氨基酸手性色譜分離

杜瑾，石宜靈，唐安娜，孔德明

南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院，分析科學(xué)研究中心，天津市生物傳感與分子識別重點實驗室，化學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，天津 300071

手性(Chirality)起源于希臘語，表達(dá)了某種化合物和其鏡像化合物不能重疊的關(guān)系，正如人的左手和右手不能完全重疊(圖1)。手性是自然界存在的一種普遍特征，在生命產(chǎn)生和演變過程中都有所體現(xiàn)。自然界存在種類繁多的手性化合物，糖類化合物、氨基酸類化合物、有機酸、萜類化合物、生物堿等均存在手性，而氨基酸是其中重要的一類，組成蛋白質(zhì)的20種基本氨基酸中只有甘氨酸不含手性碳。

圖1 手性對稱

氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)小分子，光學(xué)活性和立體構(gòu)象不同的氨基酸，在生命體內(nèi)表現(xiàn)出不同的生理活性和作用。手性氨基酸在醫(yī)藥、食品和化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。L-谷酰胺及衍生物是治療胃潰瘍的主要藥物；L-天冬酰苯丙氨酸甲酯可以提升飲料的口感和味道，是常用的甜味劑。那格列奈(N-(反式-4-異丙基環(huán)己基-1-甲?；?-D-苯丙氨酸)，是一種在治療2型糖尿病上有良好表現(xiàn)的非磺酰脲類口服降血糖藥(圖2)，由于其基本結(jié)構(gòu)為氨基酸，決定了該藥的毒性很低。臨床以反式D-異構(gòu)體形式給藥，其具有刺激胰島素分泌的活性，反式D-異構(gòu)體是其對映異構(gòu)體活性的100倍。因此，對于氨基酸手性異構(gòu)體的分離分析具有重要意義。

圖2 那格列奈(a)及其L-異構(gòu)體(b)

1 氨基酸手性色譜分離技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

外消旋體拆分是應(yīng)用較為廣泛的手性分離方法，其中色譜法速度快、靈敏度高、操作簡單，是理想的手性分離方法，也是手性氨基酸分離最主要的方法[1]。色譜法分離手性氨基酸主要有以下幾種分離模式。(1) 采用手性衍生化試劑：手性衍生化試劑與對映體反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)變?yōu)橐粚Ψ菍τ钞悩?gòu)體，利用非對映異構(gòu)體物化性質(zhì)的不同，在非手性色譜柱上實現(xiàn)分離。(2) 手性添加劑法：在流動相中加入手性添加劑，其與手性對映體通過靜電力、氫鍵、配位鍵等方式，形成非對映體，在非手性色譜柱上實現(xiàn)對映體拆分。(3) 手性固定相法：將具有手性識別能力的化合物負(fù)載在固相載體上而得到手性固定相，其與手性對映體之間通過氫鍵、疏水力、靜電力、空間位阻效應(yīng)及配位鍵等形成“瞬態(tài)”非對映體，基于非對映體穩(wěn)定性的差異，實現(xiàn)對映體分子拆分。目前，應(yīng)用于氨基酸手性分離的色譜法主要有以下幾種：高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、氣相色譜(Gas Chromatography，GC)、超臨界流體色譜(Supercritical Fluid Chromatography，SFC)、毛細(xì)管電泳/電色譜(Capillary Electrophoresis/Capillary Electrochromatography，CE/CEC)和高速逆流色譜(High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)。

1.1 高效液相色譜法(HPLC)

HPLC是一種快速、高效的分離方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于氨基酸手性分離。一種新型奎寧-冠醚組合型手性固定相，通過奎寧的離子交換作用和冠醚的絡(luò)合作用對氨基酸進(jìn)行手性拆分，其對12種氨基酸對映體有良好的手性拆分能力[2]。Li等[3]報道了一種基于三唑連接的雙聯(lián)環(huán)糊精手性固定相在30 min內(nèi)實現(xiàn)了丹酰-DL-亮氨酸和丹酰-DL-苯丙氨酸的完全分離。共價有機框架(Covalent Organic Framework，COF)是通過共價鍵將有機單元連接的結(jié)晶有機納米多孔材料。手性COF是通過將手性基團引入COF結(jié)構(gòu)中制備的，具有比表面積大、結(jié)構(gòu)有序和孔徑可調(diào)的特點，在分離方面比無定形多孔材料更有前景。Zhang等[4]通過共價鍵將一系列生物分子(氨基酸、肽、酶)固定到非手性COF中，作為HPLC的手性固定相，在正相和反相模式下，高效分離各種外消旋體(圖3)。Qian等[5]采用手性COF-乙烯二甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸酯共聚物整體柱，成功分離了組氨酸、色氨酸、半胱氨酸和絲氨酸對映體。

