雙葛止瀉口服液對小鼠的抗炎止瀉藥效學(xué)研究

?？?，李召斌，晏磊，楊絨娟，高艷艷，周德剛

（國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心/ 洛陽惠中獸藥有限公司河南洛陽 471003）

雙葛止瀉口服液是由洛陽惠中獸藥有限公司、普萊柯生物工程股份有限公司和河南新正好生物工程有限公司聯(lián)合研制的三類新獸藥。雙葛止瀉口服液由金銀花、葛根、黃芩、黃連、白芍和炙甘草組成，來源于《傷寒論》中的“葛根芩連湯”。雙葛止瀉口服液方中金銀花清熱解毒，涼血止瀉，葛根止瀉生津，鼓舞胃氣，二者共為君藥，具有解熱、抗炎、抗病毒等藥理作用[1,2]；以苦寒之黃連、黃芩為臣，清熱燥濕，厚腸止瀉；白芍養(yǎng)血合營，緩急止痛為佐藥；炙甘草調(diào)和藥性，合白芍酸甘化陰，緩急止痛。全方配伍，共奏清熱解毒，止瀉生津之功。文獻(xiàn)報(bào)道葛根芩連湯對感染性腹瀉具有一定的治療作用[3,4]。為了研究雙葛止瀉口服液的藥理作用，考察其對小鼠抗炎止瀉效果，本研究采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型，來研究抗炎作用，采用番瀉葉腹瀉模型和墨汁推進(jìn)法來探討雙葛止瀉口服液止瀉作用，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

4 周齡健康BALB/c 小鼠50 只，雄性，SPF 級，許可證號：SCXK（京）2016—0011，4 周齡健康BALB/c 小鼠130 只，雌雄各半，SPF級，許可證號：SCXK（京）2016—0011，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。于普萊柯生物工程股份有限公司經(jīng)河南省試驗(yàn)動(dòng)物協(xié)會認(rèn)證通過的SPF 小鼠應(yīng)用合格的動(dòng)物房內(nèi)觀察3d 無異常進(jìn)行試驗(yàn)，使用小鼠IVC 獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具。飼養(yǎng)條件：滅菌全價(jià)飼料喂養(yǎng)，自由采食與飲水，室溫20～24℃，相對濕度40%～60%。

1.2 試驗(yàn)藥品

雙葛止瀉口服液，規(guī)格：每1mL相當(dāng)于原生藥0.45g，批號：20170201，洛陽惠中獸藥有限公司；

楊樹花口服液，規(guī)格：每1mL 相當(dāng)于原生藥1g，批號：16092002，鄭州后羿制藥有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器及試劑

YLS-Q4 型耳腫打耳器，上海艾研生物科技有限公司；AB265-S型電子分析天平，梅特勒托利多儀器有限公司；Milli-Q 型（超）純水機(jī)，美國Millip ore 公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，鞏義予華儀器有限公司；JA2003 電子天平，上海上平儀器有限公司。

二甲苯，批號：20080419，派尼化學(xué)試劑廠；番瀉葉，批號：150701，購自河南百信藥房；6 號灌胃針；一次性使用無菌注射器；濾紙；鋼尺；碳素墨汁；計(jì)時(shí)器；解剖剪等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 雙葛止瀉口服液對小鼠耳腫脹抗炎作用研究

2.1.1 分組和給藥方法取健康小鼠50 只，隨機(jī)分為5 組，每組10 只，分別為雙葛止瀉口服液低（2.78mL/kg·d-1）、中（5.56mL/kg·d-1）、高（11.12mL/kg·d-1）劑量組，楊樹花口服液對照組（3.15mL/kg·d-1）和模型對照組。4 個(gè)給藥組均按0.1mL/10g灌胃給藥，2 次/d，給藥間隔6h，連續(xù)給藥3d，模型對照組灌服蒸餾水。末次給藥30min 后，于小鼠右耳正反兩面分別用10μL移液器滴10μL二甲苯，左耳不涂作為對照，1h 后頸椎脫臼處死小鼠，用直徑8mm 打孔器打下左右耳，稱重，左耳做對照，以左右耳片重量差作為腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率。

2.1.2 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以模型對照組小鼠左右耳作為對照，構(gòu)建小鼠耳腫脹模型，當(dāng)模型對照組左右耳重差異顯著或極顯著時(shí)（P<0.05或P<0.01），表明模型構(gòu)建成功。腫脹度=致炎耳片重（右耳）－非致炎耳片重（左耳）。腫脹抑制率（%）=（模型組腫脹度－給藥組腫脹度）/ 模型組腫脹度×100。

