酯框架-8（ZIF-8）負(fù)載萬古霉素（Van）去除醫(yī)用高分子表面生物膜的示意圖Fig.1 Schematic diagram of elimination of biofilms on medical polymer surface by vancomycin (Van)-loading zeolitic imidazolate framework-8 (ZIF-8)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Model XL 30 ESEM FEG 掃描電子顯微鏡（SEM，荷蘭Philips 公司）；Vertex 70 傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR，德國Bruker 公司）；D8 Advance X 射線衍射儀（PXRD，德國Bruker 公司）；Auto iQ Station 2 比表面和孔徑分布分析儀（奧地利Anton-Paar 公司）；Lamda 35 紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis，美國PerkinElmer公司）；Tecan Sunrise 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）。

Zn（NO3）2·6H2O（分析純）和鹽酸萬古霉素（Vancomycin，Van，≥900 μg/mg），（麥克林公司）；2-甲基咪唑（98%，阿拉丁公司）；金黃色葡萄球菌（S.aureus.ATCC6538，南京便診公司）；噻唑藍(lán)（MTT，≥98%，索萊寶公司）；二甲基亞砜（DMSO，西隴科學(xué)公司）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 載藥MOF制備

向12 mL Zn（NO3）2·6H2O 溶液（250 mg/mL）中分別加入10、20、40 和80 mg 的Van（分別記為V10、V20、V40 和V80），攪拌至溶解；邊攪拌邊加入1.2 mL 2-甲基咪唑溶液（250 mg/mL），室溫?cái)嚢? h；以8000 r/min 離心10 min， 收集沉淀并用超純水洗滌3 次，保留上清液。沉淀于60 ℃過夜烘干。采用相同方法制備不含Van 的ZIF-8。

1.2.2 Van負(fù)載量測定

分別配制15.6、25.0、31.2、50.0、62.5、100、125、200、250、400 和500 μg/mL 的Van 溶液，測定280 nm 處吸光度，并繪制相應(yīng)的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定材料制備過程中所保留的上清液于280 nm 處吸光度，并根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中Van 含量，根據(jù)公式（1）和（2）分別計(jì)算載藥量（DLC）和包封率（DLE）：

其中，mi為投入Van 總量，ms為上清液中Van 含量，mp為產(chǎn)物質(zhì)量。

1.2.3 藥物釋放曲線測定

將675 μL 20 mg/mL V80 分散液分別加到36.3 mL pH=5.5 和pH=7.4 的PBS 緩沖液（137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L NaH2PO4、2 mmol/L KH2PO4）中，置于搖床中，以120 r/min 振蕩10、20、30、60、120、240、300、360 和1080 min 后，取樣，離心，測定上清液于280 nm 處的吸光度。根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算釋放的Van 量。

1.2.4 V80對醫(yī)用高分子表面生物膜清除性能的測定

將0.7 cm×0.7 cm 的PE 膜（茂名石化公司）、PP 膜（威高集團(tuán)有限公司）、TPU 膜（BASF 公司）和PDMS 膜（興業(yè)塑膠廠）分別浸入400 μLS.aureus菌液（OD=0.2）中，37 ℃培養(yǎng)24 h。高分子膜用生理鹽水清洗一次后，加入400 μL 各樣品（ZIF-8、Van、ZIF-8 與Van 共混物、V80，其中，Van 的濃度與V80 載藥量一致）的培養(yǎng)基分散液，37 ℃下靜置6 h，隨后去除樣品液，用生理鹽水清洗1 次，進(jìn)行下一步處理。

對于采用MTT 法測定殘留生物膜內(nèi)細(xì)菌活力的樣品，將膜轉(zhuǎn)移至新的孔板中，加入400 μL MTT 溶液（0.5 mg/mL）中，37 ℃孵育2 h，此過程中細(xì)菌的還原酶能夠?qū)TT 轉(zhuǎn)換為藍(lán)紫色沉淀，沉淀量與細(xì)菌總活力成正比。去除MTT 溶液，加入400 μL DMSO 充分溶解沉淀，待生成的沉淀完全溶解后，將溶液轉(zhuǎn)移至96 孔板，測定570 nm 處的吸光度。