圖3 (a) 溶菌酶共價固定的COF作為HPLC手性固定相分離手性對映體；(b) DL-蘇氨酸；(c) DL-亮氨酸；(d) DL-色氨酸[4]

1.2 氣相色譜法(GC)

Frank等[6]首次使用手性固定相研究氨基酸GC分離。GC用于分析熱穩(wěn)定性好、揮發(fā)性好的樣品，并且檢出限較低。因為GC使用的流動相是氣體，所以不會產(chǎn)生大量的有機廢液。氨基酸結(jié)構(gòu)中存在氨基、羰基、羥基等多個極性基團，不易揮發(fā)。進(jìn)行氣相色譜分離時，氨基酸中極性基團與固定液產(chǎn)生氫鍵作用力，導(dǎo)致不出峰、峰形拖尾、靈敏度低等問題，因此經(jīng)常通過?；?、烷基化(包括硅化)和縮合將其衍生化成揮發(fā)性好且熱穩(wěn)定的衍生物后進(jìn)行分離。Menestrina等[7]采用氯甲酸乙酯/乙醇混合物作為衍生試劑，在(3-O-丁?；?2,6-二-O-戊基)-γ-環(huán)糊精(Lipodex E)手性色譜柱上對牛奶中多種氨基酸衍生物進(jìn)行了色譜分析。

手性金屬有機骨架(Metal Organic Framework，MOF)涂層開管柱可用于手性化合物的高分辨氣相色譜分離。該柱具有優(yōu)異的選擇性，并且對烷烴、醇、氨基酸及其衍生物等具有良好的識別能力[8]。多孔有機分子籠作為一種新型的多孔材料，近年來因其潛在的應(yīng)用受到極大的關(guān)注。采用聚硅氧烷(OV-1701)稀釋的手性多孔有機籠作為固定相，可用于手性醇、二醇、胺、醇胺、酯、酮、醚、鹵代烴、有機酸、氨基酸甲酯和亞砜的分離[9](圖4)。

圖4 手性多孔有機籠用于對映體GC分離[9]

1.3 超臨界流體色譜(SFC)

SFC是一種利用超臨界流體作為流動相分離組分的技術(shù)，具有分析時間短、效率高、成本低等優(yōu)點，尤其是使用二氧化碳作為流動相無毒性，使得SFC具有獨特優(yōu)勢。SFC利用氣體的高滲透性和液體的高溶解性將物質(zhì)溶解其中，被認(rèn)為是GC和LC的“混合物”[10]。與氣相色譜相比，SFC可以分析更寬分子量范圍的化合物，并且可以很好地檢測不含發(fā)色團的化合物，在低溫下分離熱不穩(wěn)定化合物，具有低粘度和高擴散性，使得SFC方法比HPLC快3-5倍。

Lajkó等[11]應(yīng)用最近開發(fā)的基于金雞納生物堿的兩性離子手性固定相，對大量Nα-Fmoc蛋白氨基酸對映體進(jìn)行了立體選擇性SFC分離。觀察到在手性柱(chiral pak ZWIX(+))上，所有D-對映體最先洗脫。Lipka等報道了采用亞/超臨界流體色譜，在多糖基手性柱上分離未衍生氨基酸對映體。其中，基于纖維素(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)的色譜柱表現(xiàn)出最優(yōu)手性識別能力，10種氨基酸實現(xiàn)基線手性分離[12]。

1.4 毛細(xì)管電泳/毛細(xì)管電色譜法(CE/CEC)

CE是以毛細(xì)管為分離通道、高壓直流電場驅(qū)動的一種高效液相分離技術(shù)。由于CE具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少、應(yīng)用范圍廣、儀器簡單、污染小、成本低等優(yōu)點，在分離科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。20世紀(jì)80年代，Jorgenson和Lukacs[13]最先論述了使用熒光檢測和毛細(xì)管電泳法實現(xiàn)丹磺?；被岱蛛x。Piehl等[14]利用微芯片CE熒光檢測，以高取代磺酸基環(huán)糊精作為手性選擇劑，實現(xiàn)了9種丹?；被釋τ丑w的超快速分離。

