布魯氏菌病疫苗的應(yīng)用現(xiàn)狀及防控技術(shù)

文│張偉 （河南省南陽(yáng)市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)宛城執(zhí)法大隊(duì)）

黃小東（河南省南陽(yáng)市宛城區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所）

布魯氏菌病是一種能引起多種動(dòng)物和人感染的細(xì)菌性疾病，能導(dǎo)致牛、羊、豬等動(dòng)物出現(xiàn)流產(chǎn)和高熱等癥狀。感染人后不僅需要進(jìn)行長(zhǎng)期治療，還會(huì)造成嚴(yán)重的后遺癥。所以要對(duì)該病進(jìn)行有效防控，減少由該病造成的經(jīng)濟(jì)損失和公共衛(wèi)生學(xué)方面的威脅。

一、布魯氏菌病的簡(jiǎn)介

該病流入我國(guó)后不斷引發(fā)疾病，在上世紀(jì)八九十年代曾經(jīng)得到很好的控制，而后又出現(xiàn)回升情況。近年來(lái)，布魯氏菌病對(duì)動(dòng)物和人類的危害十分嚴(yán)重，需要及時(shí)采取相應(yīng)措施進(jìn)行有效防控。

1.病原。布魯氏菌是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，經(jīng)革蘭氏染色呈陰性。能在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)內(nèi)造成持續(xù)感染的情況。病原對(duì)環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力，通常在水源、土壤及分泌物中可以存活120天左右，在太陽(yáng)光下可以存活超過4小時(shí)。但其對(duì)消毒劑比較敏感，常用的消毒劑都可以在短時(shí)間內(nèi)將其殺死。布魯氏菌對(duì)溫度也比較敏感，當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)，病原僅可存活30分鐘，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)，病原會(huì)在10分鐘內(nèi)死亡。

2.流行病學(xué)。該病傳染源主要是牛、羊和豬，其次是犬和其他野生動(dòng)物。病原通過呼吸道、消化道及生殖道傳播，發(fā)病和帶毒動(dòng)物通過分泌物和排泄物將病原排出體外，對(duì)周圍環(huán)境造成污染，這樣當(dāng)健康動(dòng)物采食、吸入或經(jīng)生殖道直接接觸病原后會(huì)受到感染而引發(fā)疾病。

3.臨床癥狀和病理變化。該病主要對(duì)動(dòng)物的多個(gè)組織器官形成危害，主要有肝、脾、生殖系統(tǒng)和淋巴結(jié)等?？梢詫?dǎo)致這些組織器官發(fā)生炎癥和壞死，而后形成肉芽腫。雌性動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎等情況，而雄性動(dòng)物主要導(dǎo)致睪丸出現(xiàn)炎癥。人在感染該病后會(huì)出現(xiàn)低熱、肌肉關(guān)節(jié)疼痛、乏力等情況，影響正常的生育機(jī)能，喪失勞動(dòng)力。

二、布魯氏菌病的疫苗研究及應(yīng)用情況

目前對(duì)布魯氏菌病的疫苗研究已經(jīng)成為該病防控的熱點(diǎn)，弱毒疫苗是預(yù)防布魯氏菌病的傳統(tǒng)疫苗，當(dāng)前研究較多的是基因工程疫苗，但這些疫苗的應(yīng)用效果并不理想。

1.傳統(tǒng)的疫苗。

（1）牛布魯氏菌弱毒疫苗。在布魯氏菌疫苗的研制過程中，最成功的疫苗為S19株，也是目前應(yīng)用最廣泛的疫苗。而后美國(guó)于1956年對(duì)此疫苗所用的毒株進(jìn)行減毒處理，也就是將其中的ery基因敲除，將用此毒株制成的疫苗命名為US19。我國(guó)最初應(yīng)用的是從蘇聯(lián)引進(jìn)的毒株，為A19株，應(yīng)用該毒株疫苗已有60多年。對(duì)我國(guó)布魯氏菌病的防控起到了至關(guān)重要的作用。該疫苗并非ery基因敲除后的毒株制作的，但其能有效保護(hù)牛和綿羊免受布魯氏菌的攻擊，具有較長(zhǎng)的免疫期，通?？蛇_(dá)72個(gè)月甚至更長(zhǎng)。該疫苗對(duì)山羊的免疫效果較差，對(duì)豬完全沒有免疫效果。而且本疫苗不能應(yīng)用于妊娠期和哺乳期的牛、羊。

（2）羊布魯氏菌弱毒疫苗。羊布魯氏菌病疫苗所用的毒株是6056毒株經(jīng)過多次傳代后獲取到的一種突變毒株。該毒株于1957年被證實(shí)能對(duì)山羊起到很好的保護(hù)作用，而后就開始進(jìn)行廣泛應(yīng)用，這也是經(jīng)過OIE認(rèn)可的疫苗，是當(dāng)前在小反芻獸應(yīng)用中最有效的疫苗。該疫苗需要應(yīng)用皮下注射和通過黏膜進(jìn)行免疫，具有非常好的免疫效果，但本疫苗不適用于妊娠期動(dòng)物，由于其毒力強(qiáng)，可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物流產(chǎn)。