對于采用菌落計(jì)數(shù)法測定殘留生物膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的樣品，將膜轉(zhuǎn)移至含有1 mL 生理鹽水的離心管中，超聲3 min，稀釋10000 倍后，吸取5 μL 菌液滴于瓊脂板上靜置，待其干燥，37 ℃下培養(yǎng)15 h 后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量。

1.2.5 ZIF-8與V80的溶血性能的測定

將5%（V/V）紅細(xì)胞生理鹽水分散液與各樣品的生理鹽水分散液以體積比1∶1 共混，以去離子水和生理鹽水分別作為陽性和陰性對照，于37 ℃下孵育1.5 h，以3000 r/min 離心3 min，收集上清液，測定其在540 nm 處的吸光度（OD），溶血率根據(jù)公式（3）計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 負(fù)載萬古霉素ZIF-8 的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

通過SEM 對V10、V20、V40、V80 和不添加Van 的ZIF-8 進(jìn)行形貌掃描（圖2A～2E），所有樣品基本為粒徑＜100 nm 的顆粒狀。其中，ZIF-8 粒子有相互粘連的趨勢，V10、V20 和V40 顆粒邊緣相對清晰，這可能是由于少量Van 絡(luò)合Zn2+，穩(wěn)定了ZIF-8 的生長；V80 粒子粗糙且形狀相對不規(guī)整，這可能是由于添加的大量Van 影響了ZIF-8 有序結(jié)晶過程[22]。統(tǒng)計(jì)分析所有樣品的粒徑可知，除V80 外，樣品的粒徑都集中在50～80 nm 范圍內(nèi)，而V80 出現(xiàn)了粒徑約100 nm 的較大粒子（圖2F）。通過FTIR 光譜判斷Van是否負(fù)載進(jìn)入ZIF-8（圖2G）。結(jié)果表明，V10、V20、V40 和V80 的圖譜中均出現(xiàn)了屬于Van 的C—O—C鍵的吸收峰（1230 cm–1）以及C=O 鍵的吸收峰（1660 cm–1），說明這4 種樣品均成功負(fù)載了Van；此外，V40 和V80 圖譜中還出現(xiàn)了屬于Van 的C—N 吸收峰（1062 cm–1），說明V40 和V80 中Van 含量更高[23]。

采用粉末X 射線衍射對樣品的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。樣品V10、V20、V40 和V80 都出現(xiàn)了與ZIF-8相同的特征衍射峰，在2θ為7.3°、10.3°、12.7°、14.6°、16.4°和18.0°處的衍射峰分別對應(yīng)ZIF-8 晶體的（110）、（200）、（211）、（220）、（310）和（222）晶面（圖2H），這說明負(fù)載Van 后樣品仍能保持ZIF-8 的長程有序結(jié)構(gòu)[24]。此外，采用氮?dú)馕?脫附測試方法分析樣品的比表面積和孔徑，如圖2I 所示，所有樣品都呈現(xiàn)與ZIF-8 一致的Ⅰ型吸附等溫線，說明其內(nèi)部的微孔性質(zhì)相似[24]。ZIF-8、V10、V20、V40 和V80 的BET 比表面積分別為1804.933、1596.005、1516.451、1439.201 和1257.446 m2/g， 隨著Van 添加量增加而依次減小，說明負(fù)載Van 會(huì)導(dǎo)致ZIF-8 框架的微孔減少[25]。

2.2 負(fù)載萬古霉素ZIF-8 的藥物釋放性質(zhì)

采用UV-Vis 吸收光譜測定Van 的最大吸收峰（圖3A），根據(jù)其280 nm 處最大吸收峰繪制濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3B），計(jì)算負(fù)載Van 樣品中的藥物含量。V10、V20、V40 和V80 的DLC 質(zhì)量百分比分別為2.35%、4.74%、9.68%和18.20%，DLE 分別為70.42%、71.16%、72.62%和66.62%。隨著合成過程中Van 添加量增加，DLC 不斷增大，并且基本與添加量成正比關(guān)系，當(dāng)添加量達(dá)到80 mg 時(shí)，DLE 明顯下降，說明繼續(xù)增加添加量增加，盡管能增大載藥量，但同時(shí)也會(huì)造成更多的藥物浪費(fèi)。通過測定V80 樣品在不同pH 值條件下的藥物釋放曲線驗(yàn)證其酸性降解性質(zhì)。在酸性磷酸鹽緩沖液（pH=5.5）中，V80可在6 h 內(nèi)釋放90%的Van；在中性條件（pH=7.4）下，V80 在6 h 時(shí)內(nèi)只能釋放20%的Van（圖3C），充分說明V80 具有在酸性條件下降解的性質(zhì)。生物膜細(xì)菌在代謝過程中會(huì)積累酸性產(chǎn)物，導(dǎo)致微環(huán)境呈弱酸性，因此V80 有望在弱酸性的細(xì)菌生物膜微環(huán)境中釋放負(fù)載藥物Van。

