紫薯花青素通過調節(jié)p53-p21Waf1/Cip1信號通路對輻射致造血干/祖細胞衰老的保護作用

陳彩云，王若宇，張家樂，張怡明，石塔拉，宓 偉,*

（1.濱州醫(yī)學院公共衛(wèi)生與管理學院，山東 煙臺 264003；2.濱州醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院，山東 煙臺 264003）

據(jù)第7次全國人口普查結果顯示，截至2021年5月我國60 歲以上的老年人口已達到2.64 億，占總人口比重的18.7%，人口老齡化進一步加劇，探尋延緩衰老的天然植物藥已成為研究者關注的熱點[1]。造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）是更新能力強并能分化為各系造血祖細胞（hematopoietic progenitor cell，HPC）的原始造血細胞，HSC衰老與機體衰老以及老年人多種慢性病密切相關[2-4]。在電離輻射等應激狀態(tài)下，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在細胞內產(chǎn)生量增多，可能通過激活p53-p21Waf1/Cip1通路、Wnt/β-catenin通路、p38-AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）通路、p16-Rb通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase/mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）通路等多條信號通路，導致HSC的DNA損傷，阻礙正常細胞周期而使細胞阻滯于G1期，導致細胞衰老，但具體的分子機制仍不明確[5-9]。

紫薯富含鋅、硒等微量元素和花青素類成分[10]。紫薯花青素（Solanum tuberosumanthocyanin，STA）是一種具有C6-C3-C6結構的類黃酮化合物，可以作為原料生產(chǎn)食品的著色劑，亦是一種強效抗氧化劑，具有抗腫瘤、抗輻射、抗衰老、降血脂等多種藥用功能[11-14]。STA與其他來源花青素相比，耐熱性好、穩(wěn)定性強、機體利用率高，在食品、藥品、保健品和化妝品等領域更具有開發(fā)價值。研究顯示，輻射造成HSC的DNA損傷后，共濟失調毛細血管擴張突變（ataxia telangiectasia mutated，ATM）和ATM與Rad3相關（ATM and Rad3 related，ATR）激酶會被激活并聚集于DNA損傷部位，使H2A組蛋白變異體（H2AX）磷酸化從而激活p53，活化的p53通過抑制p21的表達、下調細胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2），阻滯細胞周期在G1期，造成HSC衰老，導致機體細胞衰老加速[15-16]。本實驗旨在探討STA對輻射致造血干/祖細胞衰老保護作用的分子機制，為探尋延緩HSC衰老和機體衰老的天然植物藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級C57BL/6小鼠，雄性，6～8 周齡，體質量24～28 g，由濱州醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2020-0012。在無特定病原體的條件下常規(guī)喂養(yǎng)小鼠，適應性喂養(yǎng)1 周后用于實驗。本研究得到濱州醫(yī)學院動物倫理學委員會的批準，批準號為SCK（魯）2021-0018。

STA（聚合度≥99%） 杭州綠盛生物技術有限公司；伊思柯夫改良培基（Iscove’s modified Dubecco’s medium，IMDM）、馬血清（horse serum，HS）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 武漢普諾賽生命科技有限公司；TRIzol、SYBR Green I染料 日本TaKaRa公司；實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）試劑、PCR引物美國Invitrogen公司；Anti-Sca-1＋Micro Bead Kit美國Miltenyi公司；衰老相關β-半乳糖苷酶（senescenceassociatedβ-galactosidase，SA-β-Gal）染色試劑盒美國Cell Signaling公司；重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor，rhGM-CSF）、重組人促紅細胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO） 上海普欣生物技術有限公司；Ficoll分離液、蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescene，ECL）試劑盒 北京普利萊基因科技有限公司；MiniMACS磁珠分選系統(tǒng) 德國Miltenyi Biotech公司；小鼠干細胞集落形成混合培養(yǎng)基 美國Stem Cell公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、p53、p21Waf1/Cip1一抗、二抗IgG 英國Abcam公司；總RNA提取試劑盒、SYBR green試劑盒 上海翌圣生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

qPCR儀 澳大利亞Corbett公司；HB-7021血細胞分析儀 日本優(yōu)瑞特公司；FACSCalibur流式細胞儀美國Becton Dickinson公司；凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Alpha Innotech公司；倒置顯微鏡、BX-26熒光顯微鏡日本Olympus公司；直線加速器 英國飛利浦公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組和給藥

C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組、STA治療組和STA預防組，每組30 只。模型組和STA治療組小鼠用直線加速器全身一次性照射X射線，照射劑量57.28 cGy/min，照射總劑量6.5 Gy，距離為75 cm，照射面積為20 cm×20 cm[17]。STA治療組照射后皮內注射STA 60 mg/（kgmb·d），連續(xù)給藥7 d，模型組于照射后皮內注射等劑量生理鹽水連續(xù)7 d。STA預防組于照射前皮內注射STA 60 mg/（kgmb·d），連續(xù)給藥7 d，照射后繼續(xù)利用STA等劑量皮內注射7 d，對照組處理同模型組，但不進行照射。

