藏藥三果湯治療糖尿病作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)分析

郭爽,劉海鵬,申雋于,李蓉,夏宗霄,龍小妹,范源,

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,云南 昆明 650500;2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,云南 昆明 650216;3.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京 210023)

糖尿病(diabetic mellitus,DM)是一種以高血糖為特征的代謝性疾病,高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損,或兩者兼有引起的。糖尿病臨床常見(jiàn)類型為1型糖尿病和2型糖尿病,1型糖尿病是由于胰島β細(xì)胞損傷導(dǎo)致胰島素缺乏所致;2型糖尿病是胰島素抵抗拌胰島素缺乏所致[1]。長(zhǎng)期高血糖會(huì)導(dǎo)致其他組織,包括眼、腎、心臟、血管的慢性損害、功能障礙等。流行病學(xué)顯示,印度和中國(guó)的糖尿病患病率占全球糖尿病患病的40%。目前糖尿病的治療主要以胰島素注射[2]和二甲雙胍等藥物為主[3],但胰島素在印度部分地區(qū)無(wú)法獲得,在治療過(guò)程中經(jīng)濟(jì)問(wèn)題成為影響治療的主要原因之一[4]。

在傳統(tǒng)藏醫(yī)學(xué)中,糖尿病被認(rèn)為是“京尼薩庫(kù)”病范疇,藏醫(yī)理論認(rèn)為“京尼薩庫(kù)”主要是由于飲食起居不當(dāng)?shù)纫蛩貙?dǎo)致“三因”失衡引起,所謂“三因”指的是隆、赤巴、培根,即中醫(yī)中的氣、膽、痰。藏藥三果湯,由訶子、毛訶子、余甘子三味藥構(gòu)成,其方名由印度“三果”經(jīng)古絲路傳播演變而成[5],具有清熱、調(diào)和氣血以及分離精濁等功效[6]。在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明,三果湯能降低空腹血糖水平[7],并能抑制α葡萄糖苷酶和α淀粉酶活性[8]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三果湯通過(guò)增強(qiáng)incretin/cAMP信號(hào)通路活性,影響胰島β細(xì)胞增殖和凋亡[9]。在糖尿病并發(fā)癥的治療中,三果湯通過(guò)抑制TGF-β1和氧化應(yīng)激,改善糖尿病腎病癥狀[10];改善TGF-β1、TNF-α、IL-1β,降低糖尿病神經(jīng)病變進(jìn)展。相關(guān)研究表明,癌癥通路為三果湯主要通路之一,Ali Sahragard團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn),三果湯提取物可抑制人肝癌細(xì)胞增殖,降低其存活率[11]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論,對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析,選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的一門學(xué)科。強(qiáng)調(diào)對(duì)信號(hào)通路的多途徑調(diào)節(jié),是提高藥物的治療效果,降低毒副作用,提高新藥臨床試驗(yàn)成功率的有力手段。最早由我國(guó)學(xué)者李梢提出“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”,并制定首個(gè)標(biāo)準(zhǔn)《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》,為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一新興學(xué)科奠定了基礎(chǔ)[12-13]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠通過(guò)對(duì)中藥復(fù)方作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路的分析,預(yù)測(cè)潛在的藥理作用及信號(hào)通路,對(duì)中藥復(fù)方的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供了新思路[14]。本研究就藏藥三果湯治療糖尿病作用機(jī)制進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及分子對(duì)接驗(yàn)證進(jìn)行初步探討,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供思路。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1 三果湯的活性成分及作用靶點(diǎn)采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php),分別檢索三果湯中訶子、余甘子、毛訶子有效成分,并根據(jù)藥物口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18進(jìn)行初步篩選,由于TCMSP中檢索毛訶子結(jié)果為無(wú),則結(jié)合前期研究及文獻(xiàn),以及在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(http:pubchem.gov)檢索結(jié)果整合毛訶子中化合物。使用UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)(http:www.uniprot.org uniprot )將化合物靶點(diǎn)蛋白名稱轉(zhuǎn)換為基因名,刪去重復(fù)項(xiàng),即得三果湯潛在作用靶點(diǎn)。

1.1.2 糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)篩選以Diabetic為關(guān)鍵詞在Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)進(jìn)行檢索,結(jié)合文獻(xiàn)查閱結(jié)果,進(jìn)行結(jié)果整合,刪除重復(fù)項(xiàng),使用UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org uniprot )將靶點(diǎn)名轉(zhuǎn)換為基因名。

1.1.3 構(gòu)建藥物靶點(diǎn)疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)及富集分析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)是指蛋白通過(guò)彼此之間的相互作用構(gòu)成,來(lái)參與生物信息傳遞、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、能量和物質(zhì)代謝及細(xì)胞周期調(diào)控等生命過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié),系統(tǒng)地分析了蛋白在生物系統(tǒng)中的相互作用關(guān)系。

