8 種復(fù)方中藥液的生物活性及體外抗氧化能力研究

張紅艷，韓姍姍，冉淦僑，胡云紅，殷 紅，張 強(qiáng)*

（ 1. 陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，陜西 西安 710043 ； 2. 陜西省酶工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710043 ）

畜禽養(yǎng)殖過程中，機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)使畜禽的生產(chǎn)性能下降，進(jìn)而影響經(jīng)濟(jì)效益。良好的機(jī)體抗氧化水平對于動物抵御外界環(huán)境的劇烈變化具有積極影響[1]。目前，中草藥、生物發(fā)酵飼料、益生菌、酶制劑、酸化劑和植物提取物等綠色、健康、安全的飼料添加劑產(chǎn)品獲得高度關(guān)注。我國中草藥來源廣泛、價格低廉、毒副作用小，且富含皂苷、蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)和維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)以及多糖、黃酮類、生物堿、有機(jī)酸和揮發(fā)油等多種生物活性因子，能夠促進(jìn)動物生長發(fā)育、提高生產(chǎn)性能[2-3]。黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌和抗病毒等作用，可提高動物的生產(chǎn)性能，抑制脂肪酶表達(dá)，改良畜產(chǎn)品品質(zhì)，提升機(jī)體免疫能力，提高繁殖能力[4]。中藥植物次生代謝產(chǎn)物中多酚類化合物因具有良好的抗氧化和基因調(diào)控特性也成為最有前途的抗生素替代品之一[5]。我國《飼料原料目錄》中規(guī)定了可長期添加在飼料中使用的117種天然植物中藥，包括調(diào)節(jié)免疫的黃芪、金銀花、絞股藍(lán)、秦皮，抗菌抗病毒的杜仲、蒲公英、魚腥草、大蒜，抗機(jī)體應(yīng)激的黃芪、甘草、白術(shù)、五味子以及健胃促生長的山楂、神曲、麥芽、肉桂等。許多傳統(tǒng)中獸藥經(jīng)典方劑被實(shí)踐證明有效，藥物配伍合理，為中藥飼料添加劑的研究奠定了良好基礎(chǔ)[6]。中藥提取物是采用先進(jìn)工藝技術(shù)對中藥材或中藥復(fù)方進(jìn)行提取分離加工得到一種藥效相對明確的中藥產(chǎn)品。本文采用中藥提取物組配8種經(jīng)典中獸藥組方，檢測復(fù)方中藥液的活性物質(zhì)含量，對比不同組方中藥液的體外抗氧化能力，為開發(fā)畜禽強(qiáng)免疫無抗飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

27 種10∶1 比例提取物（黃連、薄荷、桔梗、黃芩、蒲公英、金銀花、黃檗、梔子、連翹、荊芥、半夏、甘草、當(dāng)歸、杜仲、茯苓、懷牛膝、白頭翁、秦皮、野菊花、黃芪、黨參、魚腥草、板藍(lán)根、大蒜、五倍子、大青葉、杏仁），購自西安天葉植物原料技術(shù)有限公司。

DPPH醇溶液（15 mg/500 mL）、ABTS粉末（分析純）購自飛凈生物科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，江西佰草源生物科技有限公司）、表兒茶素沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品（西安匯林生物科技有限公司）、鄰苯三酚（分析純，天津市華盛化學(xué)試劑有限公司）；其他常規(guī)試劑均為分析純。752紫外可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）、JA12002電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、KQ5200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、BCD-219K新飛電冰箱（河南新飛電器集團(tuán)股份有限公司）。

1.2 復(fù)方中藥液的制備

中藥復(fù)方依據(jù)中獸藥古方、化裁已有成方，由若干種中藥提取物組配而成。8種中藥復(fù)方主要成分見表1。

表1 8種中藥復(fù)方的提取物成分Tab.1 Extracts of eight traditional Chinese medicine compounds

1.3 生物活性物質(zhì)含量測定

1.3.1 總多酚含量

參考文獻(xiàn)[7]的方法稍做修改。用去離子水配制濃度為0.385 g/L 的表兒茶素沒食子酸酯的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取0.05、0.075、0.1、0.125、0.15 mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液至10 mL 容量瓶中，分別加入1 mL福林酚溶液、2.0 mL 15% Na2CO3溶液以蒸餾水定容至10 mL，40 ℃避光反應(yīng)40 min于760 nm處測定吸光度。以體系中標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，總多酚以表兒茶素沒食子酸酯計(jì)。分別吸取0.02 mL的復(fù)方中藥液，加入1 mL福林酚溶液、2.0 mL 15% Na2CO3溶液以蒸餾水定容至10 mL，40 ℃避光反應(yīng)40 min 于760 nm 處測定吸光度，重復(fù)3 次，取平均值。用標(biāo)準(zhǔn)曲線查得總多酚質(zhì)量后，再計(jì)算樣品的總多酚含量。