1.3.2 血液指標測定

給藥結束后，各組小鼠取眼球血，用血細胞分析儀檢測外周血中紅細胞（red blood cell，RBC）、白細胞（white blood cell，WBC）和血小板（platelet，PLT）的數(shù)量。

1.3.3 SA-β-Gal染色實驗

參照免疫磁性分選法[18]分離純化各組小鼠Sca-1＋HSC/HPC，按照SA-β-Gal染色試劑盒說明書對各組小鼠Sca-1＋HSC/HPC進行染色，倒置顯微鏡下選擇6 個視野，以觀察400 個細胞為標準，計算陽性細胞百分率。

1.3.4 造血干/祖細胞混合集落數(shù)的檢測

收集各組小鼠Sca-1＋HSC/HPC，依次加入1×10－4mol/L的2-巰基乙醇，2.7 g/100 mL甲基纖維素，HS、rhGM-CSF、rhEPO各5 mL，共2 mL，充分混勻后接種于96 孔板，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，顯微鏡下放大200 倍觀察造血干/祖細胞混合集落（colony forming unit-mixture，CFU-Mix）數(shù)，并以此評價各組細胞形成造血祖細胞集落能力[19]。

1.3.5 流式細胞術分析細胞周期

用體積分數(shù)70%冰乙醇溶液將收集的各組小鼠Sca-1＋HSC/HPC固定過夜，加入100 μL 60 U/mg牛胰核糖核酸酶溶液，37 ℃孵育30 min，碘化丙啶染色30 min，流式細胞術檢測各組細胞周期情況。

1.3.6 qPCR檢測p53和p21Waf1/Cip1mRNA的表達量

收集各組Sca-1＋HSC/HPC，用TRIzol裂解液提取各組細胞總RNA，將其反轉錄為cDNA，反轉錄條件：42 ℃ 30 min、99 ℃ 5 min、5 ℃ 5 min。以反轉錄的cDNA為模板，擴增p53和p21Waf1/Cip1，以GAPDH為內參。擴增條件：94 ℃ 4 min、94 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)。通過熔解曲線分析產(chǎn)物的特異性，Quantity One軟件分析基因條帶光密度值并計算與內參的比值，以此作為基因表達量。自行設計的引物序列見表1。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.7 Western blot檢測p53和p21Waf1/Cip1蛋白的表達

收集各組Sca-1＋HSC/HPC，用BCA法檢測RIPA裂解液提取的蛋白濃度。在提取蛋白液中加入質量分數(shù)6%蛋白上樣緩沖液，沸水變性5 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后濕移至聚偏二氟乙烯膜上，37 ℃封閉2 h，依次加入p53和p21Waf1/Cip1一抗4 ℃過夜，漂洗后加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫反應2 h，滴加ECL發(fā)光試劑進行檢測，凝膠成像曝光后觀察比較。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，結果用平均值±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析，有統(tǒng)計學意義的再采用兩兩比較的q檢驗，檢驗水平為α＝0.05。

2 結果與分析

2.1 STA對輻射小鼠外周血的影響

由表2可知，模型組小鼠于外周血RBC、WBC、PLT數(shù)均極顯著低于對照組（P＜0.01）；與模型組相比，STA治療組和預防組小鼠外周血RBC、WBC、PLT數(shù)顯著或極顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），且STA預防組小鼠外周血各指標恢復好于效果STA治療組，表現(xiàn)為以上指標顯著高于SAT治療組（P＜0.05），且更接近對照組。

表2 STA對輻射小鼠外周血象的影響（n＝6）Table 2 Effect of STA on peripheral hemogram of radiated mice (n = 6)

2.2 各組小鼠Sca-1＋ HSC/HPC SA-β-Gal染色陽性率結果

由圖1可知，SA-β-Gal染色液染色后，小鼠Sca-1＋HSC/HPC的衰老細胞胞質內見藍色顆粒則呈陽性，細胞呈空泡狀為陰性。模型組細胞陽性率極顯著高于對照組（P＜0.01），與模型組比較，STA預防組細胞陽性率顯著降低（P＜0.05），且STA預防組細胞陽性率低于STA治療組（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠Sca-1＋ HSC/HPC SA-β-Gal染色結果（n＝6）Fig. 1 SA-β-Gal staining of Sca-1+ HSC/HPC in mice from each group (n = 6)

2.3 STA對小鼠Sca-1＋ HSC/HPC形成CFU-Mix能力的影響

由圖2可知，模型組Sca-1＋HSC/HPC形成的CFU-Mix數(shù)與對照組相比極顯著減少（P＜0.01）。與模型組比較，STA治療組和STA預防組形成的CFU-Mix數(shù)分別顯著和極顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），且STA預防組形成的CFU-Mix數(shù)顯著高于STA治療組（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠Sca-1＋ HSC/HPC形成的CFU-Mix數(shù)（n＝6）Fig. 2 Number of CFU-Mix of Sca-1+ HSC/HPC in mice from each group (n = 6)

