用于動態(tài)調(diào)控的響應(yīng)啟動子在合成生物學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展

馬 定,高思遠(yuǎn),王 昕,陳可泉,2

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 211800;2.南京工業(yè)大學(xué) 國家生化工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 211800)

在綠色、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的理念下,綠色制造是實(shí)現(xiàn)這一理念的重要手段,也是目前世界各國重要的戰(zhàn)略發(fā)展方向[1]。合成生物學(xué)的目標(biāo)是構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠,通過定向修改和重構(gòu)細(xì)胞代謝途徑,賦予微生物新的表型,使之具備目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)性能[2]。通過代謝工程手段,對底盤細(xì)胞進(jìn)行改造,如敲除副產(chǎn)物途徑或競爭途徑、過表達(dá)代謝途徑的關(guān)鍵基因等,從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物收率最大化、碳源和能量消耗最優(yōu)化[3]。但是,這些策略不僅會導(dǎo)致碳源的浪費(fèi)、能量的損失、氧化還原的失衡以及毒性代謝物的積累等問題,而且還會引起的細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的失衡,從而影響細(xì)胞的生長,最終限制產(chǎn)品的產(chǎn)量[3-4]。

利用傳感器(sensor)/調(diào)節(jié)器(regulator)構(gòu)建的基因回路則是一個有效的解決辦法[5]。類似于微生物的自然調(diào)節(jié)方式,細(xì)胞通過感知環(huán)境信號和細(xì)胞內(nèi)信號,實(shí)時調(diào)節(jié)代謝通路,合理分布碳流向和能量[3,6]。動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)是動態(tài)代謝調(diào)控的重要組成部分,對它進(jìn)行合理選擇與設(shè)計是有效動態(tài)調(diào)控代謝途徑的關(guān)鍵,其中,響應(yīng)啟動子是動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)中的重要組成部分,是響應(yīng)信號和基因表達(dá)的重要樞紐。因此,本文就響應(yīng)啟動子的發(fā)現(xiàn)、設(shè)計與改造以及應(yīng)用進(jìn)行綜述,并對其未來的發(fā)展做出展望。

1 動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)及響應(yīng)啟動子概述

1.1 動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)及原理

動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)是微生物面臨環(huán)境變化,自發(fā)調(diào)控體內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò),并由多個響應(yīng)元件逐級調(diào)控、協(xié)調(diào)工作,實(shí)現(xiàn)微生物對環(huán)境變化的響應(yīng)。因此,挖掘動態(tài)調(diào)控的響應(yīng)元件是構(gòu)建動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的基礎(chǔ)[7]。啟動子工程是工業(yè)底盤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控最有效的方法之一[8]。與傳統(tǒng)的組成型啟動子相比,響應(yīng)啟動子可以在合適的時間和空間啟動基因的表達(dá),所以它們在調(diào)控和再分配代謝通量方面發(fā)揮著重要的作用。如,通過響應(yīng)啟動子調(diào)控碳流再分配,實(shí)現(xiàn)生物量積累和產(chǎn)物積累的平衡,加速有毒產(chǎn)物的消耗和外排以提高菌株耐受性和產(chǎn)物產(chǎn)量[9]。目前,常規(guī)的誘導(dǎo)啟動子廣泛應(yīng)用于合成生物學(xué)中,雖然它們可對宿主進(jìn)行代謝調(diào)控,但是存在較多局限性:如,有毒的(IPTG)或者能耗盡(乳糖)的誘導(dǎo)劑并不利于工業(yè)化生產(chǎn)。此外,在培養(yǎng)期間添加誘導(dǎo)物,需要監(jiān)測細(xì)胞生長狀態(tài)并優(yōu)化誘導(dǎo)物添加的時間[10],這會增加工藝路線及生產(chǎn)成本。因此,開發(fā)響應(yīng)啟動子受到研究人員更多的關(guān)注。

