超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃液乳化性質(zhì)及蛋黃蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

馬 婕，楊曉雪，遲玉杰,*，遲 媛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

蛋黃因其較高的營養(yǎng)價值、濃郁的感官風(fēng)味和良好的乳化特性而廣泛應(yīng)用于蛋黃醬、沙拉醬和焙烤食品等的制作。蛋黃在食品中主要的功能特性是乳化性質(zhì)，通過將油和水融合，形成完全分散的乳濁液，有助于提高食品的口感、掩蓋不良風(fēng)味[1]。蛋黃常用于制作油酥性面團(tuán)、蛋糕面糊、蛋撻等焙烤食品，可以使各種脂溶性成分與水更好地結(jié)合，使其口感更加柔軟，因此改善蛋黃乳化性質(zhì)可以擴(kuò)大其在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。提高蛋黃乳化性質(zhì)可以改善其作為天然乳化劑的品質(zhì)，減少食品工業(yè)對人工合成乳化劑的依賴。因此，為研究具有良好乳化性質(zhì)的蛋液并在實際生產(chǎn)中應(yīng)用，本研究通過超聲協(xié)同殼聚糖處理的手段提升蛋黃的乳化性質(zhì)，并研究其乳化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)特性之間的關(guān)系。

殼聚糖由N-乙酰葡萄糖胺通過β-1,4-糖苷鍵連接而成，由甲殼素經(jīng)過脫乙酰作用得到，是一種綠色安全的可再生資源，甲殼素脫去55%以上的N-乙?；鶗r就可被稱為殼聚糖[2]。殼聚糖與蛋白質(zhì)的非共價聚合可以改善乳液的乳化性質(zhì)，使得蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物具有優(yōu)于單一蛋白質(zhì)的特性[3]。Schulz等[4]的研究表明殼聚糖能夠穩(wěn)定水-油-水型多重乳液，其親水親油平衡值大約為36.7，親水性較強。Torrico等[5]發(fā)現(xiàn)殼聚糖對蛋黃內(nèi)部品質(zhì)不僅有保鮮作用，還可以起到乳化劑的效果，即殼聚糖可有效改善蛋黃的乳化性質(zhì)。Zhang Lijuan等[6]基于靜電相互作用，開發(fā)了鱈魚蛋白/殼聚糖復(fù)合顆粒，顯著提高了其乳液穩(wěn)定性，并改善了乳液的黏彈性和觸變性。

超聲處理是一種公認(rèn)的綠色無公害食品加工技術(shù)，其應(yīng)用成本低，超聲處理下蛋黃顆粒的理化性質(zhì)及微觀結(jié)構(gòu)都會發(fā)生一定變化[7]。超聲處理可用于改善蛋白質(zhì)的特性，如起泡性、凝膠性和乳化性質(zhì)等[7-9]。蛋黃中含有豐富的低密度脂蛋白，它提供了主要的乳化活性[10]。杜清普等[11]的研究表明超聲處理后冰蛋黃的乳化活性提高了7.54%。Li Qiqi等[12]發(fā)現(xiàn)超聲處理導(dǎo)致蛋黃顆粒粒徑減小，而表面疏水性增大；畢雅雯等[13]發(fā)現(xiàn)150 W超聲處理后蛋黃液乳化性質(zhì)得到改善，粒徑及乳析指數(shù)顯著降低。因此利用超聲處理蛋黃液，通過改變其蛋白結(jié)構(gòu)而改善其乳化性質(zhì)的方法是可行的。

目前，超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃乳化性質(zhì)的影響及其與蛋白結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系鮮有報道，故本研究在單一條件改性的基礎(chǔ)上，采用超聲協(xié)同殼聚糖處理雞蛋黃，以期為改善蛋黃的乳化性質(zhì)提供依據(jù)，并為進(jìn)一步將其應(yīng)用于生產(chǎn)實踐提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮A級雞蛋（平均質(zhì)量為45～55 g）由黑龍江省哈爾濱市雙城區(qū)某農(nóng)場生產(chǎn)；大豆油 哈爾濱九三油脂有限責(zé)任公司；殼聚糖（脫乙酰度80%～95%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；4×天然聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）上樣緩沖液、考馬斯亮藍(lán)G-250 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲破碎儀 美國Sonics公司；JJ-1精密定時電動攪拌器 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；T18型高速勻漿機(jī) 德國IKA公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BX53型科研級正置顯微成像系統(tǒng) 日本奧林巴斯公司；S-3400N型鎢燈絲掃描電子顯微鏡、F-7100型熒光分光光度計 日本日立公司；HAAKE MARS40流變儀、Nicolet IS50型傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾公司；Mastersizer 2000型激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；*Theta型視頻光學(xué)角 瑞典百歐林公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋黃液樣品的制備

