熒光法測(cè)定菠菜焯水過(guò)程中維生素B2的流失
——熒光法測(cè)定維生素B2的實(shí)驗(yàn)拓展

黃洋祺，李譽(yù)，李常耕，朱顏，孫維嘉，范春涵，李琰，丁飛，張曉光，孔德明

南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院，南開大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，天津 300071

維生素B2(Vitamin B2，簡(jiǎn)稱VB2)是一種水溶性維生素，是人體內(nèi)很多重要酶的組成成分，在維持人體代謝中起著重要作用。缺乏VB2會(huì)影響人體細(xì)胞的生長(zhǎng)和機(jī)體的生物氧化，使代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致口、眼和外生殖器部位的炎癥，如口角炎、唇炎、舌炎、眼結(jié)膜炎和陰囊炎等[1-3]。由于人體自身無(wú)法產(chǎn)生VB2，只能通過(guò)食物等外界來(lái)源攝取，因此對(duì)食源性VB2的研究具有重要意義。

VB2的分子式為C17H20N4O6，擁有三個(gè)芳香環(huán)(圖1)。分子的平面剛性結(jié)構(gòu)賦予了VB2較強(qiáng)的熒光性質(zhì)，其最大的熒光發(fā)射波長(zhǎng)大約在525 nm左右。“熒光法測(cè)定VB2的含量”是很多大學(xué)儀器分析課程的常用本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)[4]。其基本的實(shí)驗(yàn)流程是在最佳的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，利用熒光強(qiáng)度與濃度的線性關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下測(cè)定未知溶液的熒光強(qiáng)度，并利用制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出未知溶液中VB2的含量。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)，可以加深學(xué)生對(duì)分子熒光的理解，了解熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)，掌握儀器的基本使用步驟及熒光定量分析的基本操作，對(duì)于輔助儀器分析教學(xué)至關(guān)重要。但作為一個(gè)本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)，其設(shè)計(jì)過(guò)于簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容偏少，學(xué)生往往很快就完成了全部實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。不僅使學(xué)生得不到充分的鍛煉，而且無(wú)法凸顯熒光分析法在人類生產(chǎn)和生活中的強(qiáng)大實(shí)際應(yīng)用能力。為此，在原有實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的基礎(chǔ)上開展進(jìn)一步設(shè)計(jì)，拓展實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，開發(fā)內(nèi)容更為豐富、且實(shí)驗(yàn)時(shí)間和操作難度適宜的本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)于提升實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果至關(guān)重要。

圖1 VB2的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

很多食物，包括動(dòng)物肝臟、肉類、蛋類、奶及奶制品中都含有大量的VB2。蔬菜也是人們獲取VB2的一個(gè)重要來(lái)源，部分蔬菜的VB2含量如表1所示。菠菜是一種比較常見的蔬菜，每100 g菠菜中VB2的含量大約為0.11 mg[5]，屬于VB2含量較高的綠色蔬菜。但由于菠菜中含有大量的草酸(0.2-0.3 g/100 g)，食用之后會(huì)與人體內(nèi)的鈣、鎂發(fā)生反應(yīng)，生成草酸鈣和草酸鎂等難以消化的物質(zhì)。不僅不利于人體健康，長(zhǎng)期食用還有可能引發(fā)結(jié)石。因此，在食用前通常需要對(duì)菠菜進(jìn)行焯水處理以去除草酸[6]，這一過(guò)程不可避免地會(huì)造成VB2的流失。本實(shí)驗(yàn)證明，利用熒光分析法可以考察菠菜焯水過(guò)程中VB2的析出情況。相關(guān)實(shí)驗(yàn)有望作為目前本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)拓展，不僅可以豐富教學(xué)內(nèi)容，而且使實(shí)驗(yàn)更加貼近于人們的實(shí)際生活。有助于提升學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，加深對(duì)所學(xué)內(nèi)容的理解。