20世紀(jì)70年代,研究人員發(fā)現(xiàn),費(fèi)氏弧菌在菌體密度達(dá)到一定閾值時出現(xiàn)生物發(fā)光現(xiàn)象,直到1994年Fuqua等[11]根據(jù)這種現(xiàn)象提出了群體感應(yīng)(QS)的概念,發(fā)現(xiàn)了LuxI/R、EsaI/R等一系列群體感應(yīng)系統(tǒng),其中,自誘導(dǎo)劑高絲氨酸內(nèi)酯(AHL)在QS系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用,因?yàn)殡S著細(xì)菌密度的增加,當(dāng)細(xì)胞外周環(huán)境中由細(xì)菌分泌的AHL積聚到一定濃度閾值時,可與細(xì)胞質(zhì)中的作為受體的LuxR蛋白的氨基殘端結(jié)合,激活誘導(dǎo)啟動子,使調(diào)控的基因得到表達(dá)。2010年,Valdez-Cruz等[12]發(fā)現(xiàn),溫敏啟動子PR/PL受溫敏阻遏蛋白CI857調(diào)控,基于此開發(fā)溫敏啟動子,繼而溫敏啟動子在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等微生物中得到大規(guī)模的應(yīng)用[13]。近年來,響應(yīng)啟動子得到了更廣泛的挖掘。Rohlhill等[14]在分析甲醛解毒操縱子的基礎(chǔ)上,在大腸桿菌中開發(fā)甲醛響應(yīng)啟動子,結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子FrmR特異結(jié)合到響應(yīng)啟動子上會抑制基因表達(dá),但該轉(zhuǎn)錄因子受甲醛變構(gòu)調(diào)節(jié)作用解除抑制,加速甲醛的消耗,使之能在更高濃度的甲醇中生長。Xu等[15]通過雜交啟動子技術(shù)插入PdhR box,雜交啟動子能特異性識別丙酮酸,通過檢測細(xì)胞內(nèi)丙酮酸濃度來優(yōu)化中心代謝的代謝流,從而使枯草芽孢桿菌高效合成葡萄糖二酸。周大袁等[16]根據(jù)可溶性血紅蛋白(VHb)能在低溶氧下攝氧而開發(fā)溶氧響應(yīng)啟動子Pvhb,通過對溶氧響應(yīng)啟動子的串聯(lián),增強(qiáng)誘導(dǎo)強(qiáng)度,使表面活性素(surfactin)表達(dá)強(qiáng)度得到顯著提升。Zhang等[17]通過天然存在的脂肪酸敏感蛋白FadR開發(fā)了脂肪酸響應(yīng)啟動子PFadR,結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子與響應(yīng)啟動子特異性結(jié)合抑制表達(dá),脂肪酸能解除該特異結(jié)合;將轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)雜交到強(qiáng)啟動子T7上提高動態(tài)響應(yīng)范圍,加速中間代謝產(chǎn)物脂肪酸消耗,提高終產(chǎn)物脂肪酸乙脂的產(chǎn)量。

1.2 響應(yīng)啟動子的結(jié)構(gòu)及調(diào)控機(jī)制

啟動子是一段位于目標(biāo)基因上游的核苷酸序列,具有能夠被RNA聚合酶特異性識別并實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的特性[18]。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)供給平衡的重要方法之一[19],啟動子是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心元件[20-21]。一般原核生物的啟動子主要由上游序列、-35區(qū)、間隔序列、-10區(qū)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)等部分組成。-35區(qū)和-10區(qū)的序列和距離相對保守,對RNA聚合酶的結(jié)合與轉(zhuǎn)錄有很大的影響[22]。真核生物的啟動子則較為復(fù)雜,而且不被RNA聚合酶直接識別,需要某些反式作用因子識別及其相互作用才能識別。真核生物的啟動子可分為三類,分別由RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ轉(zhuǎn)錄起始。RNA聚合酶Ⅰ啟動子(Ⅰ類)主要由-45至+20的核心啟動子和-187至-107的上游調(diào)控元件構(gòu)成。RNA聚合酶Ⅱ啟動子(Ⅱ類)是研究最多的類型,由基本啟動子、上游元件、起始子及應(yīng)答元件構(gòu)成。RNA聚合酶Ⅲ啟動子組成較復(fù)雜,可分為3個亞類,即I型基因內(nèi)啟動子、Ⅱ型基因內(nèi)啟動子和基因外啟動子(Ⅲ型)。