給藥組與模型對照組比較，腫脹度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著或極顯著時(shí)（P<0.05 或P<0.01），表明雙葛止瀉口服液對二甲苯所致的小鼠耳腫脹具有抑制作用。

2.2 雙葛止瀉口服液對番瀉葉所致腹瀉小鼠止瀉作用研究

2.2.1 番瀉葉制備取番瀉葉125g，加10 倍量水煮沸10min，過濾，濾液減壓濃縮成200mL，即濃度為0.625g/mL，4℃冰箱保存，用時(shí)水浴加溫至25℃[6-9]。

2.2.2 分組和給藥方法取健康小鼠60 只，隨機(jī)分為6 組，每組10 只，雌雄各半。6 個(gè)組分別為雙葛止瀉口服液低（2.78mL/kg·d-1）、中（5.56mL/kg·d-1）、高（11.12mL/kg·d-1）劑量組、楊樹花口服液對照組（3.15mL/kg·d-1）、模型對照組和空白對照組。0.1mL/10g 灌服給藥，2 次/d，給藥間隔6h，連續(xù)給藥3d；模型對照組和空白對照組灌服同體積蒸餾水。末次灌胃給藥前禁食12h，自由飲水。末次灌胃給藥0.5h 后，除空白對照組灌服0.5mL蒸餾水外，其他各組小鼠灌服番瀉葉提取液0.5mL/ 只。灌服番瀉葉提取液后每只小鼠單獨(dú)放一鼠籠中，籠底部放濾紙，每隔2h 換墊紙，觀察各組小鼠的一般臨床癥狀和腹瀉情況，統(tǒng)計(jì)出0～2h、2～4h、4～6h 和0～6h每只小鼠的稀便率和稀便級，并計(jì)算各組小鼠的腹瀉指數(shù)。

2.2.3 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)①稀便率：稀便率=每只動(dòng)物的稀便次數(shù)/ 每只動(dòng)物大便的總次數(shù)（稀便以濾紙上有污跡為標(biāo)準(zhǔn)）；糞便次數(shù)以每?；蛎慷眩ú荒芊智辶?shù)者）為1 次。②稀便級：表示稀便的程度，以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小定級。分為4 級，標(biāo)準(zhǔn)如下：1 級：污跡直徑<1c m；2 級：污跡直徑1～1.9c m；3 級：污跡直徑2～3c m；4 級：污跡直徑>3c m。先逐個(gè)統(tǒng)計(jì)每一堆稀便的級數(shù)，然后將該鼠所有稀便級數(shù)相加除以稀便次數(shù)得稀便的平均級數(shù)，即為稀便級。污跡直徑的測量方法：糞便形狀為圓形，則直接量直徑；若糞便形狀為橢圓形則測量最長和近似圓的直徑，相加除2。③腹瀉指數(shù)：腹瀉指數(shù)=稀便率×平均稀便級。

2.3 雙葛止瀉口服液對小鼠腸運(yùn)動(dòng)影響試驗(yàn)

取健康小鼠50 只，隨機(jī)分為5 組，每組10 只，分別為雙葛止瀉口服液低（2.78mL/kg·d-1）、中（5.56mL/kg·d-1）、高（11.12mL/kg·d-1）劑量組，楊樹花口服液對照組（3.15mL/kg·d-1）和模型對照組。按0.1mL/10g 灌胃給藥，2 次/d，給藥間隔6h，連續(xù)給藥3d；空白對照組按0.1mL/10g 灌服蒸餾水。末次灌胃給藥前禁食12h，自由飲水，末次灌胃給藥0.5h后，各組小鼠均按照0.2mL/ 只灌胃給予10%碳素墨汁，20min 后用頸椎脫臼法將小鼠處死，將消化管自幽門至直腸末端完整地摘出，用直尺測量小腸全長及幽門至墨汁前沿的距離，記錄試驗(yàn)中每只小鼠的小腸全長（c m）和墨汁移動(dòng)距離（c m），并計(jì)算墨汁推進(jìn)率。

墨汁推進(jìn)率（%）=墨汁移動(dòng)距離（c m）/ 小腸全長（c m）×100%

2.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方法分析，顯著性用P 值表示，其中P<0.01 表示差異極顯著，P<0.05 表示差異顯著，P>0.05 表示無顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 雙葛止瀉口服液對小鼠耳腫脹抗炎作用研究

