聯(lián)合BRAFV600E突變及TERT啟動(dòng)子突變基因檢測(cè)對(duì)判斷甲狀腺乳頭狀癌侵襲性價(jià)值研究*

林 占 李 樞 師 柔 李德祥 黃卓雅 廖觀生

廣東省惠州市中心人民醫(yī)院 516000

近年來(lái)隨著環(huán)境、生活習(xí)慣及工作壓力的改變,甲狀腺惡性腫瘤發(fā)病率逐年上升,甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid cancer,PTC)是臨床上最為常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤,與20世紀(jì)90年代比較,PTC發(fā)病率上升了近50%[1-2]。多數(shù)PCT患者的10年存活率較高,但是如果侵犯到頸前肌肉、血管等甲狀腺外面的結(jié)構(gòu),則其10年存活率就會(huì)顯著降低,并且對(duì)治療效果和預(yù)后造成影響[3],因此,急需探究分子標(biāo)記物對(duì)PTC侵襲性進(jìn)行評(píng)估,以提高治療效果,本文旨在探討聯(lián)合BRAFV600E突變及TERT啟動(dòng)子突變基因檢測(cè)對(duì)判斷甲狀腺乳頭狀癌侵襲性價(jià)值,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年6月—2023年4月在本院手術(shù)證實(shí)的120例甲狀腺乳頭狀癌(PTC)患者病理標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者手術(shù)前未進(jìn)行任何輔助治療,資料完整,知情同意自愿參與研究。排除標(biāo)準(zhǔn):合并嚴(yán)重心肝腎功能不全、其他惡性腫瘤、精神障礙、糖尿病、吸煙酗酒、妊娠期或哺乳期患者。所選患者中男24例,女96例,年齡28～57歲,平均年齡(41.33±9.01)歲,腫瘤直徑:<1.0cm 45例,≥1.0cm 75例,UICC分期:Ⅰ～Ⅱ期57例,Ⅲ～Ⅳ期63例,雙側(cè)累及63例,根據(jù)病灶是否突破甲狀腺被膜或有無(wú)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,分為侵襲組55例和惰性組65例。

1.2 檢測(cè)方法 DNA樣本提取:按照蠟切片樣品DNA提取試劑盒(型號(hào):FFPE DNA,Cat NO.ADx-FF01)說(shuō)明書提取樣本DNA,所提取的DNA質(zhì)量在超微量分光光度計(jì)(OD-2000TM)上檢測(cè),DNA模板濃度標(biāo)化(2.0ng/μl)。

BRAF V600E突變檢測(cè):使用美國(guó)Applied-Biosystems公司提供的熒光定量PCR系統(tǒng)并按照人BRAF基因V600E突變檢測(cè)試劑盒(ADx-BR01、ADxBR02)說(shuō)明書要求檢測(cè)BRAF基因突變,設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性質(zhì)控,按照說(shuō)明書要求判定結(jié)果:需滿足樣本、陽(yáng)性質(zhì)控的內(nèi)控信號(hào)升高,陽(yáng)性質(zhì)控的外控信號(hào)Ct值低于20,結(jié)果:樣本Ct值低于28則判定BRAF V600E突變,樣本Ct值28及以上則判定為未突變[4]。

TERT基因啟動(dòng)子突變檢測(cè):使用美國(guó)Applied-Biosystems公司提供的熒光定量PCR系統(tǒng),并按照人TERT基因啟動(dòng)子突變檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?貨號(hào):RPQ008)說(shuō)明書要求檢測(cè)TERT C228T和C250T突變,設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性質(zhì)控,按照說(shuō)明書要求判定結(jié)果:需滿足樣本、陽(yáng)性質(zhì)控的內(nèi)控信號(hào)升高,陰性對(duì)照內(nèi)、外控信號(hào)均未升高,陽(yáng)性質(zhì)控外控信號(hào)Ct值低于14,結(jié)果:樣本外控信號(hào)Ct值低于25則判定為基因突變,Ct值25及以上則判定為未突變[5]。

1.3 研究方法 對(duì)侵襲組與惰性組患者BRAFV600E、TERT啟動(dòng)子兩個(gè)位點(diǎn)突變陽(yáng)性率以及臨床因素(年齡、性別、腫瘤直徑、UICC 分期、雙側(cè)累及)進(jìn)行分析,并統(tǒng)計(jì)侵襲性的危險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果

2.1 侵襲組與惰性組患者臨床因素差異分析 侵襲組與惰性組患者性別、年齡、腫瘤直徑、UICC分期、雙側(cè)累及情況差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中侵襲組患者男性患病率更高,年齡更小,腫瘤直徑更大,UICC分期更高,雙側(cè)累及更多,見(jiàn)表1。

表1 侵襲組與惰性組患者臨床因素差異分析[n(%)]

2.2 侵襲組與惰性組患者BRAFV600E突變及TERT啟動(dòng)子突變基因差異分析 侵襲組患者BRAFV600E、TERT啟動(dòng)子突變率,以及BRAFV600E+TERT啟動(dòng)子同時(shí)突變率均顯著高于惰性組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 侵襲組與惰性組患者BRAFV600E突變及TERT啟動(dòng)子突變基因差異分析[n(%)]

2.3 甲狀腺乳頭狀癌侵襲性危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析 以PTC患者是否表現(xiàn)為侵襲性為應(yīng)變量Y,以性別、年齡、腫瘤直徑、UICC分期、雙側(cè)累及情況、BRAFV600E、TERT啟動(dòng)子突變情況作為自變量X進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果顯示:性別、年齡、腫瘤直徑、UICC分期、雙側(cè)累及情況、BRAFV600E、TERT啟動(dòng)子突變均進(jìn)入方程,且均為PTC患者侵襲性的危險(xiǎn)因素,見(jiàn)表3、表4。

