益生菌降膽固醇的機制及其評價策略研究進(jìn)展

高 媛，黃芳芳，王家旺，王慧平，孔保華，秦立剛,*，陳 倩,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

膽固醇是一種體內(nèi)廣泛存在的類固醇，不僅是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要成分，還是合成膽汁酸、類固醇激素和VD3等維持人體健康必需物質(zhì)的前體[1]，在人體中發(fā)揮著不可或缺的生理作用，但其水平過高也會造成潛在的健康隱患，例如心血管疾病、腎臟疾病和骨代謝疾病等[2-4]。其中，心血管疾病是全球主要的致死病因[5]。通常采用藥物治療與飲食調(diào)節(jié)的方式降低體內(nèi)膽固醇，藥物治療主要是服用他汀類的一些降脂調(diào)脂藥物，該法雖便捷有效，但長期服用不僅對人體有毒副作用[6]，且花銷不菲；飲食調(diào)節(jié)通常是指食用低膽固醇或有降膽固醇功效的食品，該法雖健康安全，但長期堅持較為困難，且僅以飲食調(diào)節(jié)效果有限[7]?？梢姡@兩種方法在實際應(yīng)用時均有一定的局限性，因此，開發(fā)安全有效的降膽固醇方法現(xiàn)已成為研究熱點。益生菌是指當(dāng)達(dá)到一定數(shù)量時對宿主有益的活性微生物[8]，大量研究已證實其具有降膽固醇作用。因此，明確益生菌的降膽固醇機制、了解評價益生菌降膽固醇特性的策略方法，對開發(fā)具有高效降膽固醇作用的益生菌菌株具有重要意義。

1 膽固醇合成及代謝機制

體內(nèi)膽固醇來源主要包括食源攝取和自身合成兩個途徑，體內(nèi)的膽固醇代謝包括轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)運過程（圖1），其中涉及多種酶、載脂蛋白以及蛋白受體的參與[9]。

圖1 人體內(nèi)膽固醇攝取、合成、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)運途徑Fig. 1 Pathways of cholesterol intake, synthesis, conversion and transport in human body

1.1 膽固醇的攝取

飲食攝取的膽固醇約占人體內(nèi)膽固醇來源的1/3，小腸是人體攝取膽固醇的主要場所。飲食中的FC首先與膽汁鹽形成微團(tuán)以到達(dá)小腸上皮細(xì)胞表面[10]，經(jīng)尼曼-匹克C1型類蛋白1（Niemann-Pick C1 like 1，NPC1L1）通過囊泡內(nèi)吞機制介導(dǎo)吸收[11]，隨后大部分被?；o酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase，ACAT）催化為膽固醇酯（cholesteryl ester，CE）[12]。

1.2 膽固醇的合成

膽固醇的合成主要依靠自身細(xì)胞內(nèi)源合成，在大多數(shù)細(xì)胞中均可合成，其中肝臟是進(jìn)行膽固醇合成過程的主要部位[13]。膽固醇的合成涉及近30 個反應(yīng)步驟，首先是兩分子的乙酰輔酶A形成乙酰乙酰輔酶A，經(jīng)HMG-CoA合酶催化，添加上第三分子乙酰輔酶A從而形成HMG-CoA，HMG-CoA被HMG-CoA還原酶還原為甲羥戊酸，隨后經(jīng)多步反應(yīng)加工為FC[14]。