表1 部分蔬菜中VB2的含量(mg/100 g)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象。熒光物質(zhì)分子在吸收了特定波長(zhǎng)的紫外光或可見光能量之后，從基態(tài)躍遷至相應(yīng)的激發(fā)態(tài)。在通過(guò)振動(dòng)馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)化等非輻射途徑損失掉一部分能量后，積累到第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再?gòu)脑撃芗?jí)向基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)躍遷，產(chǎn)生分子熒光。在一定濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度(F)與熒光物質(zhì)濃度(C)之間成正比關(guān)系(F=kC)，借此可以進(jìn)行定量分析。

能夠發(fā)出熒光的物質(zhì)通常具有剛性平面和大共軛結(jié)構(gòu)。VB2分子中由于存在由三個(gè)芳香環(huán)構(gòu)成的共軛體系，且結(jié)構(gòu)剛性，因此顯示了良好的熒光性質(zhì)。利用VB2產(chǎn)生的熒光信號(hào)，可以對(duì)菠菜焯水過(guò)程中釋放出來(lái)的VB2進(jìn)行定量分析，進(jìn)而計(jì)算出該過(guò)程中VB2的流失率。

1.2 試劑和材料

1.00 μg·mL-1VB2標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取1.00 mg VB2，將其溶解于含有1%乙酸的蒸餾水中。轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶，并用含有1%乙酸的蒸餾水定容至刻度、搖勻。分裝于棕色瓶中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

新鮮菠菜葉片：購(gòu)于當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Shimadzu RF-5301PC型熒光光譜儀(日本島津)、電加熱套、Sartorius電子天平(德國(guó)賽多利斯)、25 mL比色管、10 mL離心管、5 mL移液管、500 mL錐形瓶、移液器。

1.4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.4.1 VB2標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

準(zhǔn)確移取0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL的VB2標(biāo)準(zhǔn)貯備液于25 mL比色管中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。

1.4.2 菠菜焯水實(shí)驗(yàn)

(1) 選取新鮮的菠菜葉片，洗凈，用吸水紙去除表面水分，晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干備用。

(2) 向500 mL錐形瓶中加入400 mL蒸餾水，在電熱套上加熱至沸騰。此過(guò)程中將錐形瓶蓋上錫紙以減少熱量和水分損失。

(3) 準(zhǔn)確稱取40 g左右菠菜葉片，并快速加入至錐形瓶中，開始計(jì)時(shí)。每1 min用移液器從中取出2.5 mL水溶液至離心管中，冷卻至室溫備用。5 min后停止加熱，此時(shí)取出兩份水溶液，一份編號(hào)入上述的取出液系列，一份用于繪制取出液的熒光光譜。

1.4.3 熒光光譜的繪制

從1.4.1配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液中選取一個(gè)濃度較大的用于熒光光譜的繪制。具體步驟如下：以525 nm作為發(fā)射波長(zhǎng)繪制激發(fā)光譜，確定最佳激發(fā)波長(zhǎng)。再用該激發(fā)波長(zhǎng)繪制發(fā)射光譜，確定最佳發(fā)射波長(zhǎng)。使用相同的步驟，繪制焯水5 min取出液的激發(fā)和發(fā)射光譜，并確定其最佳激發(fā)波長(zhǎng)和最佳發(fā)射波長(zhǎng)。此過(guò)程中，激發(fā)和發(fā)射狹縫分別設(shè)置為5 nm和3 nm。

1.4.4 菠菜中VB2流失率檢測(cè)

分別選取463 nm和526 nm為激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，依次測(cè)定1.4.1中VB2標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，VB2濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下，測(cè)定1.4.2中每個(gè)焯水時(shí)間點(diǎn)下取出液的熒光強(qiáng)度。利用繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各取出液中VB2的濃度，進(jìn)而計(jì)算出各個(gè)時(shí)間點(diǎn)下析出的VB2質(zhì)量及流失百分率。

其中，菠菜中VB2總質(zhì)量按每100 g菠菜中含0.11 mg VB2計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光分析法用于菠菜焯水研究的可行性

