高明地區(qū)手足口病EV71的分子流行病學(xué)情況及核酸序列同源性的進(jìn)化性分析

鐘劍文 陳卓儀 陳健珍 譚安琦 劉翠嫻 張 宇

廣東省佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 528500

手足口病系腸道病毒引起以幼兒為主要發(fā)病群體的臨床常見傳染性疾病,其中以腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CA16)為最常見的病原體,此外,非EV71/CA16的腸道病毒也占一定比例[1]。既往已有學(xué)者對手足口病流行特點(diǎn)進(jìn)行分析[2],但有關(guān)EV71的分子流行特征及基因同源性進(jìn)化情況目前尚無報(bào)道。為進(jìn)一步明確EV71流行的分離株基因特征及其變異趨勢,本文以高明地區(qū)手足口病陽性標(biāo)本為例,調(diào)查EV71的分子流行病學(xué),并進(jìn)行核酸序列同源性進(jìn)化分析,以期為手足口病的臨床早期防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 選擇2020年1月—2022年12月高明區(qū)人民醫(yī)院及疾控中心提供來源于1 547例手足口病患者的陽性標(biāo)本共1 547份,其中2021年802份,2022年745份,包括普通病例(輕型)、重癥病例和死亡病例的糞便標(biāo)本和咽拭子標(biāo)準(zhǔn),-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取。采用PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司生產(chǎn)),按照試劑盒說明書進(jìn)行病毒RNA提取操作。將提取到的病毒RNA溶解于40μl洗脫液當(dāng)中,并于-20℃保存。

1.2.2 RT-PCR檢測。將提取到的病毒RNA作為模板,進(jìn)行擴(kuò)增操作,選擇引物為腸道通用引物、EV71型特異性引物及柯薩奇A組16型特異性引物,采用SuperScript Ⅳ RT-PCR Kit試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司生產(chǎn))進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,引物序列和反應(yīng)條件參照《手足口病預(yù)防控制指南(2008年版)》[3]。

1.2.3 EV71病毒VP1區(qū)核苷酸序列擴(kuò)增。從2021年手足口病EV71陽性樣本中隨機(jī)選取6份樣本進(jìn)行RNA VP1區(qū)擴(kuò)增操作,引物為(1)(2),擴(kuò)增片段全長為1 042bp,SuperScript Ⅳ RT-PCR Kit試劑盒擴(kuò)增反應(yīng)條件為:50℃下反應(yīng)35min,94℃下反應(yīng)5min;95℃下反應(yīng)15min;95℃下反應(yīng)30s,50℃下反應(yīng)25s,72℃下反應(yīng)70s,共進(jìn)行32個(gè)循環(huán);72℃下反應(yīng)10min。反應(yīng)結(jié)束后,采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。隨后將獲得的EV71 VP1區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托佛山市瑞因基因科技有限公司進(jìn)行回收測序。(1)EV71-vp1-F:5,-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3(nt 2372～nt 2392);(2)EV71-vp1-R:5-AAGTCGCGAGAGCTGTCYRC-3(nt 3434～nt 3454)。

1.2.4 DNA序列測定和分析。采用DNASTAR、Mega 4.0軟件,參比GenBank數(shù)據(jù)庫中序列,進(jìn)行VP1片段全部基因序列的氨基酸和核苷酸序列分析及進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 分子流行病學(xué)結(jié)果

2.1.1 2021年和2022年高明地區(qū)各月份手足口病病毒類型分布。2021年和2022年高明地區(qū)均以5—7月為手足口病高發(fā)時(shí)間,2021年5—7月EV71病毒引起的手足口病,占比分別為38.79%(64/165)、42.86%(87/203)、35.80%(63/176),2022年5—7月EV71病毒引起的手足口病,占比分別為40.00%(60/150)、41.97%(81/193)、36.14%(60/166)。EV71病毒引起的手足口病高發(fā)時(shí)間為5—7月,CA16病毒引起的手足口病高發(fā)時(shí)間為5—6月,非EV71/CA16(N)腸道病毒引起的手足口病高發(fā)時(shí)間為6—7月,EV71/CA16共感染引起的手足口病病例數(shù)較少。詳見表1、圖1。

表1 2021年和2022年高明地區(qū)各月份手足口病病毒類型分布(例)

2.1.2 2021年和2022年高明地區(qū)與佛山市其他地區(qū)手足口病病毒類型分布。結(jié)合佛山市其他4個(gè)區(qū)手足口病流行病學(xué)結(jié)果,2021年高明區(qū)、禪城區(qū)、順德區(qū)、南海區(qū)、三水區(qū)EV71病毒引起的手足口病占比分別為36.41%(292/802)、37.00%(367/992)、34.92%(242/693)、34.35%

(294/856)、36.49%(270/740),2022年高明區(qū)、禪城區(qū)、順德區(qū)、南海區(qū)、三水區(qū)EV71病毒引起的手足口病占比分別為36.11%(269/745)、38.05%(371/975)、36.48%(255/699)、36.95%(303/820)、35.61%(255/716)。詳見表2、圖2。

表2 2021年和2022年高明地區(qū)與佛山市其他地區(qū)手足口病病毒類型分布(例)