1.3 膽固醇的轉(zhuǎn)化

在體內(nèi)，膽固醇可轉(zhuǎn)化為膽汁酸、類固醇激素和VD3。膽汁酸的合成過程包括經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑，該過程主要在肝臟中進(jìn)行且以經(jīng)典途徑為主[15]。經(jīng)典途徑中膽固醇首先被CYP7A1催化生成7α-羥基膽固醇，后經(jīng)多步反應(yīng)可得到CA和CDCA兩種初級膽汁酸[16]。初級膽汁酸可以與甘氨酸或牛磺酸結(jié)合形成膽汁鹽，進(jìn)一步被腸道微生物修飾以產(chǎn)生次級膽汁酸，即DCA和LCA[17]。類固醇激素包括腎上腺皮質(zhì)激素和性激素兩類激素的合成，且均始于CYP11A1轉(zhuǎn)化膽固醇為孕烯醇酮[18]。孕烯醇酮可被轉(zhuǎn)化為孕酮和17α-羥基孕酮，隨后在腎上腺皮質(zhì)中經(jīng)多步反應(yīng)分別生成醛固酮和皮質(zhì)醇。孕烯醇酮還可被轉(zhuǎn)化為17α-羥基孕烯醇酮，腎上腺皮質(zhì)中17α-羥基孕烯醇酮被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為脫氫表雄酮，性腺中脫氫表雄酮經(jīng)轉(zhuǎn)化可得到雄烯二酮和睪酮[19-20]，卵巢中雄烯二酮和睪酮經(jīng)轉(zhuǎn)化可得到雌酮和雌二醇[21]。VD3的合成首先是由7-脫氫酶催化膽固醇以生成7-脫氫膽固醇，紫外線催化7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化為前VD3，之后通過自發(fā)和溫度依賴性異構(gòu)化反應(yīng)合成VD3。此時生成的VD3還需進(jìn)行轉(zhuǎn)化才具有生物活性，在肝臟中由25-羥化酶催化生成25-羥基VD3[22]，之后又在腎臟中由1α-羥化酶催化為1α,25-二羥基VD3[23]。

1.4 膽固醇的轉(zhuǎn)運

膽固醇在體內(nèi)以FC和CE形式存在，并通過脂蛋白運輸從而進(jìn)入血液循環(huán)。食物經(jīng)消化酶作用釋放出FC與CE，CE在膽固醇酯酶作用下水解為FC，F(xiàn)C在被小腸攝取后大部分生成CE。腸道以攝取的膽固醇及合成的膽固醇來生成CM和新生HDL，CM由甘油三酯（triglyceride，TG）、膽固醇、磷脂和載脂蛋白構(gòu)成，新生HDL由磷脂、載脂蛋白和膽固醇構(gòu)成，CM經(jīng)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)后TG被脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）水解，而殘余顆粒通過CM殘余顆粒受體被肝臟吸收，新生HDL分泌進(jìn)入血液循環(huán)后FC被卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶酯化生成成熟HDL，并通過HDL受體被肝臟吸收[24-25]。肝臟中合成的FC少部分被ACAT酯化為CE，肝臟以脂蛋白中的膽固醇以及合成的膽固醇來生成VLDL、新生HDL和膽汁。VLDL由TG、膽固醇、磷脂和載脂蛋白構(gòu)成，VLDL分泌進(jìn)入血液循環(huán)后被LPL水解或通過VLDL受體被吸收，VLDL經(jīng)LPL水解可生成中間密度脂蛋白（intermediate-density lipoprotein，IDL），IDL的TG與HDL的CE通過膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白交換，部分IDL通過LDL受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）被肝臟吸收，其余的IDL被肝脂肪酶轉(zhuǎn)化為LDL，LDL可通過LDLR被吸收[26-27]。膽汁由水、膽汁酸以及膽固醇等構(gòu)成，其經(jīng)膽管從肝臟和膽囊流入十二指腸，膽汁酸大部分經(jīng)門靜脈血運輸返回肝臟，而少部分經(jīng)過糞便和尿液排出體外[28-29]。

2 益生菌降膽固醇機制

益生菌降膽固醇的機制復(fù)雜多樣，并且是由多種機制協(xié)同作用。目前，關(guān)于益生菌降膽固醇機制的研究多基于體外實驗和動物實驗，下面主要從這兩個角度分析其降膽固醇的機制。益生菌主要通過菌體細(xì)胞吸收結(jié)合膽固醇或代謝產(chǎn)物降低體外膽固醇；而降體內(nèi)膽固醇則是通過影響膽固醇的合成及代謝，即抑制膽固醇的攝取、抑制膽固醇的合成、促進(jìn)膽固醇的轉(zhuǎn)化和調(diào)節(jié)膽固醇的轉(zhuǎn)運實現(xiàn)。

