基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)探討白花蛇舌草總黃酮抗肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制

羅悅,雒洪偉,姜星,王超,吳迎秋,張璐

(1.綿竹市人民醫(yī)院,四川 綿竹 618200;2.重慶中醫(yī)藥學(xué)院,重慶 402760)

肺癌是臨床上一種常見(jiàn)的呼吸道惡性腫瘤,具有較高的死亡率和高復(fù)發(fā)率。流行病學(xué)調(diào)查顯示,每年約有209萬(wàn)例肺癌新發(fā)病例,有176.1萬(wàn)人因此死亡,是全球最常見(jiàn)的癌癥死亡原因[1]。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)取得了一些治療肺癌的進(jìn)展,但是很多患者在手術(shù)、化療、放療等治療方式后仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,因此需要尋求其他治療的可能性。中醫(yī)藥作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的一種治療方式,在肺癌治療中的療效引起了越來(lái)越多人的關(guān)注。基于中醫(yī)藥理論,中醫(yī)藥“扶正祛邪”“化瘀止痛”的治療原則是其治療肺癌的理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,中醫(yī)藥主要通過(guò)調(diào)節(jié)人體的能量與物質(zhì)平衡,達(dá)到激發(fā)人體自身治愈能力,抑制腫瘤生長(zhǎng),強(qiáng)化免疫力等方式發(fā)揮治療肺癌的作用[2]。此外,研究表明,某些中草藥和中藥復(fù)方也可以在化療的同時(shí)減輕患者的不良反應(yīng)和副作用,改善患者的預(yù)后[3]。

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物,是一種傳統(tǒng)的中藥材,其干燥全草入藥,具有清熱解毒、消痛散結(jié)、利尿除濕的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,白花蛇舌草具有抗菌、抗炎、抗衰老、抗癌等作用[4]。在抗腫瘤方面,白花蛇舌草對(duì)肺癌、結(jié)腸癌、腎癌等多種腫瘤疾病具有抑制作用[5-7]。研究發(fā)現(xiàn),黃酮類成分作為白花蛇舌草的活性成分對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用[4-5]。然而,白花蛇舌草黃酮成分對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及機(jī)制鮮有報(bào)道。因此,為了探究白花蛇舌草黃酮類成分對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及機(jī)制,本研究對(duì)白花蛇舌草總黃酮進(jìn)行制備,采用體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估其對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,并利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)探究白花蛇舌草總黃酮抗肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)可能涉及的關(guān)鍵基因和分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料試劑:白花蛇舌草購(gòu)自四川省中藥飲片有限責(zé)任公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%)購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司;95%乙醇、三氯化鋁、D101大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司;人肺癌細(xì)胞株(A549細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;雙抗(青霉素、鏈霉素)、RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自新賽美生物科技有限公司。

儀器:UV-5200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自上海元析儀器有限公司;75002420型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾儀器有限公司。DS-Fi3型倒置顯微鏡購(gòu)自尼康(Nikon)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)將人肺癌細(xì)胞株A549接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,加入RPMI 1640培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素),置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每2～3 d進(jìn)行換液或傳代處理。

1.3 白花蛇舌草總黃酮的制備和檢測(cè)白花蛇舌草總提取物的制備:參考文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法,并進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn)。將干燥的白花蛇舌草粉碎,過(guò)篩(4號(hào)篩);使用蒸餾水按照藥材質(zhì)量(g)∶蒸餾水體積(mL)=1∶25進(jìn)行回流提取,提取時(shí)間為2 h,重復(fù)提取3次,合并提取液,將提取液濃縮至浸膏。

白花蛇舌草總黃酮的制備:參考文獻(xiàn)[9],采用大孔吸附樹(shù)脂純化總黃酮。將總提取物浸膏以適量蒸餾水混懸,加入石油醚進(jìn)行萃取,棄上層石油醚部分;采用D101大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行純化,依次用蒸餾水、20%乙醇溶液、40%乙醇溶液、70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇溶液進(jìn)行洗脫,收集70%～90%乙醇溶液的洗脫部分,濃縮、冷凍干燥得到白花蛇舌草總黃酮。

白花蛇舌草總黃酮的純度測(cè)定:參照《中國(guó)藥典》2020年版[10],采用三氯化鋁比色法測(cè)定白花蛇舌草總黃酮提取物的純度。首先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:精密稱取0.010 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,使用95%乙醇溶液配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液;分別吸取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mL的標(biāo)準(zhǔn)液于容量瓶中,加入4 mL 1%的三氯化鋁溶液,加入95%乙醇溶液定容至10 mL,精置15 min后,于400 nm波長(zhǎng)條件測(cè)定吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后檢測(cè)總黃酮的含量:精密稱量白花蛇舌草總黃酮提取物10 mg,用95%乙醇溶液配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的供試品溶液,取3 mL用于顯色反應(yīng),方法同標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