圖3 載藥ZIF-8 的篩選及酸性響應(yīng)性能：（A）Van 的吸收光譜；（B）Van 的濃度校準(zhǔn)曲線；（C）V80 在不同pH 值條件下的藥物釋放曲線（a：pH=5.5，b：pH=7.4）Fig.3 Screening of drug-loading ZIF-8 and the acid-responsive property: (A) Absorption spectrum of Van;(B) Calibration curve of Van; (C) Drug release curves of V80 at different pH values (a: pH=5.5, b: pH=7.4)

2.3 V80對醫(yī)用高分子表面生物膜清除性能分析

在4 種常見的高分子膜（PP、PE、TPU 和PDMS）的表面構(gòu)建生物膜，研究V80 對其表面生物膜的清除能力。通過細(xì)胞增殖染色（MTT）法測定經(jīng)V80 處理后高分子膜表面殘留細(xì)菌生物膜的活力（圖4A～4D）。對于不同基底膜上生長的細(xì)菌生物膜，V80 均可有效降低細(xì)菌存活率至20%以下（PP：11.6%；PE：10.5%；TPU：17.0%；PDMS：10.1%）。隨著V80 濃度增大，總體細(xì)菌活力下降幅度增大，殺菌效率提高。其中，V80 處理后的TPU 表面殘留生物膜細(xì)菌活力最高，殺菌效果較差，這可能是由于在MTT 測試過程中，生物膜細(xì)菌經(jīng)代謝產(chǎn)生的藍(lán)紫色甲臜沉積于生物膜內(nèi)，在下一步DMSO 溶解時(shí)，沉淀仍保留于生物膜中，造成所測細(xì)菌活力偏低；TPU 會(huì)在DMSO 中溶脹，其表面的生物膜破碎，并將沉淀釋放至溶液中，因此所測細(xì)菌活力與真實(shí)值更接近，也比其它組別更高[26]。對比ZIF-8、Van、ZIF-8 與Van 共混物（Z+V）與V80 對基底膜表面生物膜的清除效果，Z+V 中的Van 濃度與V80 所負(fù)載的Van 濃度一致，V80 對細(xì)菌生物膜的清除能力顯著強(qiáng)于ZIF-8、Van 和Z+V（圖5A～5D），這可能是由于：（1）V80的納米粒子載體有助于將Van 遞送進(jìn)入生物膜內(nèi)，避免Van 被生物膜基質(zhì)截留或被細(xì)菌外泌酶破壞而導(dǎo)致失活[22]；（2）來自于ZIF-8 的Zn2+能夠通過誘導(dǎo)Van 形成二聚體增強(qiáng)Van 的抗菌活性[22]。

圖4 使用MTT 法測定V80 對不同醫(yī)用高分子基底上生物膜的清除能力：（A～D）不同濃度V80 處理后的PP、PE、TPU 和硅橡膠表面殘余生物膜活力Fig.4 Elimination property of V80 against biofilms on different medical polymer substrates determined by MTT assay:(A–D)Bacterial survival on PP,PE,TPU and silicone rubber surface after treated with different concentrationsof Van PP,聚丙烯(Polypropylene);PE,聚乙烯(Polyethylene);TPU,熱塑性聚氨酯(Thermoplastic polyurethane);Z+V,ZIF-8 與Van 的物理共混物(Physic mixture of ZIF-8 and Van)

