胸膜肺炎放線桿菌ApxⅡ蛋白重組腺病毒載體構(gòu)建及免疫原性研究

顏運秋，黎滿香，趙梟健，龍 娉

（ 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128 ）

豬傳染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（APP）引起的一種豬呼吸系統(tǒng)的接觸性傳染病，急性型會導(dǎo)致豬突然死亡[1]，是豬場重點防控的疾病之一[2-4]。目前，疫苗防控是預(yù)防PCP 的主要途徑，國內(nèi)市場上針對PCP的疫苗主要為滅活疫苗，但因交叉保護力不夠等原因?qū)е聹缁钜呙缡褂貌⒉黄毡?。此外，口服疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗等可能具有顯著的防控效果，有望解決傳統(tǒng)疫苗存在的非特異性反應(yīng)強、免疫效果不確實、保護期短等問題而受到廣泛關(guān)注[5]。因此，研發(fā)有效的新型APP疫苗非常迫切。

APP 的侵襲力和持久性與眾多毒力因子相關(guān)，Apx 毒素是其主要的毒力因子之一[6]。Apx毒素包括ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ，其中各型APP的ApxⅡ基因序列幾乎完全一致，可作為疫苗的候選基因。重組五型腺病毒載體在新冠肺炎疫苗研究和臨床應(yīng)用中顯示出很高的安全性和良好的免疫原性[7-8]，在獸醫(yī)中的研究也較多。肖莉等[9]構(gòu)建了輪狀病毒（PoRV）VP4 基因的重組腺病毒rAd-VP4，免疫豬后分別在第42和28 d產(chǎn)生較高的免疫球蛋白G（IgG）抗體水平，表明rAd-VP4可開發(fā)成PoRV的候選疫苗。王燦燦等[10]研究表明，口蹄疫病毒衣殼蛋白的重組腺病毒免疫小鼠后可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的特異性抗體以及干擾素-γ（γ-IFN）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）應(yīng)答反應(yīng)，表明該重組腺病毒具有良好的免疫原性。本研究將APP的ApxⅡ基因克隆到pDC316 穿梭載體，與腺病毒骨架載體pBHGlox(delta)E13Cre 共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，獲得攜帶放線桿菌APXⅡ基因的重組腺病毒載體疫苗rAd-APXⅡ，免疫小鼠后通過檢測血清中ApxⅡ特異性抗體水平以及IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗體水平判斷疫苗的免疫效果，以期為新型APP疫苗的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒及細(xì)胞株

大腸桿菌DH5α、腺病毒穿梭載體pDC316 和腺病毒骨架載體pBHGlox(delta)E13Cre由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存。HEK293腺病毒包裝細(xì)胞購自ATCC。

1.1.2 試劑、試劑盒和引物

EcoRI、XhoI、T4 DNA 連接酶及Taq DNA 聚合酶（TaKaRa 公司）；轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000（Invitrogen 公司）。DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶溶液（Hyclone公司）；胎牛血清FBS 和雙抗（青霉素/鏈霉素）溶液（Gibco 公司）；小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3 ELISA 檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。其余試劑均為分析純。

引物為F：GTTCTCGAGACCATGGTAATGTCAAAA ATCACTTTGTC；R：GGGGAATTCTCAGTAGATGCGATTAATGCAGCGA，由通用生物（安徽）有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 pDC316-APXⅡ載體構(gòu)建和鑒定

用引物F/R 擴增APP 基因組DNA 中的APXⅡ基因，將其亞克隆到pDC316 載體中的EcoRI 和XhoI 酶切位點中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，提取陽性克隆pDC316-APXⅡ的質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定。

反應(yīng)體系（20 μL）：pDC316-APXⅡ 6 μL、EcoRI 1 μL、Xho I 1 μL、10×Buffer 2 μL、H2O 10 μL。上述酶切體系37 ℃水浴反應(yīng)30 min 后，進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。陽性克隆命名為pDC316-APXⅡ。