1.4 白花蛇舌草總提取物和總黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞活力的影響將細(xì)胞以每孔約2 000個(gè)接種于96孔板中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后進(jìn)行給藥干預(yù),分別使用正常培養(yǎng)基、不同濃度的白花蛇舌草總提取物以和總黃酮提取物(50、100、200 mg·L-1)干預(yù)肺癌細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后,采用CCK8試劑盒檢測(cè)白花蛇舌草總提取物和總黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞活力的影響。比較白花蛇舌草總提取物和總黃酮的抗肺癌細(xì)胞增殖能力。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇抗肺癌細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)的總黃酮濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥劑量。

1.5 白花蛇舌草總黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響選取上述實(shí)驗(yàn)確定的總黃酮最佳劑量干預(yù)肺癌細(xì)胞,進(jìn)一步評(píng)估白花蛇舌草總黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,為后續(xù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究提供依據(jù)。

采用CCK8法檢測(cè)白花蛇舌草總黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞增殖活力的影響。將單細(xì)胞以每孔約1 000個(gè)接種于96孔板中,將細(xì)胞分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞培養(yǎng)12 h后,根據(jù)分組要求進(jìn)行給藥干預(yù),分別使用正常培養(yǎng)基和總黃酮最佳劑量干預(yù)肺癌細(xì)胞。分別培養(yǎng)24、48、72 h,采用CCK8試劑盒檢測(cè)增殖活力,并繪制生長(zhǎng)曲線。

采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)白花蛇舌草總黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞遷移能力的影響。將單細(xì)胞懸液接種至6孔板中,培養(yǎng)至70%～80%的密度。使用200 μL的移液器頭在細(xì)胞單層中劃痕,用PBS洗去碎片。細(xì)胞在無(wú)血清的正常培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基中孵育24 h,于顯微鏡下觀察劃痕傷口的愈合情況。

采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)白花蛇舌草總黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。首先將單細(xì)胞懸液接種到涂有Matrigel的Transwell插入器的上室中,下室填充10%含F(xiàn)BS的正常培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,使用4%多聚甲醛固定下室中的細(xì)胞。用0.1%甲基紫染色,然后在顯微鏡下計(jì)算入侵細(xì)胞數(shù)量。

1.6 基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)探究白花蛇舌草總黃酮的抗肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制

1.6.1 cDNA文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序?qū)⑸鲜隹瞻讓?duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的肺癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。方法如下:收集每組各4個(gè)平行樣本,參照試劑盒說(shuō)明書(shū),使用TRlzol試劑提取各組細(xì)胞樣本的總RNA,并檢測(cè)RNA質(zhì)量;構(gòu)建cDNA文庫(kù),并將索引代碼添加到每個(gè)樣品的屬性序列中,在Illumina平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。DNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.6.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析首先,對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,以“l(fā)og2|(差異倍數(shù))|≥1,P值<0.05”為篩選條件篩選差異表達(dá)基因。然后,使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論(gene ontology,GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,并使用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)方法識(shí)別白花蛇舌草總黃酮提取物干預(yù)肺癌細(xì)胞后,顯著上調(diào)和下調(diào)的信號(hào)通路。

最后,基于String數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析,并利用Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行可視化分析。使用Cytoscape軟件中的MCODE插件,基于MCODE算法,從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出相互作用最密切的基因模塊;并基于最大相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)(maximal clique centrality,MCC)算法,使用CytoHubba插件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的得分排名前十的基因。合并兩種算法的結(jié)果,篩選共同基因,作為白花蛇舌草總黃酮的抗肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 白合蛇舌草總黃酮的制備及純度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2.713X+0.013 8(X為黃酮質(zhì)量,Y為吸光度),R2=0.999。白花蛇舌草總黃酮提取物的吸光度為0.262 3±0.031 0(n=6)。帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)制備的白花蛇舌草總黃酮的黃酮含量為30.5361%±3.8097%。

2.2 白花蛇舌草總提取物和總黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞活力的影響結(jié)果(見(jiàn)圖1)顯示,低、中、高劑量(50、100、200 mg·L-1)的白花蛇舌草總提取物和總黃酮提取物均能顯著抑制抑制肺癌細(xì)胞增殖活性(P<0.05);其抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴型關(guān)系,給藥劑量越大,對(duì)肺癌細(xì)胞活力的抑制作用越強(qiáng)。在相同給藥劑量下,白花蛇舌草總黃酮的抗肺癌細(xì)胞作用顯著優(yōu)于白花蛇舌草總提取物(P<0.05);隨著給藥劑量的增大,白花蛇舌草總黃酮與總提取物相比,其抗肺癌細(xì)胞作用更加顯著(P<0.05)。因此,本研究選擇抗肺癌細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)的總黃酮?jiǎng)┝?200 mg·L-1)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 白花蛇舌草總提取物和總黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞活力的影響 注:各給藥組與空白對(duì)照組比較,*P<0.05(n=6);不同劑量下的總黃酮給藥組與相同劑量下總提取物給藥組比較,#P<0.05(n=6)。