在啟動子的結(jié)構(gòu)中存在著轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)一般都與響應(yīng)信號有關(guān),實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)基因表達(dá)調(diào)控。基因的表達(dá)調(diào)控一般由正反饋或者負(fù)反饋調(diào)控完成。負(fù)反饋調(diào)節(jié)是由阻遏蛋白或抑制因子結(jié)合到啟動子的操縱區(qū)上,從而抑制目標(biāo)基因的正常表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞中存在響應(yīng)信號時,響應(yīng)信號與阻遏蛋白結(jié)合,改變阻遏蛋白構(gòu)型,使之不能與啟動子序列結(jié)合,目標(biāo)基因得以正常表達(dá)(圖1)。正反饋調(diào)節(jié)則是在響應(yīng)信號存在的情況下,激活蛋白結(jié)合在啟動子上,從而使RNA聚合酶能在啟動子上順利轉(zhuǎn)錄翻譯與表達(dá)(圖2)。目前開發(fā)的大部分響應(yīng)啟動子,都是基于轉(zhuǎn)錄因子來實(shí)現(xiàn)對信號的響應(yīng)到基因表達(dá)的傳導(dǎo)。由于轉(zhuǎn)錄因子與響應(yīng)啟動子特異結(jié)合,阻止了RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄,從而實(shí)現(xiàn)對目的基因表達(dá)的抑制,當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子受到響應(yīng)信號的變構(gòu)調(diào)節(jié)解除抑制,目的基因得以表達(dá)?；陧憫?yīng)啟動子的相關(guān)原理,研究人員開發(fā)出了各種調(diào)控開關(guān),通過響應(yīng)信號對啟動子的激活或者抑制,實(shí)現(xiàn)對目的基因表達(dá)的激活或者抑制,如,對代謝過程關(guān)鍵酶的調(diào)控來增加產(chǎn)量[23]、對抗逆基因的過表達(dá)增加抗逆性等[24]。

圖1 負(fù)反饋調(diào)節(jié)示意

圖2 正反饋調(diào)節(jié)示意

2 響應(yīng)啟動子的類型及特征

目前,根據(jù)啟動子的響應(yīng)信號可分為化學(xué)信號和物理信號兩大類。在化學(xué)信號響應(yīng)啟動子中,目前還是以類似IPTG的外源添加誘導(dǎo)劑為主(圖3),但這種類型的誘導(dǎo)啟動子在目前還存在著一定的缺陷:一方面,誘導(dǎo)劑價格昂貴,不適合工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn);另一方面,誘導(dǎo)劑對宿主菌有一定毒性且添加誘導(dǎo)劑時需要持續(xù)觀測菌株的生長情況等。

響應(yīng)啟動子受外源壓力或添加的誘導(dǎo)劑激活,關(guān)鍵酶過表達(dá),加速底物消耗,增加終產(chǎn)物產(chǎn)量

物理信號響應(yīng)啟動子主要基于細(xì)胞代謝過程的各種環(huán)境因素為響應(yīng)信號而被開發(fā)出來。一般以代謝過程中的環(huán)境溫度、溶氧及滲透壓等因素作為響應(yīng)信號,實(shí)現(xiàn)對代謝過程的動態(tài)調(diào)控。與外源添加的信號相比,宿主自身代謝產(chǎn)生的內(nèi)源信號(多為化學(xué)信號)則有更多優(yōu)勢(圖4),因?yàn)樗拗鲿蛹皶r地處理內(nèi)源信號,且不需要觀測菌株的生長代謝情況再進(jìn)行調(diào)控,可大大減少工作量,提高調(diào)控精確度,更好地為代謝目標(biāo)產(chǎn)物服務(wù),所以目前越來越多的研究人員將研究重點(diǎn)放在內(nèi)源性響應(yīng)啟動子開發(fā)方面。通過對響應(yīng)啟動子的開發(fā)以及后續(xù)的改造等,實(shí)現(xiàn)啟動子對整個代謝途徑的動態(tài)調(diào)控,來解決代謝過程中的相關(guān)問題,如,提高終產(chǎn)物產(chǎn)量、加速有毒中間產(chǎn)物的消耗、檢測胞內(nèi)產(chǎn)物濃度、增加抗逆性等。

中間代謝產(chǎn)物或者終產(chǎn)物積累過多,誘導(dǎo)啟動子被激活,關(guān)鍵酶過表達(dá),加速中間產(chǎn)物消耗或者終產(chǎn)物外排