（3）豬布魯氏菌弱毒疫苗。種豬應(yīng)用的疫苗為S2株，該毒株毒力弱，免疫后能產(chǎn)生出強(qiáng)大的保護(hù)力。而且本毒株制作的疫苗還能對(duì)牛、羊進(jìn)行免疫，也可以達(dá)到較好的免疫效果。還可以應(yīng)用于妊娠母畜，通常不會(huì)引起母畜出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀，具有良好的安全性。

2.基因工程疫苗?；蚬こ桃呙缡钱?dāng)前的研究熱點(diǎn)，雖然能解決一些問題，但也存在一些問題。導(dǎo)致研制的疫苗不能大批量應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。

（1）DNA疫苗。由于布魯氏菌通常在細(xì)胞內(nèi)寄生，可以使細(xì)胞產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答。這是由于菌體中的某些成分具有類似于T細(xì)胞的抗原功效，成為DNA疫苗的重點(diǎn)研究方面。通過在表達(dá)載體上構(gòu)建出攜帶有布魯氏菌omp31的基因，以此來(lái)制作疫苗，用此疫苗在小鼠上進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果小鼠能對(duì)病原攻擊起到良好的保護(hù)效果。而且這種疫苗具有良好的安全性和便利的制備工藝，但也有一些弱勢(shì)，最大的弱勢(shì)是在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答方面存在問題，常常不能引起機(jī)體出現(xiàn)針對(duì)性的免疫應(yīng)答反應(yīng)。特別是應(yīng)用此DNA疫苗時(shí)，這種效果更明顯。

（2）基因缺失疫苗。應(yīng)用基因工程技術(shù)可以將布魯氏菌的一些基因敲除或沉默后用于制作疫苗，這樣的疫苗為基因缺失苗，將bp26和omp31基因敲除后制成的基因缺失苗不僅不會(huì)對(duì)動(dòng)物相關(guān)檢測(cè)造成干擾，還能起到疫苗效果，引起誘導(dǎo)效應(yīng)，而且通過檢測(cè)可以區(qū)別是自然感染還是人工感染。具有非常高的優(yōu)勢(shì)，這也使得本類疫苗成為新疫苗研究的熱點(diǎn)。

（3）亞單位疫苗。由于布魯氏菌的外膜上有一些蛋白質(zhì)具有良好的抗性，可以用于亞單位疫苗的研發(fā)，可以通過基因工程技術(shù)獲得這些蛋白質(zhì)的編碼基因，而后將這些基因和質(zhì)粒重組，將其轉(zhuǎn)至宿主中進(jìn)行表達(dá)，這樣獲得了大量的保護(hù)性肽段。再將這些肽段和佐劑結(jié)合，制成亞單位疫苗。亞單位疫苗具有成分單一、安全等優(yōu)點(diǎn)，但也有單獨(dú)使用效果不好、生產(chǎn)成本高、工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)，因此在臨床上不容易得到推廣和應(yīng)用。

（4）“無(wú)毒”疫苗。有的布魯氏菌病不會(huì)引起任何宿主發(fā)病，用這種菌種制成疫苗進(jìn)行免疫可以使試驗(yàn)小鼠獲得免疫力。由此可見，這種布魯氏菌可以用來(lái)制成疫苗用于免疫，而且沒有感染風(fēng)險(xiǎn)，安全可靠。

（5）載體疫苗。當(dāng)選擇好抗原時(shí)，其有效地呈遞給免疫系統(tǒng)就顯得比較重要，這就需要選擇良好的載體進(jìn)行遞送，常見的可以供遞送的載體有大腸桿菌、乳酸乳球菌、牛痘病毒、沙門氏菌等?？乖?jīng)過這些病原遞送后，能很好地被機(jī)體免疫系統(tǒng)所識(shí)別，從而誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。但有的蛋白通過病毒遞送后并不能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)，但牛痘病毒自身可以通過對(duì)宿主的干擾素活性調(diào)節(jié)。

（6）外膜囊泡。有的革蘭氏陰性菌能釋放外膜囊泡，當(dāng)其處于正常生長(zhǎng)或在一些特殊環(huán)境中就會(huì)產(chǎn)生外膜囊泡，多見于在土壤、培養(yǎng)基及正在感染宿主的過程中。而囊泡具有磷脂、脂多糖及外膜蛋白等多種成分，有證據(jù)表明，囊泡、機(jī)體調(diào)節(jié)免疫力及毒力因子釋放等具有非常大的相關(guān)性。