2.1 體外降膽固醇機制

2.1.1 菌體細(xì)胞吸收結(jié)合膽固醇

益生菌可將膽固醇吸收進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)，也可將膽固醇以吸附或摻入的方式結(jié)合在菌體細(xì)胞表面。李雅迪[30]將植物乳桿菌S11分別在含膽固醇（實驗組）和不含膽固醇（對照組）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，測定其菌體破碎后上清液及細(xì)胞碎片懸浮液中膽固醇含量，結(jié)果表明實驗組的兩個組分中膽固醇含量均高于對照組，說明該菌株可通過將膽固醇吸收進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)和將膽固醇吸附或摻入菌體細(xì)胞膜的方式降膽固醇。Liong等[31]測定了11 株乳桿菌生長、熱滅活和靜息細(xì)胞的降膽固醇能力，將活細(xì)胞和熱滅活細(xì)胞在含膽汁鹽和膽固醇的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，同時將活細(xì)胞在含膽汁鹽和膽固醇的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明，生長細(xì)胞的膽固醇去除量顯著高于熱滅活和靜息細(xì)胞，說明降膽固醇能力與細(xì)胞的生長狀態(tài)有關(guān)，而熱滅活和靜息細(xì)胞均可去除膽固醇的結(jié)果則表明膽固醇可能通過與細(xì)胞表面結(jié)合而得以去除。Lye等[32]測定了5 株乳桿菌在有膽固醇（實驗組）和沒有膽固醇（對照組）存在的情況下的細(xì)胞脂肪酸組成、對超聲處理和酶處理的耐受性，以及細(xì)胞膜插入3 種熒光探針后的熒光各向異性，結(jié)果表明，實驗組較對照組細(xì)胞脂肪酸組成發(fā)生了顯著變化，并且耐受性更強，這可能是因為膽固醇摻入了細(xì)胞膜，細(xì)胞膜熒光各向異性進(jìn)一步確定了膽固醇的摻入位置，即細(xì)胞膜磷脂雙分子層的磷脂尾部、上層磷脂和極性頭部區(qū)域。Choi等[33]探究了植物乳桿菌EM細(xì)胞壁的降膽固醇作用，以及細(xì)胞的生長和死亡狀態(tài)對其吸附膽固醇的影響。結(jié)果表明，細(xì)胞壁能去除膽固醇，且隨細(xì)胞壁濃度升高膽固醇去除量增多，這說明細(xì)胞壁對膽固醇的去除作用無需依賴任何代謝過程。通過掃描電子顯微鏡觀察生長細(xì)胞和死亡細(xì)胞表面以及制備的細(xì)胞壁組分吸附膽固醇的情況，結(jié)果表明，無論活細(xì)胞還是死亡的細(xì)胞，其細(xì)胞壁均能吸附膽固醇。

