中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑對南美白對蝦的安全性評價

張銘林，歐夢馨，謝映紅，肖 琦，周琳玉，謝小東，胡庭俊

（ 廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 53005 ）

南美白對蝦是世界上體型最大、產(chǎn)量最高的對蝦之一，具有肉質(zhì)鮮美、生長迅速、營養(yǎng)豐富等特點，其產(chǎn)量占全球?qū)ξr產(chǎn)量的80%以上[1]。近年來，南美白對蝦的養(yǎng)殖規(guī)模和密度不斷增大，養(yǎng)殖池中大量的飼料、對蝦排泄物、殘留飼料等可導(dǎo)致養(yǎng)殖水體惡化，威脅對蝦健康[2]。采用傳統(tǒng)的抗生素防治疾病，使病原菌對抗生素產(chǎn)生抗藥性[3]。因此，人們更加關(guān)注替代抗生素的疾病防治方法。其中草藥微生態(tài)制劑結(jié)合了中草藥和益生菌的雙重優(yōu)勢，不僅具備提高動物生長性能、免疫功能、抗氧化和抗炎能力[4]，還能夠通過抑制病原菌、增強(qiáng)免疫反應(yīng)提高機(jī)體的抗病力[5]，因而受到廣泛關(guān)注。本實驗室通過將山藥、馬齒莧等中草藥和枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等益生菌配制而成一劑中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑，并在前期研究中發(fā)現(xiàn)該制劑能夠有效增強(qiáng)南美白對蝦的生長性能和免疫功能水平[6]。為進(jìn)一步探究中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑作用于南美白對蝦的安全劑量范圍，證明中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑對于南美白對蝦的安全性，本試驗通過觀察對蝦在超過推薦劑量下的生長性能、臨床表現(xiàn)、血液生化指標(biāo)和病理組織學(xué)分析，對該制劑的安全性進(jìn)行評價，為后續(xù)的臨床應(yīng)用開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥物

中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑含有山藥、馬齒莧、黃精等中藥和枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等益生菌菌粉，由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實驗室配制。

1.1.2 試驗動物

試驗用南美白對蝦750 尾，體重（2.0±0.3） g，體長（5.0±1.0） cm，來自廣西東興南美白對蝦養(yǎng)殖基地。對蝦臨床表現(xiàn)健康，采食正常，蝦線正常。

1.1.3 試劑與儀器

總蛋白定量（TP）、白蛋白（ALB）、肌酐（CREA）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；飼料專用黏合劑購自北京鑫洋水產(chǎn)高新技術(shù)有限公司；檸檬酸三鈉（分析純）購自北京索萊寶科技有限公司；Bouin's固定液購自北京索萊寶科技有限公司。

UV-1750 型紫外可見光分光光度計（島津公司）、Multimode Plate Reader 酶標(biāo)儀（PerkinElmer）、Direct-Q 5UV 純水系統(tǒng)（Merck Millipore）、AB104-L 電子分析天平（梅特勒-托利多）、3K-15 臺式高速冷凍離心機(jī)（Sigma）、HH-S2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療器械廠）、ZT-12M2自動生物組織病理脫水機(jī)（孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）、YB-6LF 生物組織包埋機(jī)（孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）、LEICA RM2245半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（徠卡公司）、YT 型生物組織攤烤片機(jī)（孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）、YR-21 生物組織切片染色機(jī)（孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）、光學(xué)顯微鏡（Nikon eclipse 80i）。

1.2 試驗飼料制備

根據(jù)實驗室前期研究，中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑的臨床推薦劑量為每1 kg 飼料中添加10 g。飼料制備時按照比例準(zhǔn)確稱取中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑和南美白對蝦商品料后，再按照飼料專用黏合劑說明書用量稱取適量黏合劑加入復(fù)方制劑中，隨后添加適量純水迅速攪拌均勻呈稀糊狀，最后混合入稱取的南美白對蝦商品料中，充分翻拌混勻，使復(fù)方制劑包裹在蝦飼料上，在通風(fēng)處晾干。

1.3 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

750 尾南美白對蝦隨機(jī)分為5 組，每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)150尾蝦。設(shè)置1個空白對照組和4個試驗劑量組，各試驗組添加中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑劑量分別為推薦劑量的1、3、5、10倍劑量。試驗分組及處理見表1。

表1 試驗分組及處理Tab.1 Grouping and treatment of experimental animals

養(yǎng)殖試驗在廣西東興市鴻生實業(yè)有限公司的室內(nèi)專業(yè)養(yǎng)殖車間進(jìn)行，試驗蝦養(yǎng)殖于2 m×2 m專業(yè)養(yǎng)殖池內(nèi)，水深0.8 m左右。將750尾試驗蝦隨機(jī)分到15個小養(yǎng)殖池內(nèi)，每個小養(yǎng)殖池50尾，試驗開始前正常養(yǎng)殖7 d以適應(yīng)環(huán)境。養(yǎng)殖用水為過濾海水，水溫（28±2） ℃，pH值8.0～8.4，24 h充氧，鹽度為23.0‰，每天清污一次，每兩天換水一次，每次換水量1/4。各組投喂相應(yīng)的試驗飼料，每天投喂4次（時間分別為8:00、12:00、17:00、22:00），每天投喂量為蝦體重的1%～3%，投喂1 h后清除剩余飼料。試驗期30 d。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 臨床體征觀察