圖5 使用MTT 法測定不同樣品對醫(yī)用高分子基底上生物膜的清除能力：ZIF-8、Van、Z+V 和V80 處理后的（A）PP、（B）PE、（C）TPU 和（D）硅橡膠表面殘余生物膜活力Fig.5 Elimination property of different samples against biofilms on medical polymer substrate determined by MTT assay: Bacterial survival on (A) PP, (B) PE, (C) TPU and silicone rubber surface after treated with ZIF-8,Van, Z+V and V80

采用菌落計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)樣品處理過的附著生物膜內(nèi)所含有的細(xì)菌。結(jié)果表明，ZIF-8、Van、Z+V 和V80 都能顯著降低生物膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)量（圖6），但趨勢與MTT 測定結(jié)果相差較大，這可能是由于：（1）兩者測定對象不同，MTT 測定細(xì)菌相對活力，而菌落計(jì)數(shù)法測定可繁殖的細(xì)菌數(shù)量。對于生物膜內(nèi)具有活力但不繁殖的細(xì)菌，MTT 法可測定，而菌落計(jì)數(shù)無法統(tǒng)計(jì)；（2）菌落計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)的是超聲過程中脫落在生理鹽水中的細(xì)菌數(shù)量，對于超聲不脫落的細(xì)菌，MTT 法可測定其活力而菌落計(jì)數(shù)無法統(tǒng)計(jì)。綜合MTT測定結(jié)果與菌落計(jì)數(shù)結(jié)果可知，V80 能夠有效去除醫(yī)用高分子表面形成的細(xì)菌生物膜，并且Van 負(fù)載于ZIF-8 的形式明顯優(yōu)于兩者共混的形式。

圖6 使用菌落計(jì)數(shù)法測定V80 對不同醫(yī)用高分子基底上生物膜的清除能力：ZIF-8、Van、Z+V 和V80 處理后的（A）PP、（B）PE、（C）TPU 和（D）硅橡膠表面殘余細(xì)菌數(shù)量統(tǒng)計(jì)；（E～H）ZIF-8、Van、Z+V和V80 處理后的PP、PE、TPU 和硅橡膠表面菌落計(jì)數(shù)照片F(xiàn)ig.6 Elimination property of V80 against biofilms on different medical polymer substrates determined by plate colony counting assay: (A–D) Bacterial number on PP, PE, TPU and silicone rubber surface after treated with ZIF-8,Van,Z+V and V80;Bacterial colony photos of(A)PP,(B)PE,(C)TPU and silicone rubber surface after treated with ZIF-8, Van, Z+V and V80

2.4 V80的血液相容性

通過溶血實(shí)驗(yàn)檢測ZIF-8 與V80 的血液相容性。ZIF-8 濃度在0.2 mg/mL 以下時(shí)基本無溶血現(xiàn)象，ZIF-8 濃度為0.4 mg/mL 時(shí)溶血率突然增至20%（圖7A），這主要是由于ZIF-8 表面的正電荷吸附紅細(xì)胞導(dǎo)致[27]；V80 濃度增加至0.6 mg/mL 時(shí)突然出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象，溶血率達(dá)到16%，其開始出現(xiàn)溶血的濃度高于ZIF-8，這可能是因?yàn)閂80 表面結(jié)合的Van 減緩了V80 與紅細(xì)胞之間的相互接觸作用（圖7B）。

圖7 不同濃度的ZIF-8 （A）和V80 （B）的溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Hemolysis test results of ZIF-8 (A) and V80 (B) at different concentration levels

3 結(jié)論

通過簡單的一步法制備了能負(fù)載Van 的MOF 納米材料，實(shí)現(xiàn)了抗生素的有效負(fù)載，載藥量達(dá)到18.20%，并且具有酸性響應(yīng)降解性質(zhì)，可在生物膜微酸性環(huán)境中釋放Van，實(shí)現(xiàn)藥物的高效遞送。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此材料對于常見醫(yī)用高分子材料表面形成的生物膜具有良好的清除效果，能夠?qū)P、PE、TPU和PDMS 表面生物膜的細(xì)菌數(shù)量顯著降低。本研究對于解決高分子材料的醫(yī)療器械相關(guān)生物膜感染具有一定的參考價(jià)值，為后續(xù)構(gòu)建及分析對抗醫(yī)療器械感染，特別是植介入醫(yī)療器械生物膜感染的研究工作提供了新的思路。