2.1.2 代謝產(chǎn)物降膽固醇

益生菌能夠降膽固醇的代謝產(chǎn)物，主要包括膽汁鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）和胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）。Ye Zhiwei等[34]采用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)和實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）研究了海洋植物乳桿菌Lp10的降膽固醇機制，推測BSH和EPS都參與了降膽固醇，并且其降膽固醇機制因培養(yǎng)條件不同而異：該菌株在含膽固醇和膽汁鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，bsh1和bsh2基因的表達(dá)顯著增加，這兩個基因誘導(dǎo)了膽固醇和膽汁酸的共沉淀，從而實現(xiàn)降膽固醇；將菌株在含膽固醇但不含膽汁鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，EPS生物合成相關(guān)基因開始表達(dá)，促進(jìn)了EPS吸附膽固醇實現(xiàn)降膽固醇。BSH水解膽汁鹽產(chǎn)生膽汁酸，在酸性條件（pH＜5.5）下，膽汁酸可與膽固醇共沉淀[35]。BSH活性存在著底物偏好，因膽汁鹽不同而有所差異[36]。Kumar等[37]測定了3 株植物乳桿菌的BSH活性、水解膽鹽能力和膽固醇與膽汁酸的共沉淀能力。首先將菌株分別在含膽固醇和膽汁鹽的培養(yǎng)基，以及含膽固醇但不含膽汁鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后離心并測定上清液中膽固醇含量，兩種培養(yǎng)條件測出的膽固醇含量的差值就是共沉淀膽固醇的量，結(jié)果表明，實驗菌株均可產(chǎn)生BSH，但BSH活性和共沉淀膽固醇的能力因菌株而異。降膽固醇與EPS產(chǎn)生存在相關(guān)性，膽固醇能促進(jìn)EPS的產(chǎn)生，產(chǎn)EPS多的菌株，其降膽固醇效果好[38]，并且降膽固醇效果具有濃度依賴性[39]。Yilmaz等[40]研究了6 株植物乳桿菌EPS的降膽固醇能力，發(fā)現(xiàn)實驗菌株的EPS均能去除溶液中的膽固醇，但不同菌株的EPS降膽固醇能力存在差異，這可能與EPS的大小和結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.2 體內(nèi)降膽固醇機制

2.2.1 抑制膽固醇的攝取

益生菌主要以2 種方式抑制膽固醇攝取，即通過BSH作用與下調(diào)NPC1L1基因表達(dá)。BSH除誘導(dǎo)共沉淀外，還可水解膽汁鹽產(chǎn)生膽汁酸，阻礙膽固醇微團(tuán)的形成，進(jìn)而抑制小腸對膽固醇的攝取[41]。Huang Ying等[42]研究了嗜酸乳桿菌ATCC 4356對高脂飲食大鼠小腸（包括十二指腸、空腸和回腸3 個部分）中NPC1L1mRNA和蛋白水平的影響，結(jié)果表明，NPC1L1mRNA水平在小腸不同部分有所差異，飼喂菌粉的大鼠十二指腸和空腸中NPC1L1mRNA水平顯著降低，且都在蛋白水平上得到了證實，說明該菌株可通過下調(diào)小腸中十二指腸和空腸區(qū)域的NPC1L1基因表達(dá)來抑制膽固醇的攝取。Yoon等[43]發(fā)現(xiàn)約氏乳桿菌BFE6154可刺激Caco-2細(xì)胞激活肝X受體（liver X receptor，LXR），進(jìn)而下調(diào)NPC1L1基因表達(dá)；隨后采用該菌液對高脂飲食小鼠進(jìn)行灌胃處理，結(jié)果表明，小鼠腸道中NPC1L1基因表達(dá)顯著下調(diào)，抑制了小腸對膽固醇的攝取。Le等[44]在Caco-2細(xì)胞單層中加入植物乳桿菌FB003菌懸液后進(jìn)行孵育，然后采用實時定量PCR測定Caco-2細(xì)胞的NPC1L1mRNA和過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）mRNA水平；同時，向體系中加入用3H標(biāo)記的膽固醇膠束溶液，孵育后收集并裂解Caco-2細(xì)胞，測定其中的放射性，結(jié)果表明Caco-2細(xì)胞NPC1L1mRNA水平顯著降低，PPARαmRNA水平顯著升高，攝取的膽固醇的能力顯著降低，說明該菌株通過上調(diào)PPARα基因表達(dá)來下調(diào)NPC1L1基因表達(dá)，進(jìn)而抑制Caco-2細(xì)胞攝取膽固醇。