VB2為水溶性維生素，室溫下的溶解度為12 mg/100 mL。加熱時(shí)，VB2在中性或酸性條件下具有較高的穩(wěn)定性。也就是說(shuō)，在焯水過(guò)程中，菠菜中的VB2可以釋放到熱水中，并在熱水中穩(wěn)定存在。因此可以推測(cè)，利用熒光分析法，可以對(duì)焯水過(guò)程中釋放到水里的VB2含量變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，進(jìn)而計(jì)算出VB2析出量隨焯水時(shí)間的變化。為證明這一點(diǎn)，準(zhǔn)確稱取一定量(40.45 g)的菠菜進(jìn)行焯水處理(圖2)。為減少焯水過(guò)程中因水分蒸發(fā)所造成的體積損失，選用錐形瓶作為容器，并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用錫紙密封錐形瓶口，只在取樣時(shí)短暫打開。選取焯水5 min的取出液進(jìn)行熒光光譜的繪制，并與VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果如圖3所示，該取出液具有熒光性質(zhì)，其最大激發(fā)波長(zhǎng)(λex)和最大發(fā)射波長(zhǎng)(λem)分別為463 nm和525 nm，與VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液(λex= 466 nm，λem= 526 nm)非常接近。雖然菠菜中同時(shí)存在草酸、維生素C、維生素E、胡蘿卜素和視黃醇等物質(zhì)，但它們或者沒有熒光，或者激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)與VB2差別較大。因此可以推斷，圖3b中所示的熒光信號(hào)是由菠菜焯水過(guò)程中析出的VB2所引起的。利用熒光光譜，可以對(duì)析出的VB2進(jìn)行定量檢測(cè)。

圖2 (a) 菠菜樣品；(b) 焯水裝置；(c) 焯水不同時(shí)間的取出液

圖3 VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.08 μg·mL-1) (a)和菠菜焯水5 min取出液(b)的激發(fā)和發(fā)射光譜

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

測(cè)定VB2標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液與菠菜焯水取出液的最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)略有不同，為使繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線適用于菠菜焯水取出液中VB2的定量分析，對(duì)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行了折中選取。從圖3可以看出，無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)溶液還是焯水取出液，在激發(fā)光譜中，熒光強(qiáng)度在最大激發(fā)波長(zhǎng)前變化較緩，在最大激發(fā)波長(zhǎng)后迅速下降，因此選擇較小的463 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)。由于熒光光譜的對(duì)稱性，發(fā)射光譜給出了相反的趨勢(shì)，即熒光強(qiáng)度在最大發(fā)射波長(zhǎng)前變化較大，在最大發(fā)射波長(zhǎng)后變化減緩，因此選擇較大的526 nm作為發(fā)射波長(zhǎng)。在選取的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。在0.02-0.10 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與VB2濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。線性回歸方程為F= 5203.13C(μg·mL-1) - 1.96，線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9987。

圖4 VB2熒光分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 菠菜焯水過(guò)程中VB2的析出研究

將不同焯水時(shí)間點(diǎn)的取出液冷卻至室溫，在與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度，并利用前面得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)下取出液中VB2的濃度，進(jìn)而計(jì)算出該時(shí)間點(diǎn)下VB2的總析出量。注意，在進(jìn)行VB2總析出量計(jì)算時(shí)，需要把前面各時(shí)間點(diǎn)取出液中含有的VB2計(jì)算在內(nèi)。舉例而言，計(jì)算焯水3 min時(shí)VB2的總析出量，需要加上第1 min和第2 min取出液(各2.5 mL)里的VB2(各自時(shí)間點(diǎn)下取出液中VB2濃度 × 2.5 mL)。以每100 g菠菜中含有0.11 mg VB2計(jì)算，40.45 g菠菜中含有的VB2總量為0.04450 mg (44.50 μg)。利用此數(shù)據(jù)，可以計(jì)算出各個(gè)時(shí)間點(diǎn)下VB2的流失率。從表2和圖5可以看出，在焯水過(guò)程中，VB2快速?gòu)牟げ酥形龀?。在焯? min和2 min時(shí)，VB2的析出百分率分別為44.65%和62.74%。在0到1 min的時(shí)間段，VB2的析出速率最快。在1到2 min的時(shí)間段，仍保留了較快的析出。其中一個(gè)原因是當(dāng)菠菜剛加入沸水中時(shí)，會(huì)使體系的溫度下降。也就是說(shuō)，在開始的1 min內(nèi)，有一段時(shí)間錐形瓶中的水并沒有處于沸騰狀態(tài)，導(dǎo)致VB2未能充分析出。2 min后，VB2的析出速率變緩。當(dāng)焯水時(shí)間為5 min時(shí)，VB2的析出百分率為73.82%。將焯水時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至10 min時(shí)，VB2的析出百分率達(dá)到76.66%。從以上結(jié)果可以看出，由于VB2在沸水中具有較高的溶解度，在焯水過(guò)程中，VB2極易從菠菜中析出。當(dāng)焯水時(shí)間為3 min時(shí)，大約2/3的VB2將會(huì)進(jìn)入到水中而流失。當(dāng)焯水時(shí)間為5 min時(shí)，大約3/4的VB2將會(huì)析出。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)延長(zhǎng)焯水時(shí)間，對(duì)VB2的析出影響不大?？紤]到人們?cè)趯?shí)際生活中并不會(huì)對(duì)菠菜進(jìn)行過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的焯水，大約有1/2-1/3的VB2會(huì)保留在菠菜當(dāng)中。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，雖然菠菜是VB2含量相對(duì)較高的一種綠色蔬菜，但由于食用前往往需要焯水處理以去除草酸，會(huì)造成一半以上的VB2流失，導(dǎo)致人們實(shí)際攝入的VB2并不多。平行進(jìn)行三組實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證分析結(jié)果的重現(xiàn)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖5)，該方法重現(xiàn)性良好，除在VB2快速析出階段(0-3 min)相對(duì)偏差較大外(～7%)，其他階段，尤其是析出平衡階段，偏差均在5%以內(nèi)。