從給藥開始連續(xù)觀察30 d，每日觀察受試蝦的臨床表現(xiàn)、采食與排便的情況并記錄。

1.4.2 體重與體長

用藥后第15 和第30 d 時，每組隨機(jī)撈取30 尾受試蝦測定體重和體長，并計算30 d 的平均增重率和平均增長率。同時完整剖取出受試蝦的肝胰腺，稱量后用Bouin's固定液固定，計算肝胰腺的臟器指數(shù)。

1.4.3 血液生化指標(biāo)

用藥后第15和第30 d時，每組隨機(jī)撈取30尾蝦抽血。用75%酒精將南美白對蝦的腹血竇部位消毒，先抽取適量預(yù)冷的抗凝劑（5%檸檬酸三鈉），在與蝦體成45°左右的方向進(jìn)針抽取受試蝦血液，將血液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 滅菌EP 管中混勻，抗凝劑補(bǔ)足體積至與血液體積比為1∶1，-40 ℃保存。測定TP、ALB、CREA、ALT、AST 和TG 等指標(biāo)，測定方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，注意先進(jìn)行預(yù)試驗確認(rèn)測試濃度，若需要稀釋可用生理鹽水。

1.4.4 組織病理學(xué)檢查

取固定好的肝胰腺，通過酒精逐級脫水、石蠟切片、蘇木素伊紅（HE）染色、脫水封片等步驟進(jìn)行病理組織切片制作，觀察肝胰腺組織形態(tài)是否發(fā)生變化,并采集圖像。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan's 法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著 。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑對南美白對蝦臨床表現(xiàn)的影響

試驗期內(nèi)，各池中南美白對蝦攝食情況良好，運動活躍，蝦線呈正常的棕黑色，流暢無斷節(jié)，糞便粗細(xì)均勻，顏色正常，長度1～2 cm，無異常氣味，未出現(xiàn)中毒表現(xiàn)。

2.2 中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑對南美白對蝦體指數(shù)的影響（見表2、表3）

表2 中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑對南美白對蝦體重及肝胰腺指數(shù)的影響Tab.2 Effects of Chinese herbal microecological compound preparation on body weight and hepatopancreas index of Penaeus vannamei

表3 中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑對南美白對蝦體長的影響Tab.3 Effect of Chinese herbal microecological compound preparation on body length of Penaeus vannamei

由表2可知，用藥后第15 d時，Ⅱ組、Ⅲ組對蝦的體重顯著高于Ⅰ組（P＜0.05），Ⅳ組對蝦的體重極顯著高于Ⅰ組（P＜0.01）；用藥后第30 d時，Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組的體重極顯著大于Ⅰ組（P＜0.01）。用藥后第30 d時，Ⅱ組平均增重率最大（199.06%），Ⅰ組最小，僅有115.09%。

由表3可知，用藥后第15 d時，Ⅱ組、Ⅲ組對蝦的體長顯著高于Ⅰ組（P＜0.05），Ⅳ組的體長極顯著高于Ⅰ組（P＜0.01）；用藥后第30 d時，Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組的體長極顯著高于Ⅰ組（P＜0.01）。用藥后第30 d，Ⅲ組的平均增長率最大，為49.61%；Ⅰ組的平均增長率最小，為37.07%。

2.3 中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑對南美白對蝦血液生化指標(biāo)的影響（見表4～表6）

表4 中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑對南美白對蝦血液TP和ALB含量的影響Tab.4 Effect of Chinese herbal microecological compound preparation on blood TP and ALB content of Penaeus vannamei

由表4 可知，用藥后第15 d 時，Ⅴ組對蝦血液TP 和ALB 含量均顯著低于Ⅰ組（P＜0.05）。用藥后第30 d 時，Ⅳ組和Ⅴ組對蝦血液TP含量極顯著性高于Ⅰ組（P＜0.01），Ⅳ組的ALB 含量極顯著高于Ⅰ組（P＜0.01），Ⅴ組的ALB含量顯著高于Ⅰ組（P＜0.05）。

由表5可知，用藥后第15 d，Ⅱ組對蝦血液ALT活性、Ⅳ組對蝦血液AST 活性極顯著低于Ⅰ組（P＜0.01），Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組對蝦血液ALT 活性及Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅴ組對蝦AST活性均顯著低于Ⅰ組（P＜0.05）。