2.2.2 抑制膽固醇的合成

HMG-CoA還原酶是膽固醇合成過程的限速酶，研究表明益生菌可下調(diào)HMG-CoA還原酶基因表達(dá)。黃燕燕等[45]用不同劑量的植物乳桿菌DMDL 9010菌液灌胃高脂飲食大鼠，發(fā)現(xiàn)灌胃高劑量菌液可顯著降低大鼠肝組織中HMG-CoA還原酶基因mRNA水平，表明該菌株可能是通過降低HMG-CoA還原酶的活性，從而抑制膽固醇的合成。Lew等[46]將植物乳桿菌DR7培養(yǎng)后離心取上清液，發(fā)現(xiàn)其能夠減少HepG2細(xì)胞蓄積膽固醇，下調(diào)HepG2細(xì)胞HMG-CoA還原酶基因表達(dá)，當(dāng)存在腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）抑制劑時，該菌株的上清液對HepG2細(xì)胞HMGCoA還原酶基因表達(dá)的下調(diào)減弱。此外，該菌株的上清液對HepG2細(xì)胞AMPK基因表達(dá)沒有影響，但促進(jìn)了AMPK磷酸化，說明該菌株的上清液可以通過AMPK途徑降膽固醇，特別是通過AMPK的磷酸化來下調(diào)HMGCoA還原酶基因表達(dá)。Chen Kun等[47]研究了4 種乳桿菌對HepG2細(xì)胞HMG-CoA還原酶的影響，用HMG-CoA還原酶啟動子報告質(zhì)粒和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）結(jié)合位點突變的該質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，質(zhì)粒中含熒光素酶報告基因，轉(zhuǎn)染一段時間后添加菌懸液，轉(zhuǎn)染結(jié)束后收獲并裂解HepG2細(xì)胞，測定熒光素酶活性，熒光素酶報告基因和實時PCR結(jié)果表明，實驗菌株均下調(diào)了HMG-CoA還原酶基因表達(dá)，HMG-CoA還原酶基因中存在NF-κB結(jié)合位點，NF-κB在乳桿菌介導(dǎo)的HMG-CoA還原酶基因調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。

2.2.3 促進(jìn)膽固醇的轉(zhuǎn)化

CYP7A1是膽汁酸合成經(jīng)典途徑中第一步驟的限速酶[48]，研究表明益生菌可上調(diào)CYP7A1基因表達(dá)。Li Chuan等[49]研究了植物乳桿菌NCU116對高脂飲食大鼠脂質(zhì)代謝的降膽固醇作用，首先高脂飲食會導(dǎo)致大鼠肝臟中CYP7A1mRNA水平顯著升高，對高脂飲食大鼠進(jìn)行高劑量菌液灌胃后CYP7A1mRNA水平顯著升高，該菌株可通過上調(diào)CYP7A1基因表達(dá)降膽固醇。Liu Yin等[50]研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食會上調(diào)小鼠法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）和小異源二聚體伴侶受體（small heterodimer partner，SHP）基因表達(dá)、下調(diào)CYP7A1基因表達(dá)，他們采用具有高BSH活性的植物乳桿菌Y15菌液對高脂飲食小鼠進(jìn)行灌胃，結(jié)果表明，小鼠的FXR和SHP基因表達(dá)下調(diào)，CYP7A1基因表達(dá)上調(diào)，并且該菌株將高脂飲食小鼠腸道菌群調(diào)節(jié)至正常飲食結(jié)構(gòu)，提高了乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和擬桿菌屬等具有BSH活性的腸道細(xì)菌的相對豐度，使膽汁鹽產(chǎn)生的膽汁酸增加，這可能進(jìn)一步影響了肝臟FXR-SHP信號通路，上調(diào)了CYP7A1基因表達(dá)，促進(jìn)了膽固醇的轉(zhuǎn)化。Kim等[51]發(fā)現(xiàn)灌胃鼠李糖乳桿菌GG菌液可上調(diào)高脂飲食小鼠CYP7A1基因表達(dá)，下調(diào)FXR、SHP和成纖維細(xì)胞生長因子15（fibroblast growth factor 15，F(xiàn)GF15）基因表達(dá)，說明該菌株是通過抑制肝臟中FGF15和FXR信號通路，從而上調(diào)肝臟中CYP7A1基因表達(dá)來實現(xiàn)降膽固醇作用。