手工破碎新鮮的雞蛋，使用分蛋器將蛋黃與蛋清分離，將鮮蛋黃（fresh egg yolk，F(xiàn)EY）慢慢攪拌以備后續(xù)使用。向蛋黃液中加入1.5 g/mL的殼聚糖充分?jǐn)嚢? h至殼聚糖完全溶解于蛋黃液中，置于冰水混合物中降溫，使用200 W的功率對樣品進(jìn)行共10 min（開啟3 s、停止 2 s）的間歇超聲處理，制成超聲協(xié)同殼聚糖蛋黃（ultrasonic chitosan egg yolk，UCEY）。對照組樣品包括：1）加殼聚糖蛋黃（chitosan egg yolk，CEY），即向FEY中加入終質(zhì)量濃度1.5 g/mL殼聚糖并且充分?jǐn)嚢? h的蛋黃；2）加熱蛋黃（heated egg yolk，HEY），即FEY經(jīng)過54 ℃加熱處理的蛋黃；3）加殼聚糖加熱蛋黃（chitosan heated egg yolk，CHEY），即FEY加入終質(zhì)量濃度1.5 g/mL殼聚糖后，54 ℃加熱處理的蛋黃；4）超聲蛋黃（ultrasonic egg yolk，UEY），即對FEY進(jìn)行200 W間歇超聲處理10 min（開啟3 s、停止2 s）的蛋黃。用超聲儀器自帶的測溫裝置多次檢測顯示超聲探頭中心部位的蛋黃溫度為（54±2）℃。這可能是由于蛋黃液黏稠，冰塊的溫度無法傳遞到超聲中心，難以使探頭周圍的蛋黃液降溫。蛋黃屬于熱敏性物質(zhì)，超聲中心的脂蛋白受熱變性聚集可使其加熱后黏度增大甚至凝固，為避免溫度對結(jié)果的影響，本研究設(shè)置54 ℃加熱的對照組HEY。

1.3.2 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定

乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定參考Tang Chuanhe等[14]的方法并稍作改動。用蒸餾水將蛋黃液稀釋為蛋白質(zhì)量濃度0.01 g/mL的溶液，將20 mL溶液與5 mL大豆油用高速勻漿機(jī)以10 000 r/min均質(zhì)1 min，獲得乳液。在均質(zhì)后0 min與5 min時，分別從底部吸取400 μL清液，采用40 mL 0.1 g/mL的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液稀釋，以相同質(zhì)量濃度的SDS溶液作為空白對照，在500 nm波長處測定乳液的吸光度，每個樣品平行測定3 次。分別按照公式（1）、（2）計算乳化活性指數(shù)（emulsification activity index，EAI）與乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsification stability index，ESI）。

式中：T＝2.303，為ln 1的近似值；N為稀釋倍數(shù)；ρ為乳化前溶液中蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為油相體積分?jǐn)?shù)/%；A0為0 min時的吸光度；A5為5 min時的吸光度；Δt為時間差（5 min）。

1.3.3 乳液粒徑的測定

采用Zhao Wenfei等[15]的方法，用蒸餾水將1 g蛋黃稀釋20 倍質(zhì)量，磁力攪拌至完全溶解，加入5 mL大豆油，在12 000～13 000 r/min的轉(zhuǎn)速下均質(zhì)1 min，以獲得乳液；吸取80 μL乳液分散至40 mL蒸餾水中，測定其粒徑分布。參數(shù)設(shè)置如下：樣品折射率1.46，水折射率1.33。

1.3.4 乳液微觀結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡觀察

采用Hu Chun等[16]的方法觀察乳液微觀結(jié)構(gòu)，將10 μL 1.3.2節(jié)中新鮮乳液置于載玻片上，用蓋玻片覆蓋，平衡2 min后采用科研級正置顯微成像系統(tǒng)放大50 倍后觀察并拍攝照片。

1.3.5 蛋黃表面形貌的掃描電子顯微鏡觀察

參考Tian Xiaolu等[3]的方法并稍作修改，取少許蛋黃凍干樣品固定在鋁樣品臺上，噴金200 s。在掃描電子顯微鏡下放大200 倍觀察不同蛋黃的表面形貌并拍攝照片。

