溶血情況對(duì)免疫比濁法檢測(cè)過(guò)敏原IgE水平的影響分析

潘仁霞 陳麗惠 郭欽玉

平潭綜合實(shí)驗(yàn)區(qū)醫(yī)院檢驗(yàn)科,福建省平潭縣 350499

過(guò)敏性疾病是一種發(fā)展迅速的多系統(tǒng)綜合征,嚴(yán)重者甚至引起過(guò)敏性休克,威脅患者生命安全[1]。作為典型總免疫球蛋白E(Immu-noglobulin E,IgE)介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)關(guān)鍵介質(zhì),IgE在臨床被作為診斷過(guò)敏性疾病的生物指標(biāo)。熒光酶免疫法是血清IgE體外測(cè)定的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但該檢查方法對(duì)儀器、環(huán)境、試劑要求嚴(yán)苛,且檢驗(yàn)價(jià)格昂貴導(dǎo)致部分醫(yī)療機(jī)構(gòu),尤其是基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)選擇免疫比濁法檢測(cè)[2]。以往研究發(fā)現(xiàn),血液樣本溶血會(huì)干擾免疫比濁法分析結(jié)果[3]。而在臨床實(shí)際工作中,血液樣本不可避免地受到采集方法、保存等的影響出現(xiàn)溶血。因此,有必要探明溶血對(duì)血清IgE分析的干擾,并找出減少溶血血樣中干擾的有效方法。鑒于此,本研究納入過(guò)敏性疾病患者血液樣本,旨在探討溶血情況對(duì)免疫比濁法檢測(cè)過(guò)敏原IgE水平的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2022年1—5月我院49例過(guò)敏性疾病患者為觀察對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合過(guò)敏性疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn),年齡20～50歲;(2)簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他免疫性疾病者;(2)入組前1周使用相關(guān)抗過(guò)敏藥物者;(3)合并血液性疾病,凝血功能障礙等影響患者血清IgE測(cè)量水平的疾病者。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑。試劑:IgE免疫比濁法試劑盒及IgE標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)自Beckman Coulter。主要組成包括:反應(yīng)緩沖液、鼠抗人IgE單克隆抗體乳膠粒、校準(zhǔn)人IgE、牛血清白蛋白。儀器:Beckman Coulter IMMAGE 800特定蛋白分析儀。

1.2.2 血液樣本制備。采集49例過(guò)敏性疾病患者血液樣本10ml,取1ml未溶血的血液,在3 000g的離心條件下離心20min后取上清液,作為未溶血血清標(biāo)本;另取1ml未溶血的血液在-20℃冷凍,并在室溫(約24℃)下緩慢解凍五個(gè)循環(huán),以制備完全溶血的血液樣本。后取2ml未溶血血液以3 000g離心10min,收集所有上層血清作為用于總IgE分析和制備不同水平溶血血清樣品。將剩下血細(xì)胞與生理鹽水溶液混合至總體積為5ml,然后將混合物以3 000g離心10min,收集下層血細(xì)胞,棄去上清液,在混合—離心—丟棄的五個(gè)循環(huán)后,最終確保上清液總IgE濃度<0.1IU/ml。將反復(fù)洗滌后收集的血細(xì)胞通過(guò)反復(fù)凍融(參考完全溶血血液樣本制作),制備濃縮的溶血血樣,測(cè)定血紅蛋白濃度。根據(jù)血紅蛋白濃度,選取不同體積的濃縮溶血血樣和血清配比,制備血紅蛋白濃度分別為10g/L、20g/L、50g/L、100g/L、120g/L、150g/L、200g/L,體積均為200μl的不同溶血樣本。樣本制備完成后儲(chǔ)存在-80℃,用于IgE的檢測(cè)分析。

1.2.3 血清IgE測(cè)量。所有不同溶血水平的樣本均根據(jù)檢驗(yàn)操作流程采用免疫比濁法測(cè)定血清總IgE。

2 結(jié)果

2.1 不同程度溶血過(guò)敏原IgE水平的影響 混合物中總IgE的測(cè)試濃度低于相應(yīng)的計(jì)算濃度,并且|偏差(%)|隨著溶血水平的增加而增加,表明溶血對(duì)通過(guò)免疫比濁法檢測(cè)的血清IgE分析產(chǎn)生負(fù)面干擾,并且溶血越嚴(yán)重,干擾越大,見表1。

表1 不同溶血程度血清的測(cè)試濃度、計(jì)算濃度和|偏差(%)|(n=49)

2.2 稀釋后計(jì)算濃度與血清濃度差異 將49例完全溶血樣本[HB:(135.27±43.37)g/L]用9倍體積的生理鹽水自動(dòng)稀釋至最終血紅蛋白濃度低于20g/L[HB(13.71±4.52)g/L]。結(jié)果顯示:稀釋后樣本測(cè)試濃度乘以10得出計(jì)算濃度(范圍:1.74～541.00IU/ml,中值:21.33IU/ml),顯著低于血清總IgE濃度(范圍:3.62～943.79IU/ml,中值:40.13IU/ml)(P<0.05),表明僅稀釋完全溶血的血液不能用于估計(jì)血清IgE水平。