2.2.4 調(diào)節(jié)膽固醇的轉(zhuǎn)運

益生菌主要以2 種方式調(diào)節(jié)膽固醇轉(zhuǎn)運，即通過調(diào)節(jié)脂蛋白轉(zhuǎn)運以及膽汁酸排泄。Yang Lingshuang等[52]研究了屎腸球菌132和副干酪乳桿菌201對高膽固醇血癥大鼠的降膽固醇機制，灌胃兩株菌的高膽固醇血癥大鼠血清LDL膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平顯著降低，糞便總膽汁酸（total bile acid，TBA）水平顯著升高，屎腸球菌132還可以上調(diào)大鼠肝臟LDLR基因表達(dá)，表明該菌株可通過加速LDL轉(zhuǎn)運降低體內(nèi)LDL-C水平。Ghatani等[53]研究了腸球菌降膽固醇方面的益生特性，分別用耐久腸球菌HS03、乳腸球菌YY1菌液和兩種菌液混合液對高脂飲食大鼠進(jìn)行灌胃，發(fā)現(xiàn)菌株干預(yù)處理顯著降低了高脂飲食大鼠血清LDL-C和VLDL膽固醇（very-low-density lipoprotein cholesterol，VLDL-C）水平，顯著提升了大鼠血清HDL膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。另外，益生菌可以通過BSH水解膽汁鹽生成膽汁酸來促進(jìn)膽汁酸排泄，通過體內(nèi)負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用加速膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化[54]。王泳等[55]用瑞士乳桿菌TS206菌液灌胃小鼠，在灌胃后2 周內(nèi)，實驗組小鼠的血清LDL-C水平迅速降低，3 周后恢復(fù)到對照組水平；隨灌胃時間延長，實驗組小鼠糞便中TBA水平呈下降趨勢，而對照組（用等量的生理鹽水灌胃）則相反。灌胃3 周后，實驗組小鼠糞便中TBA水平顯著低于對照組，隨灌胃時間延長差異越顯著。

3 益生菌降膽固醇功效的評價策略

評價益生菌降膽固醇特性的方法主要包括體外實驗、動物實驗和臨床研究，體外實驗和動物實驗可確定益生菌降膽固醇的作用和機制，然后以臨床研究來評估益生菌對人體的降膽固醇功效。通過體外實驗分析膽固醇去除率可實現(xiàn)降膽固醇益生菌的初篩，然后考察初篩菌株菌體細(xì)胞及代謝產(chǎn)物的降膽固醇作用，明確其體外降膽固醇機制并進(jìn)行復(fù)篩，體外細(xì)胞模型可進(jìn)一步確定所篩菌株降低人體膽固醇的潛力。通過動物實驗分析動物血清中膽固醇水平和相關(guān)代謝基因的表達(dá)情況，預(yù)測菌株在體內(nèi)的降膽固醇機制與功效。最后，通過臨床研究確定菌株實際的降膽固醇作用，并考察其對人體是否有潛在的不利影響。

3.1 體外實驗

3.1.1 培養(yǎng)基中膽固醇去除率

益生菌在含膽汁鹽和膽固醇的培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)，以未接種益生菌的含膽汁鹽和膽固醇培養(yǎng)基為對照，其中膽固醇也可用富含膽固醇的食物或動物血清替代[56-57]。培養(yǎng)一定時間后離心取上清液，測定其中的膽固醇含量以計算膽固醇去除率，膽固醇含量常以鄰苯二甲醛比色法和硫酸鐵銨比色法來測定。