1.3.6 流變學(xué)性質(zhì)的測定

參考Zhao Wenfei等[15]的方法測定蛋黃液的流變特性。選擇平行板直徑為35 mm。25 ℃下在0.1～10 Hz的頻率范圍內(nèi)進(jìn)行動態(tài)振蕩頻率掃描，固定應(yīng)變值為0.5%，板間隙為0.3 mm。設(shè)定剪切速率范圍為0.1～100 s－1，在25 ℃下測定樣品的表觀黏度。

1.3.7 界面張力的測定

參照Aris等[17]的方法測定1.3.2節(jié)中乳液在油-水界面上的界面張力。將連接在毛細(xì)管上的不銹鋼針插入裝滿大豆油的玻璃比色皿中，從針尖滴入5 μL液滴到大豆油中，持續(xù)1 h檢測界面張力的變化情況，每個數(shù)據(jù)點的時間間隔為0.5 s。之后基于液滴形狀分析，根據(jù)楊-拉普拉斯方程計算界面張力，每個樣品測定3 次取平均值。

1.3.8 SDS-PAGE測定

根據(jù)Qing Mingmin等[18]的方法，使用12%分離膠和3%濃縮膠，將蛋黃液稀釋為蛋白質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液。將樣品和上樣緩沖液（含有β-巰基乙醇）以體積比1∶1混合后在沸水浴中反應(yīng)5 min，上樣樣品含20 μg蛋白質(zhì)。使用實驗室凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像信息。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜測定

蛋黃樣品凍干后將凍干樣品切成薄片，并使用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀記錄4 000～400 cm－1范圍內(nèi)的光譜。掃描分辨率為4 cm－1，使用PeakFit v4.12軟件進(jìn)行積分，以獲得次級導(dǎo)數(shù)譜的峰面積。通過酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1）吸收峰的高斯反卷積獲得每個二級結(jié)構(gòu)的相對含量。

1.3.10 熒光光譜及疏水性測定

將不同方法處理的蛋黃液用pH值為8.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋為0.1 mg/mL，按如下參數(shù)測定樣品在最大發(fā)射波長下的熒光強度：激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為300～420 nm，狹縫寬度為2.5 nm，掃描間隔為1 nm，掃描速率為1 200 nm/min。以相對熒光強度為縱坐標(biāo)、蛋白質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)作圖，以其斜率表示樣品的表面疏水性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本研究所得數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)測定的平均值，使用SPSS軟件（版本26.0）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用單因素方差分析法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 2022軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合和繪圖。采用PeakFit v4.12軟件進(jìn)行多峰擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃乳液乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響

與對照組FEY（EAI為（10.98±0.15）m2/g，ESI為（6.65±0.21）min）相比，CHEY、UEY和UCEY的乳化活性分別顯著升高了21.77%、18.49%和29.51%（P＜0.05），乳化穩(wěn)定性分別顯著升高了6.48%、6.66%和9.47%（P＜0.05）（圖1）。

圖1 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃乳液乳化活性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig. 1 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on emulsifying activity and emulsion stability of egg yolk emulsion

超聲協(xié)同殼聚糖處理后蛋黃液會逐漸變得黏稠，其黏度的升高提示蛋黃液內(nèi)部蛋白形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，液滴之間存在較大的靜電斥力，因此不易聚集，從而使其乳化活性及乳化穩(wěn)定性升高，這可能是由于蛋白質(zhì)分子之間的相互作用增強所導(dǎo)致的。根據(jù)Xie Yunxiao等[19]的研究結(jié)果，超聲處理可能會增加蛋白質(zhì)之間的相互作用以及蛋白質(zhì)的水合作用，導(dǎo)致其更緊密地連接。EAI的改善可能歸因于分子柔韌性的提高，其得益于均勻的顆粒分布，說明適度的超聲及殼聚糖處理可以改善蛋黃的乳化性質(zhì)[20-21]。油-水乳化體系的特性受蛋白濃度、添加油的體積分?jǐn)?shù)、攪拌速度及攪拌時間等因素影響[22]。對于乳化穩(wěn)定性，攪拌速度的影響最為顯著。本實驗中各處理組的均質(zhì)時間均為1 min，因此CEY、CHEY、UEY和UCEY的ESI差異不顯著（P＞0.05）。與上述4 組相比，HEY的ESI顯著較低，這可能是由于溫度的提高使部分脂蛋白變性聚集，蛋白質(zhì)分子柔韌性減弱，其在油-水界面的穩(wěn)定性降低，從而引起ESI降低。