2.3 白花蛇舌草總黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響為了進(jìn)一步明確白花蛇舌草總黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,并為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),我們選擇200 mg·L-1劑量的白花蛇舌草總黃酮干預(yù)肺癌細(xì)胞,分別采用CCK8法、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)白花蛇舌草總黃酮對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖2A)顯示,在24、48和72 h時(shí)間點(diǎn)下,與空白對(duì)照組相比,白花蛇舌草總黃酮干預(yù)下的細(xì)胞活力和細(xì)胞生長(zhǎng)速率顯著降低(P<0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖2B)顯示,空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的A549細(xì)胞在24 h的傷口愈合率分別74.82%±5.53%和44.49%±3.43%,白花蛇舌草總黃酮能顯著降低肺癌細(xì)胞的遷移能力(P<0.05)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖2C)顯示,與空白對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組中A549細(xì)胞的侵襲能力顯著降低(P<0.05)。這些結(jié)果表明,白花蛇舌草總黃酮能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

A．CCK8法檢測(cè)肺癌細(xì)胞增殖活性;B．劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺癌細(xì)胞遷移能力;C．Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺癌細(xì)胞侵襲能力;與空白對(duì)照組比較,*P<0.05(n=6)

2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析

2.4.1 差異表達(dá)基因篩選為了評(píng)估樣本組間差異及組內(nèi)重復(fù)情況,本研究首先對(duì)各個(gè)樣本的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了主成分分析(PCA)。PCA結(jié)果顯示,空白對(duì)照組中各樣本與實(shí)驗(yàn)組中各樣本比較相對(duì)分散,表明組間獨(dú)立性和組內(nèi)重復(fù)性較好(見(jiàn)圖3)。

圖3 空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的主成分分析

對(duì)空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,結(jié)果顯示,共篩選得到1 134個(gè)差異表達(dá)基因,其中822個(gè)基因在白花蛇舌草總黃酮干預(yù)的肺癌細(xì)胞中顯著上調(diào),312個(gè)基因在白花蛇舌草總黃酮干預(yù)下顯著下調(diào)(見(jiàn)圖4)。

圖4 空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的差異分析火山圖

2.4.2 功能富集分析GO分析結(jié)果顯示,這些差異基因涉及生物過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞成分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)3大類,包括RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞分化等263條生物過(guò)程,細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞溶質(zhì)、膜等85條細(xì)胞成分,相同蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、鈣離子結(jié)合、鋅離子結(jié)合等59中分子功能(見(jiàn)圖5)。

圖5 差異基因的GO功能富集分析

KEGG功能富集分析結(jié)果顯示,這些差異基因主要富集于癌癥途徑、細(xì)胞周期、Wnt信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等26條信號(hào)途徑(見(jiàn)圖6)。

圖6 差異基因的KEGG功能富集分析

使用GSEA方法進(jìn)一步探究白花蛇舌草總黃酮抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)所涉及的關(guān)鍵信號(hào)通路及其表達(dá)變化。結(jié)果顯示,白花蛇舌草總黃酮能顯著激活肺癌細(xì)胞中p53信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、苯丙氨酸代謝、胞質(zhì)DNA傳感途徑的表達(dá),并能顯著抑制MAPK信號(hào)通路、黏著斑激酶、細(xì)胞周期、酪氨酸代謝、WNT信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路等信號(hào)通路的表達(dá)(見(jiàn)圖7)。

圖7 空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的基因集富集分析(GSEA) 注:ES>0表示信號(hào)通路表示在實(shí)驗(yàn)組中下調(diào);ES<0表示信號(hào)通路表示在實(shí)驗(yàn)組中上調(diào);NP<0.05,富集結(jié)果具有顯著性。

2.4.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因的篩選差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析見(jiàn)圖8,結(jié)果表明,各基因之間的連通性較好?；贛CODE算法,通過(guò)計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù),從PPI網(wǎng)絡(luò)中鑒定出相互作用最密切的模塊基因共48個(gè);基于MCC算法,從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選出MCC分?jǐn)?shù)最大的前10個(gè)基因。合并兩個(gè)結(jié)果,共得到與白花蛇舌草總黃酮抗肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)的10個(gè)關(guān)鍵基因,包括TTK、NUSAP1、CDCA8、KIF2C、MELK、CCNB2、CCNB1、KIF20A、BUB1、CEP55。這些關(guān)鍵基因在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)與空白對(duì)照組相比,均顯著下調(diào)(P<0.05)(見(jiàn)圖9)。