3.1.2 菌體細(xì)胞吸收結(jié)合膽固醇

益生菌在含膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時間，以不含膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的益生菌為對照，離心收集菌體細(xì)胞，洗滌、重懸后破碎，離心得上清液，即為胞內(nèi)提取物，將離心得到的沉淀重懸制備細(xì)胞碎片懸浮液，然后測定實驗組和對照組這兩個組分中的膽固醇含量。若實驗組胞內(nèi)提取物中膽固醇含量高于對照組，則表明膽固醇被吸收進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)；若實驗組細(xì)胞碎片懸浮液膽固醇含量高于對照組，則表明膽固醇被結(jié)合在菌體細(xì)胞表面。另外，益生菌在含膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，若胞內(nèi)脂肪酸組成發(fā)生改變，也可以確定膽固醇被吸收進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)。此外，也可采用掃描電子顯微鏡觀察菌體對膽固醇的吸附效果。還可以借助熒光探針法明確菌體細(xì)胞對膽固醇的結(jié)合作用[32]。益生菌在含膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時間，以不含膽固醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的益生菌為對照，培養(yǎng)后取益生菌的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁制成懸液，加入可與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁特定位置結(jié)合的熒光探針，孵育后測定熒光各向異性，若實驗組較對照組熒光各向異性顯著改變，則可確定益生菌將膽固醇摻入菌體細(xì)胞表面。

3.1.3 代謝產(chǎn)物降膽固醇

如上所述，菌株降解膽固醇的代謝產(chǎn)物主要包括BSH和EPS。關(guān)于BSH的檢測方法包括平板法和色譜法，平板法是指在固體培養(yǎng)基中添加氯化鈣和膽汁鹽，倒入平板并凝固后將濾紙片置入其中，將益生菌菌液緩慢加在濾紙片上，待菌液完全吸收后厭氧培養(yǎng)72 h，若濾紙片周圍產(chǎn)生白色沉淀物可確定菌株產(chǎn)生BSH，可通過沉淀物區(qū)的直徑初步評估菌株BSH的活性。薄層色譜法是指將益生菌培養(yǎng)后離心、洗滌、重懸，加入培養(yǎng)基、緩沖液和膽汁鹽，經(jīng)培養(yǎng)后真空蒸發(fā)，用甲醇溶解后離心取上清液，以膽汁酸和膽汁鹽為標(biāo)準(zhǔn)品用薄層色譜進(jìn)行測定，通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較可得出菌株是否具有BSH活性，該法較平板法更靈敏[58]。高效液相色譜法是指將益生菌在含膽汁鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，加入試劑終止BSH活性反應(yīng)，以膽汁鹽為標(biāo)準(zhǔn)品，使用高效液相色譜儀測定培養(yǎng)基中剩余膽汁鹽的含量，通過計算膽汁鹽的去除率評估菌株BSH活性的高低[30]。另外，因BSH水解膽汁鹽可釋放出膽汁酸與氨基酸，所以可通過氨基酸釋放量對BSH活性進(jìn)行定量[59]。關(guān)于EPS的檢測，首先需要提取益生菌EPS，然后加入到膽固醇溶液中，以不含EPS但含膽固醇的溶液為對照，反應(yīng)一定時間后離心取上清液，測定膽固醇含量，并以此確定菌株的EPS是否能夠降膽固醇[60]。

3.1.4 腸、肝細(xì)胞代謝膽固醇

以腸癌細(xì)胞（Caco-2和HT-29細(xì)胞）和肝癌細(xì)胞（HepG2細(xì)胞）為模型，測定益生菌對腸細(xì)胞攝取膽固醇、肝細(xì)胞蓄積膽固醇以及兩類細(xì)胞膽固醇代謝基因表達(dá)的影響。將益生菌懸液加入腸癌細(xì)胞中并孵育，洗滌腸癌細(xì)胞后加入膽固醇膠束，孵育后收集上清液和腸癌細(xì)胞，測定上清液或腸癌細(xì)胞中膽固醇含量，確定益生菌對腸細(xì)胞攝取膽固醇的影響；通過mRNA和蛋白分析研究腸癌細(xì)胞中膽固醇代謝基因（三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白G5/8基因和LXR基因等）的表達(dá)，明確益生菌對腸細(xì)胞膽固醇代謝基因表達(dá)的影響[61-62]。制備膽固醇積累的肝癌細(xì)胞模型，將菌懸液加入到該細(xì)胞模型中，測定細(xì)胞模型胞內(nèi)膽固醇含量和膽固醇代謝基因（HMG-CoA還原酶、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c、乙酰輔酶A羧化酶、脂肪酸合成酶基因以及AMPK、PPARα、FXR、SHP、CYP7A1、LXR和LDLR基因等）的表達(dá)情況，明確益生菌對肝細(xì)胞蓄積膽固醇和膽固醇代謝基因表達(dá)的影響[63]。