各組小鼠右耳進(jìn)行二甲苯致炎后，右耳均出現(xiàn)不同程度的紅腫。左耳耳重12.80±0.57（mg），右耳耳重21.24±3.11（mg），且右耳重極顯著高于左耳（P<0.01），表明本試驗(yàn)采用的小鼠二甲苯致炎模型成功，可以用于抗炎作用研究。

雙葛止瀉口服液對二甲苯所致的小鼠耳腫脹的影響試驗(yàn)結(jié)果如下表1。

表1 雙葛止瀉口服液對二甲苯所致的小鼠耳腫脹的影響（D,n=10）

表1 雙葛止瀉口服液對二甲苯所致的小鼠耳腫脹的影響（D,n=10）

注：上標(biāo)無相同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），上標(biāo)無相同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01）。

由表1 結(jié)果可知，雙葛止瀉口服液組中、高劑量組和楊樹花口服液對照組小鼠耳廓腫脹度明顯低于模型對照組，紅腫程度有所減輕，且腫脹抑制率差異極顯著（P<0.01），表明雙葛止瀉口服液具有抗炎作用，且雙葛止瀉口服液的劑量越大，腫脹度越小，抗炎作用越強(qiáng)。

3.2 雙葛止瀉口服液對番瀉葉所致腹瀉小鼠止瀉作用研究

所有灌服番瀉葉提取液小鼠在灌服0.5h 后均開始出現(xiàn)精神沉郁、背毛逆立；臥地不動(dòng)、縮頭、腹部劇烈抽動(dòng)；個(gè)別小鼠閉眼、眼內(nèi)有少量分泌物等臨床癥狀。灌服番瀉葉1h 后，均出現(xiàn)稀便，4～6h 時(shí)部分小鼠稀便消失，精神恢復(fù)，行為活躍。6h 后所有小鼠均未見稀便，精神、糞便恢復(fù)正常。

利用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)各組在灌服番瀉葉后腹瀉指數(shù)的差異，具體結(jié)果見表2。

表2 給藥3d 后灌服番瀉葉腹瀉指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析（D,n=10）

表2 給藥3d 后灌服番瀉葉腹瀉指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析（D,n=10）

注：同一列中，肩標(biāo)無相同小寫字母者，為差異顯著（P<0.05）；同一列中，肩標(biāo)無相同大寫字母者，為差異極顯著（P<0.01）。

由表2 統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，上表4 個(gè)時(shí)間段內(nèi)，空白對照組與模型對照組相比腹瀉指數(shù)均有極顯著差異（P<0.01）；臨床觀察結(jié)果可知所有灌服番瀉葉提取液小鼠均出現(xiàn)不同程度的精神沉郁和拉稀等癥狀，而空白對照組無拉稀，糞便均正常，表明小鼠的番瀉葉腹瀉模型構(gòu)建成功。0～6h 的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，模型對照組與雙葛止瀉口服液低、中、高劑量組和楊樹花對照藥組比差異均極顯著（P<0.01）。

3.3 雙葛止瀉口服液對小鼠腸運(yùn)動(dòng)影響試驗(yàn)

小鼠灌胃給藥后，雙葛止瀉口服液低劑量組小鼠腸道的推進(jìn)率小于空白對照組，但差異不顯著（P>0.05），表明雙葛止瀉口服液低劑量不能有效的抑制腸推進(jìn)。雙葛止瀉口服液中、高劑量組、楊樹花口服液對照組腸道的推進(jìn)率均顯著低（P<0.05）于空白對照組，表明雙葛止瀉口服液中、高劑量組和楊樹花口服液對照組均能有效的抑制腸道蠕動(dòng)，降低小腸推進(jìn)率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見下表3 所示。