CEC是HPLC和CE相結(jié)合的產(chǎn)物。CEC與CE最大的不同是毛細(xì)管柱引入了色譜固定相，使CEC同時具有CE與HPLC的分離機理。大環(huán)抗生素是常用的手性選擇性試劑，其可以與D-丙氨酸-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)末端基團結(jié)合，已成為天然氨基酸和氨基酸衍生物對映體分離的首選，尤其是對β-氨基酸對映體的分離。Pataj等[15]在含有大環(huán)糖肽抗生素替考拉寧(Chirobiotic T或T2)或替考拉寧苷元(Chirobiotic TAG)作為手性選擇劑的手性固定相上分離了8種β2-和β3-高氨基酸的對映體，Chirobiotic TAG柱對β2-高氨基酸表現(xiàn)出更好的選擇性，而在Chirobiotic T或T2上，β3-高氨基酸對映體的分離效果更好，觀察到洗脫順序為R＜S。將開管毛細(xì)管電色譜與無鞘質(zhì)譜(MS)相結(jié)合，可有效分離未衍生化的氨基酸對映體[16]。用三維多孔層和金納米顆粒修飾毛細(xì)管內(nèi)表面，并通過Au—S鍵將手性選擇劑巰基-β環(huán)糊精(SH-β-CD)引入表面，制備得到手性柱，大大增加了固定相的比表面積，進(jìn)而提高固定相與分析物之間的相互作用(圖5)。

圖5 毛細(xì)管開管柱電色譜分離氨基酸對映體[16]

1.5 薄層色譜法(TLC)

薄層色譜法的優(yōu)勢在于允許在最少或沒有樣品預(yù)處理步驟的情況下分析復(fù)雜樣品，避免時間和材料的損失。此外，可以在一個TLC板上同時運行多個樣品。TLC廣泛應(yīng)用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂類、生物堿等多種物質(zhì)的分離和鑒定。Khatri等[17]將聚乙烯醇與戊二醛和環(huán)糊精交聯(lián)形成膜，用作TLC手性固定相。該膜具有優(yōu)異的對映體分離性能，成功實現(xiàn)了組氨酸和絲氨酸對映體分離。

1.6 高速逆流色譜(HSCCC)

HSCCC是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術(shù)，它不用任何固態(tài)的支撐物或載體，利用兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性流體動力學(xué)平衡，其中一相作為固定相，另一相作為流動相，物質(zhì)的分離依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)。由于被分離物質(zhì)與液態(tài)固定相之間能夠充分接觸，使得樣品的制備量大大提高，是一種理想的制備分離手段。HSCCC具有適用范圍廣、操作靈活、高效、快速、制備量大、費用低等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、天然產(chǎn)物、食品和化妝品等領(lǐng)域。Xiong等[18]研究了以N-正十二烷基-L-羥基脯氨酸為手性配體，Cu(II)為過渡金屬離子，通過手性配體交換HSCCC分離α-氨基酸，成功實現(xiàn)了5種氨基酸對映體分離。

2 氨基酸手性色譜分離存在的問題及解決方法

近些年有關(guān)氨基酸手性色譜分離的代表性文獻(xiàn)列于表1中[2-5,7-9,11,12,14-27]。為了進(jìn)一步提高手性分離效率，開發(fā)對映體選擇性更高的手性選擇劑或固定相非常重要。手性多孔材料(手性COFs、MOFs材料、手性多孔有機籠、手性膜材料)和新型超分子結(jié)構(gòu)手性固定相是有很大應(yīng)用前景的選擇[28,29]。針對手性柱制備過程繁瑣、耗時等問題，可以通過改進(jìn)、簡化手性色譜柱制備過程來解決。為了更深入研究手性作用的機理，可以通過計算機模擬技術(shù)結(jié)合實驗結(jié)果，對其進(jìn)行深入探討。

表1 氨基酸手性色譜分離

3 總結(jié)與展望

氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)單位，氨基酸手性對映體分離具有重要研究意義。本文介紹了目前應(yīng)用于氨基酸手性分離的主要色譜分析方法，并討論了各種分析方法的特點和應(yīng)用范圍。開發(fā)新的高性能分離手段、開發(fā)新型多功能手性復(fù)合材料、探索多種手性拆分試劑聯(lián)合使用以提高手性氨基酸拆分效率，并結(jié)合計算機模擬技術(shù)深入探討手性作用機理，是未來氨基酸手性分離分析的發(fā)展方向。