表3 甲狀腺乳頭狀癌侵襲性危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析賦值表

表4 甲狀腺乳頭狀癌侵襲性危險(xiǎn)因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

根據(jù)甲狀腺癌治療指南建議,病灶已經(jīng)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移侵襲性PTC患者推薦采取手術(shù)治療,而對(duì)于病灶未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者推薦采取隨訪觀察,隨訪期間若發(fā)展為侵襲性PTC則給予手術(shù)治療也可[6-7]。因此,如何及早診斷PTC患者的侵襲性是臨床上的一大難點(diǎn),既往多采取超聲、單一基因檢測(cè)(BRAFV600E、TERT啟動(dòng)子),預(yù)測(cè)價(jià)值較低,難以準(zhǔn)確地區(qū)分PTC患者的侵襲性,本研究旨在檢測(cè) BRAFV600E突變及TERT啟動(dòng)子突變,對(duì)侵襲組與惰性組之間的BRAFV600E、TERT啟動(dòng)子兩個(gè)位點(diǎn)突變陽(yáng)性率以及臨床因素進(jìn)行分析,并統(tǒng)計(jì)侵襲性的危險(xiǎn)因素,探討其判斷PTC患者侵襲性的價(jià)值,為臨床上選擇合適的方式治療PTC患者提供依據(jù)。

本研究納入樣本120例,侵襲組55例,占45.83%,僅發(fā)生突破甲狀腺被膜10例,僅發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例,同時(shí)突破甲狀腺被膜和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例,惰性組65例,占54.17%,侵襲組男性發(fā)病率為62.50%顯著提高(P<0.05),表明男性PTC患者表現(xiàn)為侵襲性的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于女性,侵襲組患者平均年齡為(38.27±8.26)歲顯著較低(P<0.05),表明PTC患者侵襲性的發(fā)生更傾向于年輕人,腫瘤直徑>1cm中60%的患者表現(xiàn)為侵襲,腫瘤直徑<1cm中29.82%表現(xiàn)為侵襲,UICC分期Ⅲ～Ⅳ期60.32%患者表現(xiàn)為侵襲,Ⅰ～Ⅱ期29.82%患者表現(xiàn)為侵襲,且累及雙側(cè)的患者中有63.49%表現(xiàn)為侵襲,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Logistic回歸分析顯示:PTC患者性別、年齡、腫瘤直徑、UICC分期、雙側(cè)累及情況均為PTC患者表現(xiàn)為侵襲性的危險(xiǎn)因素,表明腫瘤直徑越大、UICC分期越高、累及雙側(cè)越多,表現(xiàn)為侵襲性的風(fēng)險(xiǎn)越大,與腫瘤進(jìn)展有關(guān),不斷惡化,PTC患者逐漸表現(xiàn)為侵襲性[8]。

目前PTC分子標(biāo)記物較多,尤其是BRAFV600E、TERT啟動(dòng)子(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)在PTC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,可作為判定PTC預(yù)后的重要分子標(biāo)志物,侵襲組患者BRAFV600E、TERT啟動(dòng)子突變率顯著高于惰性組,且Logistic回歸分析也表明本研究顯示:BRAFV600E、TERT啟動(dòng)子突變均是PTC患者表現(xiàn)為侵襲性的危險(xiǎn)因素,與既往研究一致[9]。研究表明:BRAFV600E、TERT啟動(dòng)子同時(shí)突變的甲狀腺患者復(fù)發(fā)率極高,存活率與BRAFV600E、TERT啟動(dòng)子突變均相關(guān),兩個(gè)基因位點(diǎn)同時(shí)突變時(shí),PTC患者的臨床病理特征最差,尤其是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和甲狀腺腺外[10],本研究Logistic回歸分析顯示:BRAFV600E、TERT啟動(dòng)子突變、BRAFV600E+TERT啟動(dòng)子同時(shí)突變均為PTC患者變現(xiàn)為侵襲性的危險(xiǎn)因素,且BRAFV600E+TERT啟動(dòng)子同時(shí)突變的OR值最大,表明BRAFV600E+TERT啟動(dòng)子同時(shí)突變時(shí),PTC患者表現(xiàn)為侵襲性的風(fēng)險(xiǎn)最大,BRAFV600E+TERT啟動(dòng)子同時(shí)突變,TERT mRNA表達(dá)水平異常增高,與BRAFV600E突變導(dǎo)致的MAPK通路異常激活,促使細(xì)胞無(wú)限分裂、增殖,細(xì)胞極易發(fā)生端粒危機(jī),TERT啟動(dòng)子發(fā)生突變的概率增加,活化端粒酶,保證細(xì)胞的永生化,并且BRAFV600E突變?cè)斐蒃TS轉(zhuǎn)錄因子增加,結(jié)合在TERT啟動(dòng)子突變后產(chǎn)生的新位點(diǎn)上,增強(qiáng)TERT的轉(zhuǎn)錄活性[11]。

綜上所述,聯(lián)合BRAFV600E突變及TERT啟動(dòng)子突變與甲狀腺乳頭狀癌侵襲性相關(guān),雖然機(jī)制尚未明確,但可以作為判斷PTC患者侵襲性的分子標(biāo)志物,同時(shí)也要適當(dāng)考慮患者的年齡、性別、腫瘤直徑、UICC分期、雙側(cè)累及情況,為PTC患者治療方案的選擇提供依據(jù)。