表3 雙葛止瀉口服液對小鼠的腸推進(jìn)影響（D,n=10）

表3 雙葛止瀉口服液對小鼠的腸推進(jìn)影響（D,n=10）

4 討論

4.1 小鼠耳腫脹抗炎作用研究

二甲苯致小鼠耳腫脹模型是急性非特異性炎癥模型，是評價(jià)抗炎藥物常見的方法，一般全部選擇雄性動(dòng)物，以防雌激素的抗炎和免疫抑制作用[5,6]。腹瀉與腸道黏膜的損傷和各種炎性介質(zhì)的釋放有關(guān)，因而藥物的抗炎效果也是其發(fā)揮止瀉作用的重要機(jī)制之一。雙葛止瀉口服液由金銀花、葛根、黃芩、黃連、白芍和炙甘草提取液組成，金銀花對發(fā)熱模型大白鼠及炎性模型小鼠均有防止體溫升高和消除炎癥的作用，表明金銀花具有明顯的清熱解毒抗炎功效[7]。文獻(xiàn)報(bào)道黃連中的小檗堿類和白芍中的主要成分白芍總苷（TGP）均能抑制二甲苯引起的小鼠耳腫脹，抑制率達(dá)73.9%和84.1%[8]，表明對炎癥均有抑制作用。為了考察雙葛止瀉口服液在治療疾病時(shí)對機(jī)體的抗炎作用，本試驗(yàn)采用二甲苯致小鼠耳腫脹模型來評價(jià)抗炎作用。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，小鼠在給予一定量的雙葛止瀉口服液后可明顯減輕二甲苯所致的耳腫脹，說明雙葛止瀉口服液能阻止炎性滲出并減少紅腫，具有一定的清熱抗炎作用。

4.2 番瀉葉所致腹瀉小鼠止瀉作用研究

番瀉葉主要成分為蒽醌類衍生物，番瀉葉苷A、B、C、D，大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素和葡萄糖甙，是臨床常用的瀉下藥。王勝義[9]等報(bào)道黃白口液能明顯減少番瀉葉引起的小鼠腹瀉次數(shù)。毛瑩[10]等報(bào)道的在以番瀉葉致瀉為模型，以腹瀉指數(shù)為測定指標(biāo)的試驗(yàn)中，葛根芩連湯能明顯的減少番瀉葉引起的小鼠腹瀉次數(shù)，具有良好的止瀉作用（P<0.01）。番瀉葉腹瀉模型使用較普遍；且使用番瀉葉模型具有操作簡單，周期短，模型穩(wěn)定，重復(fù)性好，發(fā)病率高等特點(diǎn)，常作為篩選抗腹瀉藥物的模型。

本研究采用腹瀉指數(shù)作為指標(biāo)來評價(jià)雙葛止瀉口服液的止瀉作用，在番瀉葉腹瀉模型中應(yīng)用腹瀉指數(shù)這一指標(biāo)來反映稀便的程度，既可考慮到稀便量的變化，又能考慮到質(zhì)的因素，比單用稀便率與稀便級這兩個(gè)指標(biāo)更全面更客觀，并使之具有可比性[11]，故本試驗(yàn)采用的評價(jià)指標(biāo)為腹瀉指數(shù)。

采用番瀉葉造模后，各組小鼠均出現(xiàn)腹瀉癥狀，灌服番瀉葉后0～6h 觀察結(jié)果可知，各給藥組與模型對照組相比腹瀉指數(shù)均極顯著降低（P<0.01），本試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，表明雙葛止瀉口服液對番瀉葉所致小鼠腹瀉有一定的止瀉作用，能減輕小鼠的腹瀉程度。

4.3 小鼠腸運(yùn)動(dòng)影響試驗(yàn)

雙葛止瀉口服液中的君藥葛根具有解肌退熱、止瀉等功效[12]，其主要成分為葛根素、大豆苷等異黃酮類化合物。鐘凌云等[13]進(jìn)行了葛根主要藥效成分止瀉作用研究，結(jié)果表明葛根中的葛根素、大豆苷能極顯著降低小腸推進(jìn)率（P<0.01），隨給藥劑量的增加，小腸推進(jìn)率呈減弱趨勢，在一定劑量范圍內(nèi)存在良好量效關(guān)系。文獻(xiàn)報(bào)道表明，葛根素與大豆苷元具有明顯抑制胃排空和小腸推進(jìn)率作用，臨床上可用于治療泄瀉[14-16]。

本研究通過小腸推進(jìn)性運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)，計(jì)算墨汁推進(jìn)率，觀察不同劑量的雙葛止瀉口服液對胃腸蠕動(dòng)的作用影響。結(jié)果顯示，與空白對照相比，雙葛止瀉口服液中（5.56mL/kg·d-1）、高（11.12mL/kg·d-1）劑量均能顯著抑制胃腸蠕動(dòng)，抑制小腸推進(jìn)（P<0.05），高劑量組腸推進(jìn)百分率低于中劑量組。表明雙葛止瀉口服液具有明顯抑制小鼠小腸推進(jìn)作用，該作用是抑制腹瀉的重要機(jī)制之一，且該作用具有一定的劑量相關(guān)性。

5 結(jié)論

綜合以上研究結(jié)果表明，雙葛止瀉口服液具有一定的止瀉抗炎等功能，其止瀉機(jī)制與抑制胃腸運(yùn)動(dòng)具有相關(guān)性。