2.1 化學(xué)信號類型的響應(yīng)啟動子

為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝過程的動態(tài)調(diào)控,減少誘導(dǎo)劑的使用,目前在響應(yīng)啟動子領(lǐng)域的研究取得較多成果。大腸桿菌在生產(chǎn)倍半萜紫穗二烯時,會產(chǎn)生有毒的中間代謝產(chǎn)物法尼焦磷酸(FPP),這會嚴(yán)重影響目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量,Dahl等[25]在FPP脅迫條件下對全基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,篩選出對FPP毒性作出反應(yīng)的啟動子PrstA和PgadE,雖然這兩個啟動子的響應(yīng)機(jī)制還尚不清楚,但使用這兩個啟動子能使目標(biāo)產(chǎn)物倍半萜紫穗二烯的產(chǎn)量比組成型啟動子的提高2倍,同時也減少了副產(chǎn)物的積累(圖5)。這種在不清楚響應(yīng)機(jī)制的情況下,通過轉(zhuǎn)錄組分析得到理想的啟動子的思路受到越來越廣泛的關(guān)注,因?yàn)檫@能夠大大減少各種類型響應(yīng)啟動子開發(fā)的時間。

圖5 PFPP響應(yīng)示意

同時也存在另一種情況,即通過解析細(xì)胞對有毒物質(zhì)的解毒機(jī)制來尋找響應(yīng)啟動子,但是這種方法需建立在對有毒代謝物有一定的研究基礎(chǔ)上。如,Rohlhill等[14]通過對中間代謝產(chǎn)物的甲醛進(jìn)行解毒機(jī)制分析后得到甲醛解毒操縱子frmRAB及甲醛響應(yīng)啟動子Pfrm,再對啟動子進(jìn)行突變并篩選陽性突變株,這極大地提高了啟動子在甲醛誘導(dǎo)下的響應(yīng)強(qiáng)度;同時發(fā)現(xiàn),突變體能在更高濃度的甲醇中生長,能更好地利用甲醇,這種結(jié)合細(xì)胞自身的解毒機(jī)制和自我保護(hù)機(jī)制為響應(yīng)啟動子的開發(fā)提供了新思路,正成為響應(yīng)啟動子開發(fā)的一種重要方法。

除了加速有毒中間代謝產(chǎn)物消耗外,響應(yīng)啟動子還在提高終產(chǎn)物產(chǎn)量方面得到很好的應(yīng)用,更可用于監(jiān)測產(chǎn)物的濃度。Binder等[26]研究堿性氨基酸誘導(dǎo)的啟動子后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子LysG與啟動子Psenlys特異性結(jié)合后,受賴氨酸變構(gòu)調(diào)控,可通過響應(yīng)啟動子Psenlys實(shí)時監(jiān)控胞內(nèi)賴氨酸濃度。最近Zhao等[27]在轉(zhuǎn)錄因子cgmAR中發(fā)現(xiàn)了腐胺、尸胺等二胺的響應(yīng)啟動子PcgmA,因?yàn)閏gmR能與響應(yīng)啟動子特異結(jié)合,抑制基因的表達(dá),但該轉(zhuǎn)錄因子受二胺的變構(gòu)調(diào)節(jié)后,解除與啟動子的結(jié)合;同時他們通過對轉(zhuǎn)錄因子的隨機(jī)突變獲得更加靈敏的傳感器,該傳感器通過響應(yīng)啟動子調(diào)控報告基因GFP,再通過監(jiān)測胞內(nèi)熒光值變化來實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞產(chǎn)二胺的情況(圖6)。

圖6 PcgmA響應(yīng)示意

除了代謝產(chǎn)物作為誘導(dǎo)信號外,影響代謝過程外部環(huán)境中的化學(xué)信號也受到廣泛關(guān)注,Xu等[28]在研究大腸桿菌對酸的耐受性時發(fā)現(xiàn),啟動子PfabA、PfabB能對中性酸(pH 4.0～5.0)作出響應(yīng),通過提高細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸(UFAs)的含量,從而提高細(xì)胞對酸的耐受。該啟動子對酸響應(yīng)主要是通過雙組分系統(tǒng)CpxRA周質(zhì)組氨酸殘基質(zhì)子化來實(shí)現(xiàn)的:在低pH情況下,CpxA周質(zhì)結(jié)構(gòu)的H52和H117的組氨酸殘基質(zhì)子化,使CpxA磷酸化激活CpxR蛋白,該蛋白能直接結(jié)合到響應(yīng)啟動子PfabA和PfabB上,從而增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度,增加不飽和脂肪酸的含量,從而產(chǎn)生對中性酸的耐受性,使對數(shù)生長期的大腸桿菌在該酸性環(huán)境下實(shí)現(xiàn)從生存到生長的轉(zhuǎn)變(圖7)。這種由細(xì)胞分級調(diào)控、最后由啟動子響應(yīng)來調(diào)控目的基因的表達(dá),這種動態(tài)調(diào)控方式將會受到越來越多的關(guān)注。