2.2 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃乳液粒徑的影響

蛋黃乳液樣品的粒徑為微米級，可通過動態(tài)光散射技術(shù)測定蛋黃樣品顆粒聚集體的粒徑變化，從而反映超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃中脂蛋白聚集程度的影響[23]。除HEY，所有處理組的粒徑圖像相較于未超聲樣品都向左移動，CHEY、UEY和UCEY的平均粒徑分別為104.70、104.68 μm和62.23 μm，其中UCEY的粒徑減小最明顯，與FEY相比減小了50.01%（圖2）。

圖2 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃乳液粒徑的影響Fig. 2 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on particle size of egg yolk emulsion

超聲協(xié)同殼聚糖處理對乳液粒徑的影響與圖1中EAI的測定結(jié)果相印證，較小的粒徑說明液滴較分散，這可能是由于超聲處理使蛋白質(zhì)分散，使得乳液由緊密的聚集體變得分散，從而使具有疏水性的官能團(tuán)快速遷移到油-水界面并穩(wěn)定乳液，200 W超聲處理引起的空化效應(yīng)產(chǎn)生了高剪切能量和湍流，為蛋白質(zhì)分子的碰撞和解離提供了足夠的能量。蛋白質(zhì)分子由于分子間相互作用被破壞及化學(xué)鍵被解離形成小分子，從而使蛋白質(zhì)粒徑減小，表面積增大，蛋白質(zhì)與油相吸附的可能性增大，乳化性質(zhì)得到改善。CEY中殼聚糖的加入使帶正電的殼聚糖通過靜電相互作用移動到帶負(fù)電荷的乳液層，其與蛋黃蛋白的復(fù)合提供了較大的空間阻力，使乳液粒徑減小。

2.3 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃乳液界面張力的影響

油-水界面被認(rèn)為是厚度無限小的平面，但是界面區(qū)域/膜本質(zhì)上是動態(tài)的，例如在一個區(qū)域內(nèi)有水-水（氫鍵）、油-油（范德華力）和水-油（疏水效應(yīng)，其中水分子遠(yuǎn)離非極性甘油三酯以盡量減少與其接觸）3 種分子間相互作用力。本研究中超聲處理時，蛋黃的界面張力在一定時間內(nèi)明顯下降，之后隨時間的延長變化趨于平緩，在達(dá)到峰值時UCEY的界面張力較FEY降低了16.67%（圖3）。

圖3 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃乳液界面張力的影響Fig. 3 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on interfacial tension of egg yolk emulsion

FEY、CEY和HEY的界面張力曲線在超聲處理的前200 s較陡，而超聲協(xié)同殼聚糖處理不僅可以降低界面張力，與其他實驗組相比，UCEY的界面張力曲線更加平滑，且更快達(dá)到平衡狀態(tài)，說明其具有較高的吸附速率、較平衡的表面張力及較低的膨脹表面模量。CEY界面張力的降低可能是由于殼聚糖與脂蛋白經(jīng)過靜電相互作用復(fù)合后，提高了復(fù)合顆粒的疏水性。超聲處理200 s后CEY、UEY與UCEY的界面張力曲線有相似的變化趨勢，且平滑程度相當(dāng)，但UCEY的初始界面張力更低，說明超聲與殼聚糖處理對界面張力的降低存在著一定程度的協(xié)同作用。超聲協(xié)同殼聚糖處理可以抑制蛋黃蛋白的相互聚集，有利于蛋白顆粒更快地移動到油-水界面，形成強而致密的吸附層，導(dǎo)致界面張力降低，通過防止油滴的聚集和絮凝提高體系穩(wěn)定性。

2.4 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響

顯微圖片可以直觀地顯示出乳液的分散特性，本研究觀察了放大50 倍后的蛋黃乳液液滴。未經(jīng)過處理的蛋黃乳液液滴不均勻地分散，且大小不一，較為密集地聚集在一起；HEY乳液液滴明顯增大，且出現(xiàn)更加明顯的聚集和絮凝；CHEY乳液液滴粒徑相對較小，粒徑分布更為均一；而UCEY乳液液滴更加細(xì)小，最為均一地分布于視野之中（圖4）。

圖4 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 4 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on microstructure of egg yolk emulsion