1.3.2 總黃酮含量

參考文獻(xiàn)[8]的方法稍做修改。稱取6.0 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照品，用30%乙醇溶解制成0.392 g/L 測定液，分別吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)測定液到10 mL容量瓶中，用30%乙醇稀釋定容。各吸取1 mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液于測定試管，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液、1 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻后靜置8 min，加入2 mL 10 g/100 mL 氫氧化鈉溶液，加蒸餾水定容。在510 nm 處測定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。分別吸取1 mL的復(fù)方中藥液，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液、1 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻后靜置8 min，加入2 mL 的10 g/100 mL 氫氧化鈉溶液，加蒸餾水定容。在510 nm 處測定吸光度，重復(fù)3 次，取平均值。用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同復(fù)方中藥液的總黃酮含量。

1.4 體外抗氧化能力測定

1.4.1 DPPH自由基清除能力

將各樣品稀釋成不同質(zhì)量濃度（0.1、0.5、1.0、2.0 和3.3 mg/mL），取3 mL于刻度試管中，加入15 mg/500 mL的DPPH-乙醇溶液3 mL，混勻，在室溫下避光放置30 min，測定517 nm下的吸光度，以1 g/L的維生素C（VC）溶液作陽性對照。用3 mL 水+3 mL 無水乙醇混合調(diào)零。每個樣品測定3次，取平均值。DPPH自由基清除率公式如下：

式中：A0為水+DPPH-乙醇溶液的吸光度；Ai為樣品+DPPH-乙醇溶液的吸光度；Aj為樣品+無水乙醇混合后的吸光度。

DPPH自由基半數(shù)清除濃度（IC50）計(jì)算：以lgC（樣品濃度，mg/mL）為橫坐標(biāo)，lgD（DPPH 自由基清除率，%）為縱坐標(biāo)得到雙對數(shù)線性方程，計(jì)算DPPH 自由基清除率為50%時的樣品質(zhì)量濃度，單位為mg/mL。

1.4.2 ABTS自由基清除能力

將50 mL 7.4 mol/L 的ABTS 和50 mL 2.6 mol/L 的過硫酸鉀溶液混合，于暗處放置12～16 h，制成ABTS儲備液。用60%乙醇稀釋，使儲備液吸光度在734 nm 下為（0.70±0.02），獲得ABTS工作液。將各樣品稀釋成不同質(zhì)量濃度（0.05～1.25 mg/mL），取1 mL 于刻度試管中，加入6 mL 的ABTS工作液，混合均勻，室溫避光放置6 min，測定734 nm下的吸光度，以1 mg/mL 的VC 溶液作陽性對照。60%無水乙醇調(diào)零。每個樣品測定3 次，取平均值。計(jì)算ABTS自由基清除率。

式中：A0為水+ABTS 工作液的吸光度；Ai為樣品+ABTS 工作液的吸光度；Aj為樣品+60%無水乙醇的吸光度。

ABTS 自由基IC50計(jì)算：以lgC（樣品濃度，mg/mL）為橫坐標(biāo)，lgD（ABTS 自由基清除率，%）為縱坐標(biāo)得到雙對數(shù)線性方程，計(jì)算ABTS自由基清除率為50%時的樣品質(zhì)量濃度，單位為mg/mL。

1.4.3 超氧陰離子自由基清除能力

各樣品稀釋成不同質(zhì)量濃度，分別取1 mL 不同濃度樣品溶液于試管中，分別加入4.5 mL、50 mmol/L、pH 值為8.2 的Tris-HCl 緩沖溶液和2 mL 3 mmol/L 的鄰苯三酚溶液搖勻，在37 ℃水浴15 min，加入1.0 mL濃鹽酸。325 nm處測量吸光度Ai，以1 mg/mL 的VC 溶液作陽性對照。用蒸餾水調(diào)零，每個樣品測定3次，取平均值。計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

式中：A0為蒸餾水代替樣品作為空白對照測定空白吸光度；Ai為樣品的吸光度；Aj為2 mL蒸餾水代替鄰苯三酚的吸光度。

超氧陰離子自由基IC50計(jì)算：以lgC（樣品濃度，mg/mL）為橫坐標(biāo)，lgD（超氧陰離子自由基清除率，%）為縱坐標(biāo)得到雙對數(shù)線性方程，計(jì)算超氧陰離子自由基清除率為50%時的樣品質(zhì)量濃度，單位為mg/mL。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種復(fù)方中藥液生物活性物質(zhì)的含量（見圖1）