2.3 完全溶血血液和血清總IgE濃度的線性回歸分析 對(duì)所有49個(gè)樣本進(jìn)行了線性回歸分析,結(jié)果顯示完全溶血血液總IgE的測(cè)試濃度(x)與相應(yīng)血清總IgE的測(cè)試濃度(y)顯示正相關(guān),回歸公式為y=1.721x+5.78(r=0.572),見圖1。使用回歸公式矯正完全溶血血液總IgE的測(cè)試濃度,并獲得矯正后的濃度(范圍:19.53～933.57IU/ml,中位數(shù):52.25IU/ml),該濃度與血清總IgE的濃度無(wú)顯著差異(P=0.435),見圖2。證實(shí)用稀釋矯正法獲得的矯正濃度來(lái)估計(jì)血清IgE水平的可行性。

圖1 完全溶血血液和相應(yīng)血清中總IgE濃度的線性回歸分析

圖2 血清和完全溶血血液總IgE的濃度及矯正后的濃度

2.4 矯正濃度的診斷能力驗(yàn)證 為了進(jìn)一步驗(yàn)證矯正濃度的有效性,比較了血清、完全溶血血液和矯正濃度總IgE診斷能力,結(jié)果顯示:矯正濃度診斷的AUC為0.892,完全溶血血液為0.828,血清為0.908,表明通過(guò)稀釋矯正方法獲得的矯正濃度具有與血清相同的診斷能力。見圖3。

圖3 矯正濃度IgE對(duì)過(guò)敏性疾病診斷能力驗(yàn)證

3 討論

IgE是在過(guò)敏原等刺激物刺激人體后,人體漿細(xì)胞與B細(xì)胞釋放的過(guò)敏性介質(zhì),由于過(guò)敏性疾病缺乏特異性形態(tài)學(xué)改變,導(dǎo)致IgE成為過(guò)敏性疾病診斷與治療過(guò)程中重要的參考指標(biāo)[4]。免疫比濁法是測(cè)量血清IgE的重要手段,但有研究指出,血清IgE含量極低,檢測(cè)難度大,而獲取的血液樣本溶血后血細(xì)胞釋放的胞內(nèi)物質(zhì)可能影響血清IgE的濃度,進(jìn)而影響血清IgE測(cè)量水平[5]。然而,臨床實(shí)際工作中,血液樣本溶血無(wú)可避免,因此,探明溶血對(duì)免疫比濁法測(cè)量血清IgE分析的干擾,對(duì)提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性具有重要意義。

本研究結(jié)果表明,不同溶血程度血液樣本總IgE均低于血清樣本測(cè)試濃度,溶血對(duì)免疫比濁法檢測(cè)的血清IgE分析產(chǎn)生負(fù)面干擾,并且溶血越嚴(yán)重,干擾越大。通常情況下血液中正常的血紅蛋白濃度男性為130～160g/L,女性為120～150g/L,在通過(guò)免疫比濁法進(jìn)行分析時(shí),由于溶血干擾,完全溶血的血液樣品總IgE減少約20%。此外,溶血后血細(xì)胞釋放的血紅蛋白會(huì)干擾抗原和抗體的結(jié)合影響檢測(cè)的進(jìn)程,溶血后血細(xì)胞釋放的胞內(nèi)物質(zhì)還可能影響血清生物標(biāo)志物的濃度[6];同時(shí)血紅蛋白在光譜中具有強(qiáng)吸收峰,影響檢測(cè)結(jié)果讀取[7]。

本研究通過(guò)稀釋完全溶血血液分析稀釋法是否能用于血清IgE水平檢測(cè),評(píng)估發(fā)現(xiàn),完全溶血血液總IgE的測(cè)試濃度(根據(jù)稀釋換算)比血清濃度低,推測(cè)可能的原因?yàn)槿苎笱?xì)胞釋放的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)可能有助于稀釋血清總IgE,導(dǎo)致完全溶血血液總IgE的測(cè)試濃度比血清濃度低大約2倍。在臨床上若通過(guò)測(cè)量完全溶血血液總IgE的測(cè)試濃度高于臨界值,則結(jié)果可被視為陽(yáng)性,但若完全溶血血液測(cè)試濃度低于臨界值,則不能排除假陰性值。因此,僅稀釋的完全溶血血液不能用于估計(jì)血清IgE水平。既往研究也指出,溶血可影響血清生物標(biāo)志物的測(cè)量[8]。線性回歸分析顯示完全溶血血液總IgE的測(cè)試濃度與相應(yīng)血清總IgE的測(cè)試濃度呈正相關(guān)(r=0.572),使用回歸公式矯正完全溶血血液總IgE的測(cè)試濃度顯示,矯正完全溶血血液總IgE濃度與血清總IgE的濃度無(wú)顯著差異,ROC曲線分析顯示,矯正濃度診斷能力與血清IgE相當(dāng)。因此,筆者認(rèn)為,當(dāng)溶血嚴(yán)重且血清不可用時(shí),矯正后的完全溶血血液總IgE濃度可用于評(píng)估血清中總IgE的濃度以進(jìn)行診斷。

綜上所述,僅稀釋的完全溶血血液不能用于估計(jì)血清IgE水平,但用矯正法獲得的矯正濃度來(lái)可用于估計(jì)血清IgE水平,且矯正完全溶血血液IgE濃度具有與血清相同的診斷能力。