圖7 PfabA、PfabB響應(yīng)示意

2.2 物理信號類型的響應(yīng)啟動子

除了上述的化學(xué)誘導(dǎo)信號外,細(xì)胞內(nèi)還存在與代謝過程的環(huán)境因素密切相關(guān)的物理信號。物理信號作為代謝過程的重要指標(biāo),在微生物代謝過程中起到重要的作用,影響著細(xì)胞的生長代謝過程。因此,溫度、滲透壓及溶氧等物理信號在響應(yīng)啟動子開發(fā)方面受到了越來越多的關(guān)注,研究人員試圖以物理信號為誘導(dǎo)因子來調(diào)控細(xì)胞代謝,以減少代謝過程產(chǎn)生的一系列負(fù)擔(dān)以及副產(chǎn)物等,從而提高終產(chǎn)物的產(chǎn)量以及菌株對環(huán)境因素的耐受性。

在這些物理信號中,溫度是應(yīng)用最廣泛的,溫敏啟動子也被隨之開發(fā)出來。溫敏系統(tǒng)主要由啟動子PL和PR及溫敏蛋白CI857ts兩部分構(gòu)成,其中PL和PR來源于大腸桿菌λ噬菌體,具有極強(qiáng)的RNA轉(zhuǎn)錄功能,在合成生物學(xué)中有廣泛的應(yīng)用。更重要的是,該啟動子受蛋白CI857ts負(fù)調(diào)控:在30 ℃時,CI857ts具有抑制PL/PR啟動子的活性,但在42 ℃時,該蛋白則失去抑制啟動子的活性,啟動子能正常調(diào)控基因表達(dá)[12,29]。Harder等[13]用溫度敏感的CI857阻遏蛋白來調(diào)控大腸桿菌生物合成衣康:在37 ℃時,積累菌體生物量,而在28 ℃時合成目標(biāo)產(chǎn)物衣康酸,最終將衣康酸產(chǎn)量從32 g/L提高至47 g/L(圖8)。除了PL/PR類型的溫敏型啟動子外,Wang等[30]通過全基因組轉(zhuǎn)錄組分析及qRT-PCR擴(kuò)增得到一個高溫敏響應(yīng)啟動子PCgcwp1,將其應(yīng)用于谷氨酸棒桿菌,使木糖醇的產(chǎn)量提高了204%,達(dá)到15.4 g/L;同時,在木糖醇發(fā)酵驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),與30 ℃發(fā)酵相比,雖然在42 ℃發(fā)酵的生物量較低,但是木糖醇的產(chǎn)量從5.07 g/L提高到15.40 g/L,使更多的碳源流向了終產(chǎn)物。該研究擴(kuò)大了溫敏啟動子“工具箱”,使其不再局限于PL/PR啟動子。

圖8 溫敏啟動子響應(yīng)示意[13]

除了溫度外,滲透壓對代謝過程的影響也很大。一般在發(fā)酵中后期,滲透壓成為發(fā)酵過程中不得不考慮的因素,因?yàn)檫^高的滲透壓不僅影響細(xì)胞的生長,還會大大降低目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量,所以越來越多的研究人員也將目光聚焦于此。Huang等[24]研究調(diào)節(jié)滲透保護(hù)基因mtrA/mtrB后發(fā)現(xiàn),PNCgl1418對滲透壓的響應(yīng)是最明顯的,但與傳統(tǒng)的IPTG誘導(dǎo)啟動子和組成啟動子相比,表達(dá)強(qiáng)度還有很大的差距。因此,對該啟動子間隔序列進(jìn)行了隨機(jī)突變,得到了一個突變體,強(qiáng)度為對照組的8.5倍,常規(guī)啟動子的1.5倍,將該突變啟動子PNCgl1418/A10用來調(diào)控賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因lysE,通過加速發(fā)酵中后期賴氨酸的外排來提高賴氨酸的產(chǎn)量;通過滲透壓響應(yīng)啟動子對賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的過表達(dá)和 CRISPRi對賴氨酸消耗途徑的抑制相結(jié)合,賴氨酸產(chǎn)量從17.0 g/L提升到28.0 g/L,增長了64.7%(圖9)。這在一定程度上解決了滲透壓對代謝的影響。因?yàn)闈B透壓是在代謝過程中普遍存在的物理信號,比化學(xué)信號有更高的特異性,所以應(yīng)用更廣泛,普適性更強(qiáng)。