1.2.2 rAd-APXⅡ重組病毒包裝、純化和病毒滴度測定

采用中提試劑盒提取pDC316-APXⅡ和pBHGlox(delta)E13Cre 的質(zhì)粒。在10 cm 培養(yǎng)皿里種1×106個HEK293 細(xì)胞，培養(yǎng)到細(xì)胞鋪滿皿底約80%～90%。使用Lipo2000脂質(zhì)體進行轉(zhuǎn)染，取1 μg pDC316-APXⅡ質(zhì)粒和3 μg pBHGlox(delta)E13Cre 的質(zhì)粒加入0.5 mL 無血清的DMEM培養(yǎng)基，同時取10 μL Lipo2000加入0.5 mL無血清的DMEM 培養(yǎng)基中室溫靜置10 min。將質(zhì)粒溶液逐滴加入含Lipo2000的溶液中，混勻，室溫靜置15 min；之后溶液加入HEK293 細(xì)胞中，6 h 換含10%FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞長滿后按1∶3 進行傳代，培養(yǎng)基為10%FBS 的完全培養(yǎng)基；傳代3 d 后，每天觀察細(xì)胞病態(tài)反應(yīng)（CPE）；當(dāng)細(xì)胞有明顯的CPE現(xiàn)象，且50%以上脫壁時即收細(xì)胞進行裂解收集病毒。再次放大培養(yǎng)，接種病毒，收集細(xì)胞沉淀，用PBS洗3遍，按照細(xì)胞培養(yǎng)上清的1/10體積加入PBS進行細(xì)胞重懸，-80、37 ℃反復(fù)凍融3次，離心，收集上清。

采用定量PCR 方法測定病毒滴度。引物序列如下：APX Ⅱ -120F：5'-AGAAAGCTGCCGCAGGTGTA-3'，APXⅡ-120R：5'-CGACAGGACCAGTTGAAGACAA-3'，APX Ⅱ-120PROBE：5'-FAM-ATAGGTAATGTAACAAAAGCGGT-BHQ1-3'。反應(yīng)體系：2×PCR mix 10 μL、APXⅡ-120F 1 μL、DNA 2 μL、H2O 5 μL、APXⅡ-120R 1 μL、APXⅡ-120PROBE 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，40個循環(huán)；60 ℃ 30 s。

1.2.3 rAd-APXⅡ免疫小鼠和血清收集

在小鼠模型上研究重組rAd-APXⅡ疫苗的免疫劑量。選擇SPF級別的昆明小鼠（4～6周齡，購自湖南景達實驗動物有限公司）20 只，隨機分成4 組，每組5 只小鼠。將重組腺病毒載體+生理鹽水制成疫苗，注射體積為50 μL。rAd5-Null 組注射未插入基因的空載體包裝的重組病毒，rAd-APXⅡ-低組、rAd-APXⅡ-高組注射的是重組腺病毒載體疫苗，并設(shè)置疫苗對照組（注射放線桿菌滅活疫苗）。免疫前24 h和疫苗免疫組第二次免疫后第2周采血一次，制備血清凍存于-70 ℃冰箱。試驗設(shè)計見表1。

表1 試驗設(shè)計Tab.1 Immune grouping and situation

1.2.4 小鼠血清中APXⅡ抗體的ELISA檢測

包被上步制備的APXⅡ蛋白抗原（實驗室原核制備和保存），以1 mg/L 濃度，每孔100 μL 包被96 孔酶標(biāo)板，37 ℃ 2 h，用PBST（PBS+吐溫）洗滌。每孔加100 μL 5%脫脂乳的PBST封閉液，37 ℃封閉1 h，洗滌；每孔加入PBS稀釋（1∶100）的待檢免疫血清，37 ℃孵育1 h，洗滌；每孔加入PBS稀釋（1∶2 000）的HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 作為二抗，37 ℃孵育1 h，洗滌；每孔加入100 μL TMB顯色液（3, 3', 5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺），室溫顯色10 min后每孔加入50 μL 2 mol/L的硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測OD450nm值。

1.2.5 小鼠血清中的IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3 抗體的ELISA檢測

嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書操作檢測血清中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗體水平。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計，方差齊時采用LSD 法進行組間兩兩對比，方差不齊時采用Dunnett 法進行方差分析；兩變量間關(guān)系采用直線相關(guān)分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 pDC316-APXⅡ雙酶切鑒定結(jié)果（見圖1）

圖1 pDC316-APXⅡ雙酶切結(jié)果Fig.1 Results of pDC316-APXⅡ double enzyme digestion

由圖1可知，試驗獲得了預(yù)期大小的目的片段，說明成功構(gòu)建了pDC316-APXⅡ載體。

2.2 病毒包裝和滴度測定結(jié)果

正常、收毒前的Hek293細(xì)胞見圖2、圖3。

圖2 正常的Hek293細(xì)胞Fig.2 Normal Hek293 cells

圖3 收毒前的Hek293細(xì)胞Fig.3 Hek293 cells before exposure

由圖2、圖3 可知，收毒前的Hek293 細(xì)胞變圓脫落，符合腺病毒出毒時的形態(tài)。

采用熒光定量PCR檢測病毒滴度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線（見圖4）的CT 值和對應(yīng)濃度計算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。病毒樣本稀釋100倍后，檢測的CT值為14.20（見圖5），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到病毒滴度為1.20×1010個/mL。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Amplification curves of standards