UCEY中包裹油滴的界面蛋白之間會產(chǎn)生較強的空間阻力，使油滴形成規(guī)則的球形，并同時伴隨著乳液穩(wěn)定性的上升。這可能是由于超聲及殼聚糖處理改變了卵黃顆粒的聚集形態(tài)和蛋白質(zhì)的構(gòu)象，使其微觀結(jié)構(gòu)更加緊密細(xì)致，分子間作用力增大，抑制液滴顆粒的聚集，從而使絮凝現(xiàn)象減少，表明超聲及殼聚糖協(xié)同處理有助于油滴的均勻分布。多糖中的親水基團(tuán)可以阻止由于靜電排斥缺乏而引起的聚合現(xiàn)象。顯微圖片觀察到CEY的乳液微粒較FEY略大，邊緣顏色較深，液滴壁較厚，表明帶正電的殼聚糖通過靜電相互作用形成復(fù)合顆粒，從而形成較厚的膜，或是存在未反應(yīng)完全的殼聚糖顆粒。

2.5 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃聚集程度的影響

本研究用掃描電子顯微鏡放大200 倍觀察蛋黃凍干顆粒的聚集程度。未經(jīng)處理的FEY顆粒較大，部分顆粒彼此黏連，凝結(jié)在一起，總體呈不規(guī)則且不均勻分布。與FEY相比，CEY和CHEY顆粒較小，且分布更加松散；HEY顆粒發(fā)生了明顯的熱聚集；UCEY顆粒尺寸減小，且分布更加均勻（圖5）。

圖5 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃聚集程度的影響Fig. 5 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on the degree of aggregation of egg yolk

掃描電子顯微鏡圖像表明超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃結(jié)構(gòu)的影響程度大于超聲或殼聚糖單一處理，這與超聲產(chǎn)生的空化和微湍流效應(yīng)有關(guān)，超聲處理后蛋黃粉的顆粒結(jié)構(gòu)被破壞并分裂為大量碎片，產(chǎn)生了不規(guī)則的孔狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)不同程度的凹陷、裂紋和片狀凸起，顆粒大小也變得更加不均勻。超聲處理使蛋黃顆粒的微觀結(jié)構(gòu)變得更緊密，其可對蛋白質(zhì)的構(gòu)象和蛋黃顆粒中的物質(zhì)組成產(chǎn)生影響，改變顆粒的聚集狀態(tài)。殼聚糖與蛋黃蛋白發(fā)生了反應(yīng)，促進(jìn)了分子之間的相互作用，使蛋黃顆粒結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。超聲協(xié)同殼聚糖處理使結(jié)構(gòu)緊密的蛋白質(zhì)分子展開并暴露于活性殘基之中，從而使蛋黃顆粒更加分散、均勻，表明超聲協(xié)同殼聚糖處理蛋黃可有效改善其顆粒結(jié)構(gòu)。

2.6 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃液流變學(xué)特性的影響

本研究使用模塊化旋轉(zhuǎn)流變儀測定蛋黃液的流變性質(zhì)，并監(jiān)測樣品的動態(tài)黏彈性。頻率掃描測試包括2 個獨立參數(shù)，儲能模量G’又稱彈性模量，反映了蛋黃的彈性特性；損耗模量G”又稱黏性模量，反映了蛋黃的黏性特性。頻率掃描的結(jié)果經(jīng)常用于檢驗樣品的穩(wěn)定性和內(nèi)部組織變化情況[24]。各組蛋黃液的G’和G”變化趨勢大致相同，且G’與G”的數(shù)值與掃描頻率呈正相關(guān)，與Xu Lilan等[25]對蛋黃進(jìn)行頻率掃描后觀察到的結(jié)果類似，意味著彈性行為并未占主導(dǎo)地位，所有處理組蛋黃的G”均大于G’，說明蛋黃表現(xiàn)出流體的性質(zhì)（圖6）。蛋黃中蛋白質(zhì)分子間相互作用力的增強會使其黏性增大，并且其彈性模量與黏性模量都隨之增大。本研究中UCEY的彈性模量和黏性模量均最高，說明超聲協(xié)同殼聚糖處理使蛋黃中蛋白質(zhì)的多肽鏈展開，疏水作用增強，并且殼聚糖的添加使蛋黃液黏度增加，流動性變差，形成更加緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致G’增大，最終促使蛋黃體系的穩(wěn)定性得到改善。CEY與UEYG’和G”的變化趨勢與UCEY相似，但UCEY的性質(zhì)改善更加明顯，表明超聲與殼聚糖處理存在協(xié)同作用，其共同使蛋黃蛋白質(zhì)分子相互作用增強，并使液滴間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固。