使用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)在線制作疾病靶點(diǎn)、藥物靶點(diǎn)的VENN圖,導(dǎo)出三果湯和糖尿病的共同靶點(diǎn)。使用STRING(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫(kù),將物種選為Homo Sapiens,設(shè)置靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)置信度為0.900,隱藏?zé)o蛋白相互作用靶點(diǎn),獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。使用Cytoscape v3.9.1構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

采用Matescape數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析,物種選擇“H specises”,選擇“Custom Analysis”,分別進(jìn)行KEGG通路分析和GO富集分析。 其中,GO富集分析包括細(xì)胞組分(CC)分析、分子功能(MF)分析和生物過(guò)程(BP)分析,通過(guò)富集分析可以看到目標(biāo)基因在3個(gè)層面上的關(guān)聯(lián)。篩選4次分析的數(shù)據(jù)前20個(gè)通路,繪制出富集條形圖和氣泡圖。

1.2 分子對(duì)接使用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org)下載蛋白靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的晶體結(jié)構(gòu),在TCMSP中下載藥物有效成分的3D結(jié)構(gòu)的mol.2格式。使用AUTODock Tools去加氫,計(jì)算電荷等,為分子對(duì)接提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。使用AUTODock 進(jìn)行分子對(duì)接,對(duì)接的結(jié)果通過(guò)Openbabel(Ver3.1.1)將其轉(zhuǎn)換為pdb格式,用pymol2.6.0進(jìn)行圖像處理。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 三果湯中活性成分篩選通過(guò)TCMSP篩選及文獻(xiàn)檢索補(bǔ)充,可得三果湯中有效活性成分共48種,主要為萜類、黃酮類、多元酚類成分,活性靶點(diǎn)以沒(méi)食子酸、訶子酸、訶子次酸、鞣花酸、槲皮素等為主(見(jiàn)表1)。

2.2 藥物靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)韋恩(VENN)分析根據(jù)TCMSP、Genecard、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)篩選出三果湯有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)和糖尿病作用靶點(diǎn),可知,三果湯成分有效靶點(diǎn)共283個(gè),糖尿病疾病靶點(diǎn)共16 660個(gè),經(jīng)篩選得出具有作用靶點(diǎn)的有效化學(xué)成分35個(gè)。使用微生信網(wǎng)站繪制VEEN圖(見(jiàn)圖1),由圖可知,三果湯與糖尿病作用靶點(diǎn)有269個(gè)共同靶點(diǎn)。根據(jù)VENN分析結(jié)果,由于有效成分名稱復(fù)雜,故作圖時(shí),給予標(biāo)號(hào)S1～S35命名,并使用Cytoscape 3.9.1繪制藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(見(jiàn)圖2),節(jié)點(diǎn)度高的主要化學(xué)成分包括quercetin、ellagic acid、(-)-epigallocatechin-3-gallate等。

圖1 三果湯藥物作用靶點(diǎn)與糖尿病疾病靶點(diǎn)的VENN圖

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(橘色為疾病與藥物,藍(lán)色為藥物主要化學(xué)成分,綠色為藥物與疾病作用靶點(diǎn))

2.3 三果湯治療糖尿病蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)三果湯治療糖尿病蛋白之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建,隱藏?zé)o蛋白相互作用靶點(diǎn)后,PPI網(wǎng)絡(luò)中包含節(jié)點(diǎn)274個(gè),節(jié)點(diǎn)之間包括1 238個(gè)蛋白作用關(guān)系以及464個(gè)預(yù)期作用關(guān)系。其中,AKT1、HAS2、MAP2K、CDH1、PRKCG、PLAT等靶點(diǎn)作用最為突出,預(yù)測(cè)可能作用靶點(diǎn)為:PSMA4、RFC2、PSMC4、TNFRSF1A、KEAP1。

A.GO-細(xì)胞組分分析;B.GO-生物過(guò)程分析;C.GO-分子功分析

2.4 三果湯治療糖尿病GO功能富集使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)進(jìn)行GO功能富集(見(jiàn)圖3),根據(jù)分析出的富集通路,選擇富集的前20個(gè)繪制富集柱狀圖,由藍(lán)色到紅色-log10依次遞減。GO功能富集分析從3個(gè)層面進(jìn)行分析:細(xì)胞組分(CC)分析、分子功能(MF)分析和生物過(guò)程(BP)分析。從圖中可知,從細(xì)胞組學(xué)層面分析,主要富集在膜筏、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、膜側(cè)等;從分子功能層面分析,主要富集在蛋白質(zhì)同二聚化活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、激酶結(jié)合等;從生物過(guò)程層面分析,主要富集在對(duì)激素的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)等。