圖5 病毒樣本滴度Fig.5 Virus sample titer

2.3 免疫后的血清APXⅡ IgG抗體水平（見表2）

由表2可知，rAd5-Null組沒有產(chǎn)生特異的APXⅡ IgG抗體；低、高濃度rAd-APXⅡ組均可產(chǎn)生較高的APXⅡIgG 抗體，其中高濃度組產(chǎn)生的抗體水平顯著高于低濃度組（P＜0.05）；疫苗對照組產(chǎn)生的APXⅡ IgG 抗體水平高于rAd-APXⅡ低濃度組（P＜0.05），但低于rAd-APXⅡ高濃度組（P＜0.05）。

2.4 免疫后的血清IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3 抗體水平（見表3）

表3 免疫后小鼠血清IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗體水平Tab.3 Serum IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3 antibody levels in immunized mice

由表3 可知，低、高濃度rAd-APXⅡ組和疫苗對照組的IgG1、IgG2a、IgG2b 和IgG3 抗體顯著高于rAd-Null 組（P＜0.05）；高濃度rAd-APXⅡ組和疫苗對照組抗體顯著高于低濃度rAd-APXⅡ組（P＜0.05）；高濃度rAd-APXⅡ組抗體水平略高于疫苗對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，rAd-APXⅡ組的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答水平均得到了顯著提高。

3 討論

本研究中，雙酶切鑒定結(jié)果顯示獲得了3 700 bp 的載體片段和925 bp 的目的基因片段，表明試驗成功構(gòu)建了pDC316-APXⅡ載體，為下一步重組腺病毒的包裝做好了準(zhǔn)備。根據(jù)轉(zhuǎn)染前后Hek293 細(xì)胞的形態(tài)變化，可知轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯后，組裝成的重組病毒量引起細(xì)胞變圓和脫落，定量PCR 檢測結(jié)果表明成功包裝了病毒。研究表明，APxⅡ是一種有活性的抗原。楊術(shù)杰等[11]在谷氨酸棒桿菌中表達截短的ApxⅡ蛋白可與豬抗ApxⅡ陽性血清進行特異性免疫，研究結(jié)果為獸用疫苗產(chǎn)業(yè)提供了質(zhì)量可靠、低成本表達體系。萬玉萌等[12]將含APXⅡ的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta 感受態(tài)細(xì)胞，通過IPTG 誘導(dǎo)表達，應(yīng)用His單克隆抗體和臨床陽性豬血清對表達的重組蛋白上清進行Western blot 分析。結(jié)果表明，APXⅡ重組蛋白可以穩(wěn)定表達可溶性蛋白，可溶性蛋白能與His 單克隆抗體和臨床陽性豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)，證明APXⅡ重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。

本研究結(jié)果表明，rAd5-Null 組沒有產(chǎn)生特異的APXⅡ IgG抗體；低和高濃度rAd-APXⅡ組均可產(chǎn)生較高水平的APXⅡ IgG抗體，且高濃度組產(chǎn)生的抗體顯著高于低濃度組；疫苗對照組產(chǎn)生的APXⅡ IgG 抗體水平高于rAd-APXⅡ低濃度組，低于rAd-APXⅡ高濃度組。結(jié)果表明，rAd-APXⅡ注射小鼠后能夠表達APXⅡ蛋白，同時刺激機體產(chǎn)生特異性的抗體。IgG1水平升高，表明保護性免疫中免疫應(yīng)答向Th2（體液免疫應(yīng)答）方向發(fā)展；IgG2a 水平升高，提示保護性免疫中免疫應(yīng)答向Th1（細(xì)胞免疫應(yīng)答）方向發(fā)展[13-15]。本研究結(jié)果表明，低、高濃度rAd-APXⅡ組和疫苗對照組的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗體水平顯著高于rAd-Null 組；高濃度rAd-APXⅡ組和疫苗組抗體水平顯著高于低濃度rAd-APXⅡ組；高濃度rAd-APXⅡ組抗體水平略高于疫苗對照組，但差異均不顯著。上述結(jié)果表明，rAd-APXⅡ組小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答水平均得到顯著提高。

綜上所述，包含APXⅡ基因的重組腺病毒載體rAd-APXⅡ，僅需一次注射即可刺激機體產(chǎn)生特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。與滅活苗相比，本研究的重組腺病毒載體rAd-APXⅡ生產(chǎn)成本低，應(yīng)激小，可作為預(yù)防和治療放線桿菌的疫苗。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建的APP APXⅡ基因的重組五型腺病毒載體rAd-APXⅡ能夠產(chǎn)生很好的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答水平，為進一步的疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。