圖2 2021年(圖左)和2022年(圖右)高明地區(qū)與佛山市其他地區(qū)手足口病病毒類型分布

2.1.3 2021年和2022年高明地區(qū)各年齡段手足口病病毒類型分布。年齡方面,2021年和2022年手足口病均以≤1歲患者為主要發(fā)病群體,其中,2021年EV71、CA16、非EV71/CA16(N)、EV71/CA16共感染引起手足口病病例占比分別為36.36%(124/341)、29.62%(101/341)、32.84%(112/341)、1.17%(4/341),2021年EV71、CA16、非EV71/CA16(N)、EV71/CA16共感染引起手足口病病例占比分別為36.28%(115/317)、29.97%(95/317)、33.44%(106/317)、0.32%(1/317)。性別方面,2021年手足口病男女比例和EV71病毒引起的手足口病男女比例分別為2.073∶1和2.140∶1,2022年手足口病男女比例和EV71病毒引起的手足口病男女比例分別為2.066∶1和2.092∶1。詳見表3、圖3。

表3 2021年和2022年高明地區(qū)各年齡段手足口病病毒類型分布

圖3 2021年(圖左)和2022年(圖右)高明地區(qū)各年齡段手足口病病毒類型分布

2.1.4 病例類型分布。2021年,802例病例中普通病例790例,重癥病例10例,死亡病例2例,其中EV71病毒引起的手足口病的重癥和死亡病例占比分別為1.03%(3/292)和0.34%(1/292)。2022年,745例病例中普通病例738例,重癥病例8例,無死亡病例,其中EV71病毒引起的手足口病的重癥病例占比為0.74%(2/269)。詳見表4。

表4 2021年和2022年高明地區(qū)各病例類型手足口病病毒類型分布

2.2 EV71基因VP1編碼區(qū)基因同源性分析

圖4 高明地區(qū)6株EV71毒株與國內(nèi)外代表株

2.2.1 高明地區(qū)6株毒株與9株EV71代表株VP1片段的氨基酸同源性。本研究從EV71陽性標(biāo)本中隨機(jī)選擇6個(gè)樣本進(jìn)行EV71 VP1基因全長序列擴(kuò)增,通過序列測定獲得EV71病毒VP1區(qū)的全基因序列為891bp,未見核苷酸插入或缺失。6株EV71 VP1高明地區(qū)分離株序列與EV71原A、B、C各基因型代表株以及其他地區(qū)流行株序列進(jìn)行比較,核苷酸和氨基酸同源性詳見表5、表6。

表5 2021年高明地區(qū)6株毒株與9株EV71代表株VP1片段的核苷酸同源性(%)

表6 2021年高明地區(qū)6株毒株與9株EV71代表株VP1片段的氨基酸同源性(%)

2.2.2 高明地區(qū)6株毒株EV71 VP1片段之間核苷酸和氨基酸序列同源性。6株EV71在VP1區(qū)之間核苷酸和氨基酸同源性分別為97.5%～99.6%和99.6%～100.0%。詳見表7。

表7 高明地區(qū)6株毒株EV71 VP1片段之間核苷酸和氨基酸序列同源性(%)

2.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析?；贓V71 VP1編碼基因核苷酸序列,以及Genebank數(shù)據(jù)庫,對高明地區(qū)分離出的6株EV71構(gòu)建親緣進(jìn)化樹。詳見圖4。

3 討論

本研究結(jié)果顯示,EV71和CA16病毒均為高明地區(qū)引起手足口病的主要病原體,EV71近2年的病例占比分別為36.41%和36.11%,后者分別為29.55%和29.93%,其中2022年EV71占比雖然較2021年有所降低,但差異不明顯;5—7月為EV71病毒引起手足口病高發(fā)時(shí)間,相比CA16和非EV71/CA16有更長的流行期;≤1歲患者為手足口病高發(fā)群體,2021年和2022年EV71病例占比分別為36.36%和36.28%,遠(yuǎn)高于其他年齡,且近2年無明顯變化;男性為手足口病高發(fā)群體,2021年和2022年EV71病例男女比例分別為2.140∶1和2.092∶1。以上結(jié)果均充分表明,EV71依然是高明地區(qū)引起手足口病的主要病原體。本研究另一項(xiàng)結(jié)果顯示,非EV71/CA16的腸道病毒在手足口病致病方面也具有較重地位,與林峰等[4]的研究結(jié)果一致。本研究對近2年的手足口病病例中,重癥病例和死亡病例僅為17例和2例,而導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因,筆者認(rèn)為,一方面可能是由于廣東省區(qū)域內(nèi)手足口病的EV71流行毒力株較弱,另一方面可能與近年來廣東省對手足口病預(yù)防的重視程度逐年上升,并有EV71疫苗上市有關(guān)。但對于EV71與CA16對患者疾病嚴(yán)重程度的影響,本研究數(shù)據(jù)尚未見到顯著差異,與既往研究[5]中指出EV71相比CA16更容易引起重癥和死亡的觀點(diǎn)相悖,可能與本研究納入樣本數(shù)量較少有關(guān)?；蛲葱苑治鼋Y(jié)果顯示,基于高明地區(qū)樣本中分離出的6株EV71毒株構(gòu)建的親緣進(jìn)化樹,進(jìn)化樹可見高明地區(qū)EV71毒株與C4亞型代表處于同一分支,說明高明地區(qū)EV71毒株屬于C4型。

EV71病毒是2021—2022年高明地區(qū)手足口病流行的主要病原體,但是近年來由非EV71/CA16病毒引起的手足口病比例也有上漲趨勢,因此,未來需要對手足口病的各類型病原體的流行趨勢均需要進(jìn)行謹(jǐn)慎研究分析。