表2 不同焯水時(shí)間下VB2的流失率

2.4 將實(shí)驗(yàn)內(nèi)容應(yīng)用于本科教學(xué)的可行性

該實(shí)驗(yàn)可以有效克服原有實(shí)驗(yàn)內(nèi)容偏少、學(xué)生得不到充分鍛煉的問(wèn)題。在原有實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上加入本部分內(nèi)容后，全部實(shí)驗(yàn)可以在4個(gè)學(xué)時(shí)之內(nèi)完成。另外，該部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容對(duì)儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單，只需要引入化學(xué)實(shí)驗(yàn)室常備的電子天平、電熱套和錐形瓶即可。以上特點(diǎn)使其尤其適用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)。在兩個(gè)學(xué)期的試運(yùn)行中，學(xué)生普遍反映良好，被譽(yù)為印象最為深刻的儀器分析實(shí)驗(yàn)。學(xué)生給出了如下評(píng)價(jià)：實(shí)驗(yàn)既貼近生活，易于操作，又新穎有趣，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)理論知識(shí)有了更深的理解；實(shí)驗(yàn)揭示了有關(guān)菠菜焯水過(guò)程中維生素的流失情況，對(duì)指導(dǎo)我們的生活頗有意義；實(shí)驗(yàn)在原有課程實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以分析技術(shù)證明生活中蔬菜焯水對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)素的影響，更加貼近生活；實(shí)驗(yàn)對(duì)原有課程進(jìn)行了豐富補(bǔ)充，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容安全有趣，能夠與日常生活緊密聯(lián)系，起到對(duì)學(xué)生在學(xué)以致用方面的提示作用；實(shí)驗(yàn)生動(dòng)有趣，與人們的生活密切相關(guān)，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)，對(duì)將分析技術(shù)應(yīng)用于人類生活有了更為深入的理解。

3 結(jié)語(yǔ)

在證明熒光分析法可以用于分析菠菜焯水過(guò)程中VB2流失情況的基礎(chǔ)上，提出將該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容豐富到本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)“熒光法測(cè)定維生素B2”的實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革思路。這一改革思路具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1) 豐富了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，克服了原有實(shí)驗(yàn)內(nèi)容偏少、學(xué)生鍛煉不足的問(wèn)題；(2) 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容新穎有趣，既有利于提升學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，又有利于加深學(xué)生對(duì)課堂知識(shí)的理解；(3) 研究?jī)?nèi)容貼近生活，有利于幫助學(xué)生培養(yǎng)學(xué)以致用的能力；(4) 實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)適宜，對(duì)儀器要求低，使用化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常備儀器即可完成，尤其適用于推廣為本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)。