表5 中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑對南美白對蝦血液ALT和AST活性的影響Tab.5 Effect of Chinese herbal microecological compound preparation on the activity of ALT and AST in blood of Penaeus vannamei

由表6 可知，用藥第15 d，與Ⅰ組相比，Ⅲ組和Ⅴ組對蝦血液CREA 含量顯著降低（P＜0.05）；Ⅱ組TG 含量顯著降低（P＜0.05），Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組極顯著降低（P＜0.01）。

表6 中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑對南美白對蝦血液CREA和TG含量的影響Tab.6 Effects of Chinese herbal microecological compound preparation on blood CREA and TG content of Penaeus vannamei

2.4 組織病理學(xué)檢查（見圖1、圖2）

圖1 給藥15 d后南美白對蝦肝胰腺組織切片（HE 400×）Fig.1 Hepatopancreas tissue section of Penaeus vannamei 15 d after administration（ HE 400×）

解剖可見各組對蝦肝胰腺均未見明顯病變，外層白色薄膜包裹內(nèi)層組織，外觀正常。

由圖1、圖2可知，各劑量組與空白對照組對蝦肝胰腺細(xì)胞核、質(zhì)清晰，組織飽滿，管腔呈星形，小葉腔空隙正常，空泡數(shù)量無異常增多，肝胰腺小管未出現(xiàn)萎縮，未見異常病理變化。

3 討論

本研究采用中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑對南美白對蝦連續(xù)拌料飼喂30 d，評估其在臨床應(yīng)用中的安全性。結(jié)果表明，試驗期內(nèi)，受試蝦的攝食行為、運動行為正常，糞便的顏色、質(zhì)地、氣味也無異常，無中毒和死亡現(xiàn)象，表明中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑對南美白對蝦的臨床體征無不良影響。試驗期間，Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組對蝦體重和體長與Ⅰ組相比明顯增加，說明以1、3 和5 倍劑量的中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑拌料飼喂南美白對蝦能夠提高其生長性能，這與中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑中含有豐富的氨基酸、維生素與微量元素等有關(guān)。同時益生菌能夠調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)消化與吸收，使機(jī)體生長性能得到有效提升[7]，這種提升效果在仔豬[8]、產(chǎn)蛋雞[9]、鯉魚[10]等動物中均有報道。

試驗期間，Ⅴ組對蝦血液TP 和ALB 含量呈先下降后升高的趨勢，而Ⅳ組對蝦血液TP 和ALB 含量在用藥30 d時顯著高于Ⅰ組。由于血液TP由肝臟合成，且TP中包含ALB，因此TP 和ALB 的檢測結(jié)果能夠反映肝臟合成功能[11]。齊飛等[12]在飼料中添加1%復(fù)合芽孢桿菌制劑飼喂凡納濱對蝦，發(fā)現(xiàn)血液TP 和ALB 含量顯著上升。陳家祥等[13]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加地衣芽孢桿菌會提高肉雞血清ALB含量。上述研究結(jié)果均表明，中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑拌料飼喂對南美白對蝦血液TP和ALB含量無負(fù)面影響。

在甲殼動物中，機(jī)體肝臟組織受損時會影響肝臟內(nèi)氨基酸的代謝水平，同時大量的ALT 和AST 被釋放到血淋巴中[14]，導(dǎo)致血液AST 和ALT 活性顯著升高。本研究中，各劑量組對蝦血液AST 和ALT 活性均未明顯升高，肝胰腺指數(shù)也無明顯變化，肝胰腺組織顯微結(jié)構(gòu)與正常肝胰腺組織結(jié)構(gòu)相似，這些結(jié)果均證明中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑不會對南美白對蝦的肝胰腺組織造成損害。TG是南美白對蝦血脂的主要成分之一，主要由肝臟合成代謝，其數(shù)值變化能夠反映對蝦體內(nèi)脂代謝水平[15]。試驗期間，各劑量組對蝦血液TG 含量呈先下降后上升的趨勢，推測是由于中藥中的植物蛋白源導(dǎo)致機(jī)體TG含量短時間內(nèi)出現(xiàn)小范圍下降所致[16]。血液CREA 含量上升常提示機(jī)體存在潛在的腎功能代謝障礙[17]，而下降一般認(rèn)為無實際臨床意義。本研究中，各劑量組對蝦血液CREA 含量均低于Ⅰ組，與謝小東等[18]結(jié)果一致，說明中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑對南美白對蝦肝臟脂質(zhì)合成與代謝功能無明顯破壞作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，飼料中添加1倍、3倍、5倍和10倍推薦劑量的中草藥微生態(tài)復(fù)方制劑飼喂南美白對蝦30 d，不會對南美白對蝦的血液生化指標(biāo)造成不良影響，不會損害肝胰腺功能與組織結(jié)構(gòu)，且對南美白對蝦無毒副作用，使用安全，且對南美白對蝦的生長性能具有促進(jìn)作用。