圖9 滲透壓響應(yīng)啟動子示意[24]

在發(fā)酵過程中,溶氧是至關(guān)重要的影響因素。Hwang等[23]對啟動子的間隔序列進(jìn)行隨機(jī)突變,篩選了強(qiáng)、中、弱3個不同強(qiáng)度的啟動子調(diào)控關(guān)鍵基因,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn):在大腸桿菌中引入溶氧響應(yīng)啟動子Pnar,成功地將D-乳糖產(chǎn)量從79.0 g/L增至105.6 g/L,增加了34%;在2,3-丁二醇生產(chǎn)中,將丙酮酸到2,3-丁二醇途徑的3個酶用3個不同強(qiáng)度的Pnar進(jìn)行調(diào)控后得到最優(yōu)組合,2,3-丁二醇的產(chǎn)量也從51.1 g/L增至88.0 g/L,提高了88%。與其他啟動子不同的是,他們使用了響應(yīng)啟動子的組合,不再是單一啟動子的調(diào)控,而是通過不同強(qiáng)度的啟動子調(diào)控,實(shí)現(xiàn)供給和消耗的平衡,使終產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)到最優(yōu)。

綜上可知,通過對物理和化學(xué)信號響應(yīng)啟動子的開發(fā)與改造,可拓寬目前啟動子的“工具箱”,根據(jù)不同的信號類型、發(fā)酵條件、發(fā)酵中間代謝產(chǎn)物和終產(chǎn)物選擇合適的響應(yīng)啟動子。同時,也可以使用相關(guān)啟動子的開發(fā)和改造方法來挖掘更多的響應(yīng)啟動子。如,可通過在脅迫條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析得到PCgcwp1、Pstress,對解毒操縱子或者保護(hù)機(jī)制的分析得到PNCgl1418、Pfrm,對現(xiàn)有已發(fā)現(xiàn)響應(yīng)操縱子的解析得到:PcgmA、PmarO和PPuuR以及在前人研究的基礎(chǔ)上開發(fā)的響應(yīng)啟動子Pnar、PBAD、Pc120和Psenlys。由于新開發(fā)的響應(yīng)啟動子的強(qiáng)度一般還達(dá)不到常規(guī)成熟的啟動子的性能,所以對其突變改造是必不可少的。目前,對響應(yīng)啟動子的改造主要集中于啟動子全序列的隨機(jī)突變、對間隔序列的隨機(jī)突變、轉(zhuǎn)錄因子的隨機(jī)突變以及雜交啟動子的利用等方面,另外通過induces box與強(qiáng)啟動子的結(jié)合,可改變box與啟動子結(jié)合區(qū)域的位置等方面以獲得理想型響應(yīng)啟動子[15]。雖然通過相關(guān)的方法開發(fā)和改造已獲得一些響應(yīng)啟動子,但對于建立微生物細(xì)胞工廠的需求來說,這些響應(yīng)啟動子的數(shù)量還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,特別是基于化學(xué)信號的響應(yīng)啟動子對中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物具有特異性識別,存在較多的局限性,所以在響應(yīng)啟動子開發(fā)方面還是任重道遠(yuǎn)。迄今為止,研究人員已開發(fā)出受不同的化學(xué)或物理信號調(diào)控的響應(yīng)啟動子,對目標(biāo)基因進(jìn)行不同強(qiáng)度的調(diào)控表達(dá),總結(jié)部分響應(yīng)啟動子的相關(guān)研究進(jìn)展于表1。

表1 不同類型的響應(yīng)啟動子

3 響應(yīng)啟動子的應(yīng)用

在響應(yīng)啟動子的開發(fā)和改造方面,研究人員通過一系列方法獲得較為理想的響應(yīng)啟動子?，F(xiàn)在響應(yīng)啟動子的應(yīng)用不再局限于終產(chǎn)物的產(chǎn)量最大化,而是根據(jù)實(shí)際需要,多元化應(yīng)用響應(yīng)啟動子。如,加速中間有毒代謝產(chǎn)物的消耗,提高終產(chǎn)物的產(chǎn)量;響應(yīng)細(xì)胞生長環(huán)境中的各種壓力脅迫,提高細(xì)胞的耐受性;響應(yīng)生長環(huán)境變化,使細(xì)胞從生物量的積累轉(zhuǎn)化到產(chǎn)物的積累,通過響應(yīng)細(xì)胞代謝產(chǎn)物,報告基因及時反饋終產(chǎn)物的濃度。這些響應(yīng)啟動子的多元化應(yīng)用也加速響應(yīng)啟動子的開發(fā)。