圖6 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃液流變學(xué)特性的影響Fig. 6 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on rheological properties of liquid egg yolk

表觀黏度是蛋黃液的基本功能指標(biāo)，指在一定的速率梯度下剪切應(yīng)力與速率之比。表觀黏度為食物乳液和其他懸浮顆粒提供物理支持，可直觀地反映出液體的流動性。蛋黃液的表觀黏度隨著剪切速率的增加而減小，表明所有蛋黃液都是假塑性流體，具有剪切變稀的特性，是非牛頓流體。蛋黃顆粒之間通過各種作用力形成較穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，阻礙油滴的流動，使其具有一定的黏性。UCEY和CHEY的表觀黏度明顯高于FEY（圖7）。根據(jù)Ma Zihong等[26]的研究，糖對蛋黃中鐵或銅的螯合作用可能會限制或減少蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的交叉鍵合，抑制蛋白質(zhì)分子的聚集。殼聚糖的加入不僅改變了蛋黃液的聚集狀態(tài)，形成較大的液滴阻礙流動行為，還可能改變液滴的帶電情況，使液滴間排斥力增大，從而增加流動阻力。較高的黏度可以有效阻止液滴聚集，使乳液粒徑減小，增加蛋黃液的乳化穩(wěn)定性，與2.2節(jié)粒徑的測定結(jié)果相印證。僅經(jīng)過超聲的UEY表觀黏度較小，而UCEY的表觀黏度較大，表明加入殼聚糖可明顯改善蛋黃液黏度及乳化性質(zhì)。

圖7 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃液表觀黏度的影響Fig. 7 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on apparent viscosity of liquid egg yolk

2.7 SDS-PAGE分析結(jié)果

SDS-PAGE是反映蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變化最直觀且便捷的方法之一，用于對蛋白質(zhì)的亞基分子質(zhì)量進(jìn)行分析，SDS能使肽鏈伸展，破壞蛋白質(zhì)原有的二、三級結(jié)構(gòu)，β-巰基乙醇切斷了半胱氨酸之間的二硫鍵，排除由于二硫鍵引起蛋白質(zhì)聚集的可能性，使蛋白質(zhì)分子的移動速率僅與其亞基分子質(zhì)量相關(guān)[27]。SDS-PAGE能反映蛋黃中蛋白質(zhì)與殼聚糖發(fā)生的共價連接情況以及超聲對于蛋黃蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的影響。

根據(jù)Wang Ruihong等[28]的研究，蛋黃液中主要含有低密度脂蛋白和卵黃球蛋白，蛋黃顆粒中主要含有高密度脂蛋白和卵黃高磷蛋白，分子質(zhì)量為130 kDa的蛋白含量最多，其次是55～80 kDa的蛋白，本研究的測定結(jié)果與之相符。CHEY和UCEY各亞基組分的條帶相較于FEY明顯較淺，HEY條帶顏色相較于FEY變化最大，F(xiàn)EY和CEY之間條帶顏色無明顯差異（圖8）。

圖8 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃蛋白SDS-PAGE圖譜的影響Fig. 8 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on SDS-PAGE pattern of egg yolk proteins

蛋白條帶顏色變淺說明蛋白質(zhì)聚集體被β-巰基乙醇和SDS分解，超聲處理促進(jìn)了疏水相互作用和巰基二硫鍵交換的反應(yīng)，使疏水相互作用增強的同時二硫鍵斷裂。蛋黃蛋白質(zhì)與殼聚糖發(fā)生共價鍵結(jié)合減少了蛋白質(zhì)中的自由氨基和巰基數(shù)量，即減少了與考馬斯亮藍(lán)發(fā)生顯色反應(yīng)的基團(tuán)數(shù)量，使條帶變淺或不顯色。

2.8 FTIR分析結(jié)果

2.8.1 FTIR圖譜分析

FTIR是檢測生物聚合物之間相互作用并揭示分子微觀結(jié)構(gòu)變化的有力工具，其圖譜中1 700～1 600 cm－1之間的吸收峰是由于肽鍵的C＝O伸縮和N—H氫鍵振動而產(chǎn)生，即酰胺I帶。酰胺I帶的遷移與蛋白質(zhì)和多肽的二級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。超聲協(xié)同殼聚糖處理前后的蛋黃液FTIR圖譜并無明顯變化，但在酰胺帶I處，F(xiàn)EY的峰值位于1 631.00 cm－1處，而CHEY的峰值位于1 632.45 cm－1處，向高波數(shù)方向移動，而UCEY的峰值位于1 633.41 cm－1處，發(fā)生明顯藍(lán)移（圖9）。氫鍵的斷裂可以提高化學(xué)鍵的力常數(shù)，從而使其吸收頻率向高波數(shù)方向移動，因此推測超聲協(xié)同殼聚糖處理后蛋白質(zhì)分子由于氫鍵和肽鍵的斷裂而展開，從而導(dǎo)致官能團(tuán)結(jié)構(gòu)改變。