3.2 動物實驗

動物實驗常用小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠和豬作為模型，因為它們在膽固醇代謝方面與人類相似[64]。用益生菌菌液灌胃或菌粉飼喂高脂飲食動物，同時用菌液或菌粉的載體灌胃或飼喂的普通飲食和高脂飲食動物為陰性對照，以及采用降脂調(diào)脂藥物灌胃或飼喂的高脂飲食動物作陽性對照，飼喂一段時間后測定實驗動物的血脂水平（血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、TG、LDL-C和HDL-C水平）及肝臟和小腸膽固醇代謝基因的表達(dá)[65-66]。

3.3 臨床研究

讓受試者服用益生菌并于一段時間后測定受試者的血脂水平，比較受試者不同時期的血脂水平，或者以未服用益生菌受試者為對照，除可確定益生菌對人體是否有降膽固醇功效，還可以得出益生菌降人體膽固醇的有效劑量。Ryan等[67]研究了高膽固醇血癥患者服用布氏酵母CNCM I-1079膠囊8 周過程中（服用前、服用4 周和8 周）血樣相關(guān)指標(biāo)，包括血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C和脂蛋白顆粒水平，與服用前相比，服用該膠囊8 周僅殘余脂蛋白顆粒水平顯著降低，表明服用該菌株可降低殘余脂蛋白。Mo等[68]選取PubMed、Embase和Cochrane數(shù)據(jù)庫中共19 項臨床試驗，探究益生菌對高膽固醇血癥患者的降膽固醇作用，并分析了幾種因素對益生菌降膽固醇效果的影響，包括高膽固醇血癥患者的初始TC水平和年齡，以及益生菌干預(yù)持續(xù)時間、菌株和服用形式。結(jié)果表明，益生菌可顯著降低高膽固醇血癥患者血清中TC和LDL-C水平，對輕度和年輕的患者降低TC和LDL-C水平的效果更好，益生菌長期干預(yù)的患者較短期干預(yù)的患者TC和LDL-C水平下降幅度更大，植物乳桿菌可顯著降低TC和LDL-C水平。

4 結(jié) 語

益生菌的降膽固醇能力因菌株而有所差異，了解益生菌的降膽固醇機制及其評價策略有助于開發(fā)有高效降膽固醇作用的益生菌菌株，并為高膽固醇誘發(fā)相關(guān)疾病的防治提供新的思路。隨著人們健康意識的提升以及對益生菌研究的不斷深入，降膽固醇益生菌的開發(fā)及應(yīng)用具有廣闊的前景，例如降膽固醇的功能食品以及生物活性藥物，但在菌株開發(fā)與應(yīng)用過程中仍存在一些問題有待解決：1）益生菌降膽固醇雖被廣泛研究，但降膽固醇機制尚未被完全闡明，此外，多機制協(xié)同降膽固醇有待進(jìn)一步研究；2）益生菌在體外和動物實驗中有降膽固醇作用，而將其應(yīng)用于人體卻不一定發(fā)揮同樣的功效；3）多數(shù)研究僅證明了益生菌有降膽固醇作用，但未對益生菌的使用劑量與使用期限加以研究，也并未對菌株的安全性進(jìn)行準(zhǔn)確全面的評估，益生菌的安全性評估也尚無明確的規(guī)定。因此，通過進(jìn)一步的研究完善益生菌降膽固醇機制，并以目前得出的益生菌降膽固醇機制為基礎(chǔ)，研究益生菌多機制協(xié)同降膽固醇是趨勢之一。此外，仍需更多的臨床研究進(jìn)一步揭示益生菌降低人體膽固醇機制，確定益生菌降膽固醇有效劑量與使用期限，以及測試任何潛在的對人體不利的影響。