3.1 響應(yīng)脅迫壓力提高耐受性

除了有毒中間代謝產(chǎn)物會影響細(xì)胞的產(chǎn)能外,在細(xì)胞生長代謝過程中,尤其是在發(fā)酵的中后期,各種脅迫壓力嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長和代謝。雖然這些因素是無法避免的,但它們也是天然存在的誘導(dǎo)信號,每個代謝過程都存在,比化學(xué)信號有更好的普適性。Qin等[35]通過在高溫和高葡萄糖濃度等脅迫條件下獲得多個脅迫響應(yīng)啟動子,通過對各響應(yīng)啟動子的組合來優(yōu)化谷胱甘肽(GSH)抗氧化系統(tǒng)以提高酵母對各種脅迫的耐受性,最終酵母的耐受性得到提高,繼而大幅提高木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力,比對照組提升了49.5%。Huang等[24]在研究滲透壓調(diào)節(jié)保護(hù)系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn):天然滲透壓響應(yīng)啟動子,在大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)賴氨酸時,該啟動子對發(fā)酵后期的滲透壓及時響應(yīng),通過賴氨酸外排蛋白LysE及其CRISPR系統(tǒng)來調(diào)控;當(dāng)發(fā)酵體系的滲透壓過高時,響應(yīng)啟動子被激活,賴氨酸外排蛋白LysG過表達(dá),加速賴氨酸外排,從而提高賴氨酸產(chǎn)量;另一方面,CRISPR系統(tǒng)在高滲下被激活,抑制了賴氨酸消耗途徑,使賴氨酸產(chǎn)量進(jìn)一步提高。這些脅迫壓力的響應(yīng)啟動子既可解決各種脅迫,又可提高菌株的耐受性,提升終產(chǎn)物的產(chǎn)量,這類普適性較好的響應(yīng)啟動子在合成生物學(xué)研究及生物制造中會有更廣泛的應(yīng)用。

3.2 響應(yīng)環(huán)境變化增加產(chǎn)量

通過響應(yīng)環(huán)境變化,使微生物從生物量積累轉(zhuǎn)變到產(chǎn)物的積累,一般以物理類型的響應(yīng)啟動子來實(shí)現(xiàn),其中溶氧響應(yīng)啟動子、光響應(yīng)啟動子因其能快速切換,在相關(guān)的研究與生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。特別是更為簡便的QS系統(tǒng)因其受細(xì)胞密度誘導(dǎo),在生長與生產(chǎn)切換之間有著獨(dú)特的優(yōu)勢,成為應(yīng)用最多的系統(tǒng)。Soma等[44]將QS系統(tǒng)的LuxI/R應(yīng)用到大腸桿菌乙酰輔酶A的消耗途徑中,實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌從生物量積累切換到產(chǎn)物異丙醇的合成:當(dāng)細(xì)胞密度較低時,更多的碳源經(jīng)TCA循環(huán)來增加生物量;當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到閾值時,QS系統(tǒng)激活,減少乙酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)來增加終產(chǎn)物異丙醇的碳通量,減少碳損失的同時增加終產(chǎn)物的產(chǎn)量。Zhao等[33]在釀酒酵母中應(yīng)用光響應(yīng)啟動子,實(shí)現(xiàn)光控制發(fā)酵:在光誘導(dǎo)下,丙酮酸脫羧酶(PDC)表達(dá),最終產(chǎn)生乙醇,菌體正常生長;在黑暗狀態(tài)下,菌體生長被抑制,乳酸脫氫酶表達(dá),使丙酮酸流向乳酸,最終實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物異丁醇和2-甲基-1-丁醇的生產(chǎn)。