圖1 8種復(fù)方中藥液生物活性物質(zhì)含量Fig.1 Content of bioactive substances in eight kinds of compound Chinese herbal solutions

由圖1 可知，8 種復(fù)方中藥液總多酚含量從大到小依次為：PHBQC＞SBZ＞W(wǎng)WXDY＞YQH＞YJL＞QWT＞HLJDS＞BTWS，其中PHBQC 中總多酚含量最高，達(dá)8.27 g/L；其次是SBZ，總多酚含量為6.82 mg/mL?？傸S酮含量從大到小依次為：YQH＞W(wǎng)WXDY＞PHBQC＞YJL＞QWT＞HLJDS＞SBZ＞BTWS，其中YQH 中的總黃酮含量達(dá)62.40 mg/mL，WWXDY的總黃酮含量也達(dá)到59.72 mg/mL，PHBQC、YJL和QWT的總黃酮含量分別為46.6、37.73、27.28 mg/mL。

2.2 8種復(fù)方中藥液體外自由基清除能力

2.2.1 8 種復(fù)方中藥液的體外DPPH 自由基清除能力（見圖2）

由圖2可知，8種復(fù)方中藥液的體外DPPH自由基清除能力依次為：YJL＞SBZ＞YQH＞PHBQC＞W(wǎng)WXDY＞QWT＞HLJDS＞BTWS，IC50依次為0.007、0.008、0.010、0.012、0.015、0.194、0.601、0.962 mg/mL，除HLJDS 和BTWS 外，其余6種藥液IC50均小于0.2 mg/mL。

2.2.2 8 種復(fù)方中藥液的體外ABTS 自由基清除能力（見圖3）

圖3 8種復(fù)方中藥液的體外ABTS自由基清除能力Fig.3 ABTS free radical scavenging ability of eight kinds of compound Chinese medicinal liquid in vitro

由圖3可知，8種復(fù)方中藥液的體外ABTS自由基清除能力依次為：WWXDY＞PHBQC＞YQH＞YJL=SBZ＞QWT＞HLJDS＞BTWS，IC50依次為0.171、0.190、0.308、0.348、0.348、0.469、1.114、2.07 mg/mL，HLJDS 和BTWS 的ABTS自由基清除力相對較弱。

2.2.3 8種復(fù)方中藥液的體外超氧陰離子自由基清除能力（見圖4）

圖4 8種復(fù)方中藥液的體外超氧陰離子自由基清除能力Fig.4 Superoxide anion free radical scavenging ability of eight kinds of compound Chinese medicinal liquid in vitro

由圖4 可知，8 種復(fù)方中藥液的體外超氧陰離子自由基清除能力為：PHBQC＞W(wǎng)WXDY＞YJL＞YQH＞HLJDS＞QWT＞SBZ＞BTWS，IC50為2.17、2.22、2.51、2.52、4.43、4.70、7.48、19.55 mg/mL，8 種中藥液的體外超氧陰離子自由基清除能力遠(yuǎn)不及對DPPH、ABTS自由基的清除能力。

整體來看，8 種復(fù)方中藥液的DPPH 自由基清除力優(yōu)于ABTS 自由基清除力，ABTS 自由基清除力優(yōu)于體外超氧陰離子自由基清除能力。8種復(fù)方中藥液中，PHBQC總多酚含量最高，為8.27 mg/mL，YQH 中的總黃酮含量最高，為62.40 mg/mL；體外DPPH 自由基清除能力最好的是YJL，其IC50為0.007 mg/mL；體外ABTS 自由基清除能力最好的是WWXDY，IC50為0.171 mg/mL；體外超氧陰離子自由基清除能力較好的是PHBQC，IC50為2.17 mg/mL。

2.3 8 種復(fù)方中藥液生物活性物質(zhì)含量與其抗氧化活性的相關(guān)性（見表2）

表2 8種復(fù)方中藥液生物活性物質(zhì)含量與抗氧化活性的相關(guān)系數(shù)Tab.2 Correlation coefficient between the content of bioactive substances and antioxidant activity in eight kinds of compound Chinese medicinal liquid

由表2 可知，復(fù)方中藥液中的總多酚含量與DPPH 自由基清除力、ABTS自由基清除力呈強(qiáng)相關(guān)性，與超氧陰離子自由基清除力呈中等相關(guān)性；總黃酮含量與DPPH 自由基清除力、ABTS自由基清除力、超氧陰離子自由基清除力均呈強(qiáng)相關(guān)性。