2.4 STA對小鼠Sca-1＋ HSC/HPC的細胞周期分布的影響

由表3可知，與對照組相比，模型組G0/G1期細胞比例極顯著增高，G2/M和S期比例極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，STA治療組和STA預防組G0/G1期細胞比例分別顯著和極顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），G2/M和S期比例分別顯著和極顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），且STA預防組與STA治療組相比各細胞周期分布亦有顯著差異（P＜0.05）。

表3 STA對Sca-1＋ HSC/HPC細胞周期分布的影響（n＝6）Table 3 Effect of STA on cell cycle distribution of Sca-1+ HSC/HPC (n = 6)%

2.5 STA對小鼠Sca-1＋ HSC/HPC的p53和p21Waf1/Cip1mRNA表達的影響

由圖3可知，模型組p53和p21Waf1/Cip1mRNA的相對表達量極顯著高于對照組（P＜0.01），與模型組相比，STA治療組和STA預防組的p53和p21Waf1/Cip1mRNA的相對表達量分別顯著和極顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），且STA預防組顯著低于STA治療組（P＜0.05）。

圖3 STA對小鼠Sca-1＋ HSC/HPC p53、p21Waf1/Cip1 mRNA表達的影響（n＝6）Fig. 3 Effect of STA on mRNA expression of p53 and p21Waf1/Cip1 in Sca-1+ HSC/HPC in mice (n = 6)

2.6 STA對小鼠Sca-1＋ HSC/HPC的p53和p21Waf1/Cip1蛋白表達的影響

由圖4可知，模型組p53和p21Waf1/Cip1蛋白的相對表達量極顯著高于對照組（P＜0.01），與模型組相比，STA治療組和STA預防組p53和p21Waf1/Cip1蛋白的相對表達量分別顯著和極顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），且STA預防組顯著低于STA治療組（P＜0.05）。

3 討 論

在臨床放射治療的過程中輻射損傷可導致機體組織和器官損傷，尤其對造血干細胞的破壞最為嚴重，可抑制HSC的增殖并誘導機體衰老速度加快[20]。尋找通過經(jīng)典信號通路抑制HSC衰老的天然植物靶向藥從而延緩細胞衰老和機體衰老具有非常重要的臨床意義[21-23]。本研究采用輻射導致小鼠Sca-1＋HSC/HPC衰老模型來研究STA的體外抗衰老作用，結果表明STA對Sca-1＋HSC/HPC的衰老有明顯的治療和預防效果，并且STA預防Sca-1＋HSC/HPC衰老的效果更明顯。

影響細胞衰老的環(huán)境因素通過基因調控使細胞周期停滯是細胞衰老的機制之一，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，STA是紫薯具有延緩衰老功能的植物活性成分，能延長老年大鼠生存時間[24-27]。本實驗研究表明，模型組小鼠于輻照后外周血RBC、WBC、PLT數(shù)均極顯著降低（P＜0.01），輻射后小鼠的造血能力明顯下降，利用SA-β-Gal試劑盒染色后小鼠Sca-1＋HSC/HPC中的衰老細胞胞質內見藍色顆粒，衰老細胞數(shù)極顯著增多（P＜0.01），衰老導致HSC/HPC分化潛能受損，因此形成的CFU-Mix數(shù)極顯著下降（P＜0.01）。由于輻射導致衰老的HSC/HPC基因合成能力下降使其細胞分化停滯在G0/G1期不能進入S期，而STA可提升輻射后小鼠Sca-1＋HSC/HPC分化增殖能力，降低輻射導致的HSC/HPC衰老作用。在細胞衰老的調控網(wǎng)絡中，p53-p21Waf1/Cip1分子信號通路是HSC衰老的關鍵路徑，p53基因是一種細胞生長周期中的負調控因子，可使細胞周期停滯在G1期而不進入S期[28-32]。HSC/HPC受到輻射損傷后，其ROS產(chǎn)生量增加，模型組p53和p21Waf1/Cip1mRNA和蛋白的相對表達量極顯著高于對照組（P＜0.01），說明輻射損傷可通過上調p53-p21Waf1/Cip1信號通路導致造血干/祖細胞衰老加速。STA除了發(fā)揮抗氧化作用，還會抑制ATR激酶聚集于DNA的損傷部位，避免損傷部位的組蛋白變異體磷酸化，從而抑制p53和p21Waf1/Cip1的表達，促進Sca-1＋HSC/HPC細胞周期由G1期進入S期，保護造血干細胞的正常生理功能。

本實驗利用輻照X射線制備小鼠衰老細胞模型，通過血液指標檢測、SA-β-Gal染色、CFU-Mix檢測、流式細胞術分析細胞周期、qPCR檢測mRNA表達和Western blot檢測蛋白表達，進一步分析STA治療和預防輻射致造血干/祖細胞衰老的保護機制，結果表明STA可以通過下調p53-p21Waf1/Cip1信號通路保護受到輻射的HSC/HPC，且預防效果優(yōu)于治療效果，本研究可為利用食品活性成分干預HSC衰老提供一定的思路。