圖8 基于MCODE算法和MCC算法從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選關(guān)鍵基因 注:網(wǎng)絡(luò)中紅色節(jié)點(diǎn)表示10個(gè)關(guān)鍵基因。

圖9 關(guān)鍵基因在空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)

3 討論與總結(jié)

肺癌是臨床上最常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)腫瘤疾病之一,具有高發(fā)病率和死亡率,是癌癥死亡的主要原因(占癌癥死亡總數(shù)的18.4%)[11]。肺癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,與吸煙、空氣污染等多種外在因素和基因突變、遺傳等多種內(nèi)在因素有關(guān)。目前,臨床上治療肺癌主要以西醫(yī)治療為主,包括手術(shù)治療、放療、化療、靶向治療、免疫治療法等。然而,傳統(tǒng)的西醫(yī)治療往往預(yù)后不理想,易復(fù)發(fā)且具有明顯的毒副作用。而中醫(yī)藥治療肺癌能明顯改善患者預(yù)后,且毒副作用小。但是中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)也限制了其抗癌機(jī)制的研究。近年來(lái),隨著高通量組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等組學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于中藥活性成分和藥理機(jī)制研究,為中藥的現(xiàn)代藥理學(xué)研究提供了新的思路。

白花蛇舌草為我國(guó)一種常用的傳統(tǒng)中藥,具有清熱解毒、活血消腫、利濕退黃的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,其具有抗菌消炎、消除自由基、改善疲勞、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤等多種藥理作用[4]。在抗腫瘤方面,能直接靶向腫瘤細(xì)胞,抑制肺癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[12-14]。此外,還可通過(guò)增強(qiáng)免疫反應(yīng)、抑制血管形成等方式間接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[15-17]。臨床研究表明,白花蛇舌草能夠顯著改善肺癌患者的預(yù)后和生存質(zhì)量[18-19]。李佳林[20]研究發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草總黃酮可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期等方式影響肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究也發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草總黃酮提取物能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,這表明黃酮類成分可能是白花蛇舌草抗肺癌作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。然而,白花蛇舌草總黃酮成分抗肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制鮮有報(bào)道。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù),檢測(cè)了肺癌細(xì)胞在白花蛇舌草總黃酮提取物干預(yù)前后的基因表達(dá)模式。通過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的分析,共篩選得到了可能與白花蛇舌草總黃酮成分抗肺癌作用相關(guān)的1 134個(gè)差異基因。這些差異基因涉及到p53信號(hào)通路、細(xì)胞周期、苯丙氨酸代謝、細(xì)胞凋亡、WNT信號(hào)通路和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路等。此外,我們通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因間的相互作用進(jìn)行分析,從中篩選到了10個(gè)起著樞紐調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵基因,包括TTK、NUSAP1、CDCA8、KIF2C、MELK、CCNB2、CCNB1、KIF20A、BUB1、CEP55。

MAPK信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路作為原癌機(jī)制能誘導(dǎo)和促進(jìn)腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展,抑制這些信號(hào)通路的激活均能抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[21-23]。p53信號(hào)通路是以腫瘤抑制因子p53為核心的抑癌信號(hào)通路,激活p53信號(hào)通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞衰老、DNA修復(fù)、代謝、自噬和鐵死亡等細(xì)胞功能,進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[24-25]。在本研究中,我們首次發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草總黃酮提取物抗肺癌的作用可能與調(diào)控這些癌癥相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)。此外,本研究篩選了10個(gè)與白花蛇舌草總黃酮抗肺癌作用相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中,TTK[26]、NUSAP1[27]、KIF2C[28]、MELK[29]、CCNB2[30]、CCNB1[31]、BUB1[32]、CEP55[33]這9個(gè)關(guān)鍵基因已被證實(shí)在肺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá),并能促進(jìn)肺癌的發(fā)生和發(fā)展。而CDCA8作為一種原癌基因,已被發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)甲狀腺癌、卵巢癌、食管癌等腫瘤疾病的惡性進(jìn)展[34-36]。丁華杰等[37]研究發(fā)現(xiàn),CDCA8在肺腺癌組織中表達(dá)顯著上調(diào),其高表達(dá)與肺腺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。但是,尚且沒(méi)有研究報(bào)道CDCA8是否對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有調(diào)控作用。

綜上所述,本研究制備了白花蛇舌草總黃酮,發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,進(jìn)一步明確了白花蛇舌草總黃酮成分抗肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制可能涉及MAPK信號(hào)通路、WNT信號(hào)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等癌癥相關(guān)信號(hào)通路,并且可能直接作用于TTK、NUSAP1、CDCA8、KIF2C、MELK、CCNB2、CCNB1、KIF20A、BUB1、CEP55等癌基因。