3 討論

8種復(fù)方中藥液中總多酚和總黃酮含量均占優(yōu)勢的是PHBQC、WWXDY、YQH、YJL。這幾組復(fù)方中藥組方由蒲公英、金銀花、板藍(lán)根、黃芩、甘草、野菊花、連翹、荊芥、薄荷、桔梗、黨參、黃芪、茯苓、杜仲、當(dāng)歸和懷牛膝中的若干種提取物組配而成，其中蒲公英、板藍(lán)根、黨參均含多酚化合物和黃酮類物質(zhì)，金銀花、甘草、黃芩、野菊花、黃芪、杜仲的黃酮類物質(zhì)含量較高，連翹富含多酚化合物，可見富含總黃酮物質(zhì)的中藥材種類多于富含多酚化合物的中藥材種類，故測得的總黃酮含量遠(yuǎn)高于總多酚。

中藥能夠提高動物機(jī)體的抗氧化能力，促進(jìn)畜禽日常健康生長，達(dá)到提高生產(chǎn)性能的功效，有益于健康養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。張建明等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在長江鱘幼魚基礎(chǔ)飼料中添加黃芪、黃檗、甘草等對其抗應(yīng)激和對抗氧化能力具有顯著的促進(jìn)作用。陳相如等[10]研究表明，拌料益生菌發(fā)酵補(bǔ)中益氣散300 mg/g可促進(jìn)小鼠腸道絨毛健康生長，提高機(jī)體抗氧化活性。周子暉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，蛋雞飼料中定期添加益母草、當(dāng)歸、杜仲、女貞子、蒲公英等組成的中藥組方對蛋雞生產(chǎn)性能、抗氧化能力及蛋品質(zhì)均具有提升效果。游斌杰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，中藥提取物可能通過增強(qiáng)雛雞的抗氧化能力促進(jìn)炎性相關(guān)因子的分泌、調(diào)節(jié)基因表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抗炎效果，抵抗傳染性法氏囊病病毒。崔宇擎等[13]研究了中藥復(fù)合小肽對肉雞抗氧化功能、消化酶活力、肉品質(zhì)和表觀代謝率的影響，結(jié)果表明，中藥復(fù)合小肽可提高肉雞體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消化沉積和抗氧化能力，其中以500 g/t 作為肉雞飼料添加劑的添加量最佳。王艷豐等[14]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加中藥復(fù)方可顯著提高生長肥育豬的免疫功能和抗氧化活性，添加比例以1.0%和1.5%為宜。陳艷新等[15]研究結(jié)果顯示，添加以黃芪、五味子、益母草等7味中藥材配伍制成中藥復(fù)合制劑可有效提高蛋雞生產(chǎn)性能，改善雞蛋品質(zhì)，提高雞蛋營養(yǎng)價值。

復(fù)方中藥液中總多酚含量與DPPH 自由基清除力、ABTS 自由基清除力呈強(qiáng)相關(guān)性，與超氧陰離子自由基清除力呈中等相關(guān)性；總黃酮含量與DPPH 自由基清除力、ABTS 自由基清除力、超氧陰離子自由基清除力均呈強(qiáng)相關(guān)性。周帆等[16]在提取石榴皮中總多酚的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，總多酚含量越高，體外清除DPPH自由基清除率越高，抗氧化活性越強(qiáng)。閆旭宇等[17]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉中總黃酮對羥基自由基的清除效果與總黃酮濃度呈正相關(guān)。李曉東等[18]研究發(fā)現(xiàn)，甘青青蘭抗氧化活性成分可能為酚酸類和黃酮類化合物，其總黃酮和總多酚含量與其抗氧化活性具有一定相關(guān)性。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)研究報(bào)道結(jié)論一致。植物多酚因可使未成對電子離域而具有較強(qiáng)活性，可通過清除自由基、螯合金屬離子、抑制氧化酶活性而起到抗氧化作用[19]。黃酮類化合物因酚羥基上的氫原子可與過氧自由基結(jié)合生成黃酮自由基，與其他自由基反應(yīng)，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[20]。由于多酚類化合物和黃酮類化合物具有較多的生物學(xué)活性功能，對畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)具有積極的促進(jìn)作用，在飼料添加劑領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，8 種復(fù)方中藥液中總多酚和總黃酮含量均占優(yōu)勢的是PHBQC、WWXDY、YQH、YJL，可作為增強(qiáng)畜禽機(jī)體免疫力的飼料添加劑使用。組方中總多酚與總黃酮的含量可作為今后篩選畜禽中草藥無抗飼料添加劑的一項(xiàng)性能指標(biāo)。