圖9 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃蛋白FTIR圖譜的影響Fig. 9 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on FTIR spectrum of egg yolk proteins

2.8.2 酰胺I帶的反卷積和曲線擬合

為進(jìn)一步了解超聲及殼聚糖處理對蛋黃蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響，本研究測定了不同處理蛋黃蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)改性后C＝O數(shù)量以及C＝O和N—H之間形成的氫鍵都會發(fā)生改變，通過FTIR可以進(jìn)行分析鑒定。

由表1可以看出，CEY的無規(guī)卷曲相對含量比FEY增加7.19%，表明殼聚糖促使蛋黃蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開。UCEY的α-螺旋和無規(guī)卷曲相對含量分別比FEY增加了3.48%和5.26%，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的相對含量分別比FEY減少了2.56%和14.04%。表明超聲協(xié)同殼聚糖處理可以打開氫鍵結(jié)構(gòu)，使β-結(jié)構(gòu)含量減少，促進(jìn)了蛋黃蛋白質(zhì)從有序結(jié)構(gòu)到無序結(jié)構(gòu)的過渡。在加入殼聚糖并提高溫度后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加伸展、無序，一些蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)被破壞。蛋白分子中螺旋、折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的相對含量均發(fā)生了變化，它們之間在不同作用下相互轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)化為無規(guī)卷曲，蛋白質(zhì)分子伸展。UCEY的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)了類似的變化，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)打開、疏水性提高，側(cè)面說明超聲及殼聚糖處理有利于蛋白質(zhì)乳化性質(zhì)的改善。

表1 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相對含量的影響Table 1 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on relative contents of secondary structures in egg yolk proteins%

2.9 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的影響

為了進(jìn)一步研究超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的影響，本研究分析了蛋黃蛋白質(zhì)的熒光光譜，其可以反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化以及是否形成復(fù)合物[29]。色氨酸殘基的發(fā)射峰位置在340 nm波長附近，且蛋白質(zhì)的熒光峰與色氨酸殘基的熒光峰相同，即色氨酸殘基的熒光峰位置是反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的敏感指標(biāo)，色氨酸殘基的變化會導(dǎo)致熒光猝滅或峰位置偏移[30]。

從圖10可以看出，與FEY相比，經(jīng)過處理的蛋黃熒光光譜峰值降低，說明經(jīng)過處理的蛋黃中色氨酸殘基發(fā)生熒光猝滅，可能是由于超聲協(xié)同殼聚糖處理使得蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)伸展，疏水的色氨酸殘基從蛋白質(zhì)內(nèi)部轉(zhuǎn)移到外部，從而使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由緊實變得松散，三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。UCEY的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)變化最大，其熒光強度峰值為2 373，表明超聲協(xié)同殼聚糖處理導(dǎo)致熒光猝滅，并使蛋黃中蛋白質(zhì)由緊密狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檩^為伸展的結(jié)構(gòu)。

從波長的變化來看，F(xiàn)EY的最大峰值在336.3 nm波長處，與FEY相比，CHEY、UEY和UCEY的最大峰值位置都略有藍(lán)移，最大峰值分別在335.6、336.0 nm和334.8 nm波長處，其中UCEY的最大峰值位置移動了0.45%，蛋白質(zhì)的熒光強度和最大峰值位置的改變反映了色氨酸殘基被氧化的程度及微環(huán)境的變化，藍(lán)移的發(fā)生表明了蛋白質(zhì)表面有色氨酸殘基的暴露，但從圖10中可以看出，藍(lán)移現(xiàn)象并不明顯，可以認(rèn)為超聲協(xié)同殼聚糖處理只改變了蛋白質(zhì)的支鏈結(jié)構(gòu)，對其空間結(jié)構(gòu)影響不大。