3.3 響應(yīng)檢測產(chǎn)物濃度

響應(yīng)啟動子不僅在提高耐受性、增加終產(chǎn)物產(chǎn)量方面得到很好的應(yīng)用,而且在監(jiān)測產(chǎn)物濃度的應(yīng)用也逐漸被開發(fā)出來。生物傳感器一般用于產(chǎn)物的濃度檢測及高通量篩選,主要是由響應(yīng)啟動子和報告基因?qū)崿F(xiàn)的,通過報告基因的熒光值能反映胞內(nèi)產(chǎn)物濃度。Binder等[26]開發(fā)了堿性氨基酸誘導(dǎo)的啟動子,轉(zhuǎn)錄因子LysG能夠與啟動子Psenlys特異性結(jié)合,受賴氨酸變構(gòu)調(diào)控,通過響應(yīng)啟動子PsenLys實(shí)時監(jiān)控胞內(nèi)賴氨酸濃度。Zhao等[27]在操縱子cgmAR中發(fā)現(xiàn)二胺響應(yīng)啟動子PcgmA,轉(zhuǎn)錄因子cgmR能與響應(yīng)啟動子特異結(jié)合,抑制基因的表達(dá);通過對轉(zhuǎn)錄因子的隨機(jī)突變獲得更加靈敏的傳感器,整個傳感器通過調(diào)控報告基因GFP,監(jiān)測胞內(nèi)熒光值實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞產(chǎn)二胺的實(shí)時監(jiān)控。而傳統(tǒng)的二胺類檢測一般采用高效液相色譜(HPLC)法[45],存在樣品前期處理和檢測流程復(fù)雜等缺點(diǎn),與傳統(tǒng)的HPLC方法相比,生物傳感器具有檢測方法便捷,在實(shí)現(xiàn)高通量檢測同時能夠?qū)崟r檢測,大大提高檢測效率。

4 結(jié)論與展望

在綠色、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的理念下,綠色制造產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展,合成生物學(xué)產(chǎn)業(yè)化在未來的發(fā)展中必將成為熱點(diǎn)。啟動子作為合成生物學(xué)重要的元件之一,通過調(diào)控目的基因表達(dá)與代謝路徑,最終達(dá)到高效合成產(chǎn)物和酶的目標(biāo),所以啟動子的研究是高效構(gòu)建細(xì)胞工廠的關(guān)鍵。開發(fā)新型響應(yīng)啟動子,不斷豐富合成生物學(xué)的“工具箱”,為更多的生物合成體系提供服務(wù)。啟動子的應(yīng)用研究正逐步從最初的IPTG誘導(dǎo)型啟動子邁向更加復(fù)雜類型的響應(yīng)啟動子,從單一的啟動子到多個啟動子串聯(lián)雜交應(yīng)用。目前的研究主要集中在特殊的代謝中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物方面的響應(yīng)啟動子的開發(fā),因?yàn)檫@些類型的啟動子似乎更加具有創(chuàng)新性。因?yàn)榛瘜W(xué)信號的響應(yīng)啟動子與對應(yīng)的代謝產(chǎn)物之間存在特異性,對其他代謝過程并不一定通用;而物理信號響應(yīng)啟動子,具有更好的廣譜性和可控性等優(yōu)點(diǎn),使它們不再局限于某一特定代謝途徑。一般來說,在發(fā)酵過程中,溫度和溶氧都要維持在較為穩(wěn)定的狀態(tài),但是在變溫和混菌等特殊的發(fā)酵過程中,應(yīng)用溫度和溶氧響應(yīng)啟動子是一種很好的選擇。

目前,響應(yīng)啟動子的開發(fā)仍然存在許多具有挑戰(zhàn)性的科學(xué)問題。如,單一啟動子調(diào)控代謝過程常常伴隨著表達(dá)泄露的問題,目前還不能從根本上解決這問題;特異性的響應(yīng)啟動子響應(yīng)強(qiáng)度和程度還不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求,達(dá)不到組成型啟動子和常規(guī)誘導(dǎo)啟動子的性能,還需要對其進(jìn)行突變和改造來提高其性能。目前,已開發(fā)的響應(yīng)啟動子的工作原理和調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步解析。這些問題是響應(yīng)啟動子開發(fā)的重點(diǎn)方向。隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展,用計算機(jī)以及人工智能技術(shù)來挖掘各種類型的響應(yīng)啟動子,能夠大大減少工作量,同時在響應(yīng)啟動子的改造和突變方面,可采用理性設(shè)計來取代隨機(jī)突變構(gòu)建文庫。從單一的響應(yīng)啟動子調(diào)控向多級調(diào)控的生物傳感器模塊乃至擴(kuò)大到細(xì)胞全局調(diào)控都將是未來響應(yīng)啟動子的研究重點(diǎn)。

綜上所述,響應(yīng)啟動子的開發(fā)及應(yīng)用仍然面臨許多挑戰(zhàn)和瓶頸,但在未來必將成為研究熱點(diǎn),這不僅可推動綠色生物制造產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,更可為我國的綠色、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展做出不可替代的貢獻(xiàn)。