2.5 三果湯治療糖尿病KEGG通路富集分析使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)進(jìn)行KEGG通路富集分析(見(jiàn)圖4),根據(jù)KEGG通路分析,三果湯治療糖尿病的信號(hào)通路主要在癌癥通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、MAPK信號(hào)通路、化學(xué)致癌-受體激活以及在糖尿病并發(fā)癥中的產(chǎn)生作用的AGE-RAGE信號(hào)通路。

圖4 三果湯治療糖尿病KEGG通路分析氣泡圖

2.6 分子對(duì)接結(jié)果根據(jù)三果湯有效成分篩選,選擇鞣花酸(ellagic acid)、沒(méi)食子酸(gallic acid)與KEGG通路分析通路靶點(diǎn)AKT1、HAS2、MAP2進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)合能越小,有效成分和靶點(diǎn)結(jié)合的親和力越大(見(jiàn)表2)。通過(guò)結(jié)合能可以看出,鞣花酸對(duì)靶點(diǎn)HAS2親和力最好,同時(shí)沒(méi)食子酸對(duì)HAS2的結(jié)合能存在一定的親和力。對(duì)于靶點(diǎn)AKT1、HAS2、MAP2,鞣花酸的親和力明顯大于沒(méi)食子酸。

表2 分子對(duì)接評(píng)分結(jié)果

3 討論

通過(guò)TCMSP等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)藏藥三果湯進(jìn)行有效成分分析及篩選,并對(duì)糖尿病疾病靶點(diǎn)進(jìn)行分析,三果湯與糖尿病的交集蛋白靶點(diǎn)有269個(gè),其中AKT1、HAS2、MAP2、CDH1、PRKCG、PLAT等靶點(diǎn)作用最為突出,并預(yù)測(cè)PSMA4、RFC2、PSMC4、TNFRSF1A、KEAP1存在可能為作用的新靶點(diǎn)。對(duì)三果湯的研究中,作用成分最為突出的鞣花酸和沒(méi)食子酸與作用靶點(diǎn)最為突出的AKT1、HAS2、MAP2進(jìn)行分子對(duì)接,鞣花酸對(duì)HAS2的結(jié)合能為-5.45,存在較好的親和力,且從對(duì)接圖中也可看出構(gòu)象較穩(wěn)定,說(shuō)明鞣花酸對(duì)糖尿病受體蛋白結(jié)合穩(wěn)定,存在治療作用。結(jié)合分析結(jié)果可推測(cè),三果湯治療糖尿病在AKT/MAPK通路存在可能作用機(jī)制。

流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,2017年我國(guó)老年人20%以上為糖尿病患者,2020年增長(zhǎng)至30%以上[15]。隨著糖尿病患病人群逐漸增加,針對(duì)其病癥的治療方式逐漸增多,如通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及炎癥因子的變化,改善糖尿病的胰島素抵抗,從而降低糖尿病的發(fā)生發(fā)展[16]。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中,中藥對(duì)糖尿病及糖尿病并發(fā)癥存在良好的療效,臨床試驗(yàn)表明,中醫(yī)藥在輔佐糖尿病冠心病的治療中,存在良好的輔助作用,并存在一定的安全性[17];白藜蘆醇[18]、楊梅素[19]等化合物可誘導(dǎo)機(jī)體抗氧化應(yīng)答,在糖尿病并發(fā)癥心肌病病程發(fā)展過(guò)程中起到保護(hù)作用,且存在安全性[20];化瘀及通絡(luò)中藥在TGF-β1/p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮到作用,可改善糖尿病腎病氧化應(yīng)激,起到保護(hù)作用[21-22]。有關(guān)藏藥的資料記載,三果湯在糖尿病的治療中有良好的效果,具有降低空腹血糖,影響胰島β細(xì)胞凋亡等[23]。藏藥三果湯中主要成分之一余甘子中主要成分沒(méi)食子酸可能升高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶載體(GLUT-2)和PPARγ的表達(dá),發(fā)揮降血糖的藥理作用[23]。訶子中有效成分訶黎勒酸能夠降低大鼠進(jìn)食后的血糖水平[24]。本文對(duì)藏藥三果湯治療糖尿病作用機(jī)制初步探討,以為相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供參考依據(jù)。

綜上所述,三果湯具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn),對(duì)糖尿病有明顯的治療效果,本研究為后續(xù)三果湯治療糖尿病的相關(guān)機(jī)制研究提供新思路。在本研究分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn),三果湯對(duì)癌癥治療存在可能性,為后續(xù)癌癥治療研究提供參考。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果基于數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)進(jìn)行分析,但由于三果湯治療糖尿病作用機(jī)制復(fù)雜,具體機(jī)制需進(jìn)一步相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。