2.10 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃蛋白質(zhì)疏水性的影響

由圖11可知，所有處理組的表面疏水指數(shù)均顯著高于未處理組（P＜0.05）。其中FEY的表面疏水指數(shù)為8 110.80；UCEY的表面疏水指數(shù)最高，為9 157.33，與FEY相比提高了12.91%；其次是HEY和UEY，其表面疏水指數(shù)分別為9 030.47和9 004.10，但二者與UCEY之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。

圖11 超聲協(xié)同殼聚糖處理對蛋黃蛋白質(zhì)疏水性的影響Fig. 11 Effect of ultrasound-assisted chitosan treatment on hydrophobicity of egg yolk proteins

蛋白質(zhì)顆粒的表面疏水性對其在油-水界面的吸附性能（即蛋白的乳化性質(zhì)）具有顯著影響，蛋白質(zhì)表面疏水性與其乳化能力呈正相關(guān)[31]。根據(jù)Ma Zihong等[26]的研究，經(jīng)過物理處理后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致肽鏈斷裂、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露出脂肪族和芳香族氨基酸，其疏水表面暴露并與8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）結(jié)合，導(dǎo)致其表面疏水性增強。根據(jù)閆崢蓉等[32]的研究，表面疏水性越高的蛋白質(zhì)乳化性質(zhì)越好，蛋白質(zhì)分子由于靜電排斥等作用力而解聚，使其分子質(zhì)量降低，從而使蛋白質(zhì)更好地附著在油-水界面上。超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械剪切和湍流形成局部瞬時的高壓和高溫，從而引起蛋白質(zhì)的展開和擴(kuò)展，使得原本包埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，并與ANS發(fā)生相互作用。殼聚糖分子中疏水性的N-乙?；?D-葡糖胺單元暴露于復(fù)合顆粒的表面，提高了復(fù)合顆粒的疏水性。疏水性的增加會導(dǎo)致液滴表面形成界面膜，使蛋白質(zhì)更多地吸附在乳液界面，減緩油滴的凝結(jié)速度，從而使其乳化性質(zhì)得到改善。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，與未處理組相比，超聲及添加殼聚糖處理使蛋黃液乳化性質(zhì)提高了29.51%，乳液粒徑減小了50.01%，揭示了超聲協(xié)同殼聚糖處理后蛋黃液乳化性質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，證明超聲協(xié)同殼聚糖處理是一種能夠有效提高蛋黃液乳化性質(zhì)的方法。經(jīng)過超聲協(xié)同殼聚糖處理后，蛋黃乳液液滴更加細(xì)小，液滴形狀更加均勻，蛋黃蛋白質(zhì)在油-水界面分布的均一性增加，超聲協(xié)同殼聚糖處理后蛋黃蛋白質(zhì)界面張力隨時間延長的變化曲線更快達(dá)到平衡，說明其吸附速率提高，蛋黃液達(dá)到平衡的時間縮短。CEY、UEY與UCEY的EAI分別比FEY提高了1.18%、18.49%和29.51%；三者的界面張力有相似的變化趨勢，且平滑程度相當(dāng)，但UCEY的初始界面張力更低；CEY與UEY流變學(xué)性質(zhì)變化趨勢相同，但UCEY的流變學(xué)性質(zhì)改善更加明顯。說明超聲與殼聚糖處理對界面張力的降低存在一定程度的協(xié)同作用。超聲協(xié)同殼聚糖處理后蛋黃蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，蛋黃凍干顆粒體積的均一性提高、蛋黃蛋白質(zhì)的聚集程度降低。FTIR分析結(jié)果表明，與FEY相比，蛋黃蛋白質(zhì)無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對含量增加了5.26%，蛋白質(zhì)更加無序分散，而無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)有助于改善蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)。熒光光譜分析結(jié)果顯示超聲協(xié)同殼聚糖處理后蛋黃蛋白質(zhì)中色氨酸殘基更加傾向于暴露在外部，經(jīng)超聲協(xié)同殼聚糖處理的蛋黃蛋白質(zhì)表面疏水指數(shù)最高（9 157.33），其三級結(jié)構(gòu)由緊密狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檩^為伸展的結(jié)構(gòu)，與SDS-PAGE的結(jié)果相印證。較為松散的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有利于蛋黃液乳化性質(zhì)的改善，超聲協(xié)同殼聚糖處理可以打開蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。本研究中經(jīng)超聲協(xié)同殼聚糖處理獲得的UCEY顯示出良好的作為高乳化性質(zhì)原料的應(yīng)用潛力，未來可將其應(yīng)用于焙烤蛋液等專用蛋液中。