三、布魯氏菌病診斷方法研究

1.血清學(xué)方法。

（1）試管凝集試驗(yàn)。本方法在臨床上應(yīng)用較為廣泛，尤其是在牛、羊和豬的布魯氏菌診斷中。本試驗(yàn)只針對(duì)光滑型布魯氏菌脂多糖，所以本方法不能用于粗糙型犬布魯氏菌。具體方法是將發(fā)病動(dòng)物的血清經(jīng)過2倍稀釋，而后加入滅活的布魯氏菌抗原，兩者在微量板或反應(yīng)管中反應(yīng)一夜，觀察結(jié)果，如果出現(xiàn)凝集反應(yīng)，則復(fù)合物會(huì)沉降，上清液清亮。如果沒有發(fā)生凝集反應(yīng)，則液體為混懸液。

（2）虎紅平板凝集試驗(yàn)。本試驗(yàn)是診斷布魯氏菌病最快捷的方法。通過將虎紅平板凝集抗原滴于清潔的玻璃平板上，滴加量為0.03毫升，而后再往上滴加0.03毫升的被檢血清，將二者混合后約4分鐘觀察結(jié)果。當(dāng)出現(xiàn)凝集情況時(shí)可以判定結(jié)果為陽(yáng)性。需要通過試管凝集的方法再次驗(yàn)證結(jié)果。

（3）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。該方法操作相對(duì)比較復(fù)雜，通常是在微量板中進(jìn)行操作，在試驗(yàn)時(shí)要對(duì)血清、抗原和補(bǔ)體進(jìn)行孵育，不同溫度需要孵育的時(shí)間不一致，通常在37℃左右時(shí)需要半小時(shí)即可，當(dāng)溫度為2～8℃時(shí)需要孵育時(shí)長(zhǎng)為14～18小時(shí)。血清質(zhì)量較差時(shí)應(yīng)降低孵育溫度，本方法的特異性較高，敏感性相對(duì)較低。在國(guó)際上通用，尤其多用于國(guó)際貿(mào)易。

（4）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的方法應(yīng)用較為廣泛，具有非常高的敏感性。目前應(yīng)用較為廣的是間接或競(jìng)爭(zhēng)ELISA，用光滑型脂多糖或O鏈抗原等作為包被抗原。但其在檢測(cè)時(shí)難以區(qū)分抗體是由疫苗接種產(chǎn)生的還是自然感染產(chǎn)生的。但總體來(lái)說(shuō)，ELISA方法具有高敏感性、高特異性和高通量，適用于臨床大量樣本的檢測(cè)。而且目前已經(jīng)有成熟的試劑盒可以應(yīng)用。

（5）熒光偏振試驗(yàn)。本方法的機(jī)理是根據(jù)分子大小不同產(chǎn)生的旋轉(zhuǎn)速度不同而進(jìn)行的。經(jīng)過應(yīng)用熒光染料對(duì)布魯氏菌抗原分子進(jìn)行標(biāo)記，這樣當(dāng)血清中含有該病抗體時(shí)，抗原和抗體就會(huì)凝集，形成抗原抗體復(fù)合物，這種復(fù)合物在液相中轉(zhuǎn)動(dòng)速度減慢，導(dǎo)致熒光偏振程度升高，由此被儀器檢測(cè)到。熒光偏振程度和待檢樣品中抗體的濃度具有相關(guān)性。本方法是OIE指定的國(guó)際貿(mào)易方法，其具有非常高的特異性和敏感性。

2.細(xì)胞免疫學(xué)方法。

（1）布魯氏菌素皮試驗(yàn)。本試驗(yàn)是應(yīng)用細(xì)胞免疫學(xué)方法進(jìn)行，試驗(yàn)需要將標(biāo)準(zhǔn)抗原純化后應(yīng)用。本方式適用于檢測(cè)沒有接種疫苗的動(dòng)物血清，具有非常高的特異性，被認(rèn)為是該病最特異的方法之一。目前多用本方法進(jìn)行群體效價(jià)水平檢測(cè)。

（2）γ-干擾素釋放試驗(yàn)。本方法是應(yīng)用適當(dāng)抗原物質(zhì)去刺激機(jī)體，使血液中產(chǎn)生了淋巴細(xì)胞，這樣就會(huì)產(chǎn)生γ-干擾素，而后應(yīng)用ELISA來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的一種方法。本方法可應(yīng)用于對(duì)布魯氏菌病和假陽(yáng)性的區(qū)分，但在試驗(yàn)中也需要應(yīng)用到特異性抗原。

四、結(jié)語(yǔ)

動(dòng)物布魯氏菌病雖然目前還未得到凈化，但已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，尤其是對(duì)疫苗、診斷技術(shù)的研究在不斷深入，相信在不久的將來(lái)會(huì)得到全面應(yīng)用，對(duì)該病的凈化起到至關(guān)重要的作用。但養(yǎng)殖場(chǎng)還是要以科學(xué)的飼養(yǎng)管理為基礎(chǔ)，這樣才能做好疫病防控工作。