基于F 基因的鴿新城疫病毒分子特征分析

汪 萍，苗書魁，魏玉榮，夏 俊

（ 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830011 ）

新城疫是由副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬禽副黏病毒Ⅰ型（APMV-1，也稱新城疫病毒）引起的病毒病，在我國被列為二類動物疫病[1]。新城疫病毒（NDV）不斷進化共產(chǎn)生21 種基因型，可感染240 多種鳥類，在遺傳、毒力、抗原性和寄主范圍等方面具有高度多樣性[2]。1975年，新城疫第三次大流行從鴿子開始，傳播到世界各地[3-4]。鴿新城疫于20 世紀(jì)80 年代傳入我國，APMV-1 基因型Ⅵ是造成這一流行病的主要原因，也稱鴿副黏病毒-1（PPMV-1）[5]。NDV 是一種負(fù)鏈RNA 病毒，NDV 基因組可編碼6 種結(jié)構(gòu)蛋白：核蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基質(zhì)（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN）和大蛋白（L）以及兩種非結(jié)構(gòu)蛋白V和W，其中定位于病毒囊膜的F蛋白通常被認(rèn)為是NDV毒力的分子標(biāo)記[6]。隨著新疆畜牧產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，養(yǎng)鴿業(yè)已成為和田地區(qū)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一，除了采取對規(guī)?；B(yǎng)殖場鴿子進行疫苗免疫的預(yù)防措施外，還需了解鴿新城疫流行現(xiàn)狀及病毒的分子特征。本試驗以新疆和田地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)鴿場流行病學(xué)調(diào)查陽性樣品為研究對象，進行基于F基因的鴿新城疫病毒分子特征分析，為制定系統(tǒng)、有效的鴿新城疫防控策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020—2022年，本實驗室分別從新疆和田地區(qū)6個縣市的規(guī)模化肉鴿養(yǎng)殖場采集81份臨床癥狀疑似感染NDV的鴿子肺和脾臟組織，冷鏈運輸至實驗室-20 ℃保存。

1.2 主要試劑

RNA 提取試劑盒購自QIAGEN 公司；One step RTPCR kit 購自Takara 公司；DNA 凝膠回收試劑盒購自AXYGEN 公司。F基因特異性引物序列為5'-AGGCACCCAACGTGCTGTCG-3'；5'-ACGGAGACTCAAGGGCCACC-3'[2]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 RNA提取及RT-PCR擴增

組織樣品用無菌剪刀剪碎，于組織勻漿器中充分研磨后置于含抗生素的PBS（0.01 mol/L、pH 值7.0～7.4）中，制成濃度為10%的混懸液，凍融3 次，8 000 r/min 離心10 min，取上清提取病毒RNA。按QIAGEN RNeasy MINI Kit 說明書提取病毒RNA，利用One step RT-PCR kit 進行RT-PCR，取2 μL提取的RNA進行RT-PCR。

反應(yīng)體系：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL、上下游引物各0.5 μL（20 μmol/L）、2×1 Step Buffer 12.5 μL、Template RNA 1 μL、RNase Free dH2O 9.5 μL。

反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃ Taq 酶激活2 min；94 ℃ 30 s, 57 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，樣品出現(xiàn)約535 bp目的片段判為NDV核酸陽性。統(tǒng)計陽性結(jié)果，計算各地區(qū)陽性率。

1.4 F基因擴增與序列分析

將RT-PCR 鑒定陽性樣本，取5 μL 提取的RNA 于50 μL反應(yīng)體系進行RT-PCR擴增。

反應(yīng)體系：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL、上下游引物各1 μL（20 μmol/L）、2×1 Step Buffer 25 μL、Template RNA 3 μL、RNase Free dH2O 18 μL。

反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 次循環(huán)；72 ℃延伸7 min。RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)約1 600 bp目的片段判為F基因擴增陽性。凝膠回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

使用Lasergene7.0 軟件中Clustal W 和MegAlign 功能進行同源性分析，MEGA5.0軟件進行遺傳進化分析，NCBI在線工具MSA Viewer比較不同F(xiàn)基因的分子特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 規(guī)?；B(yǎng)鴿場鴿新城疫流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

和田地區(qū)6 個規(guī)?；B(yǎng)鴿場中選擇出現(xiàn)糞便稀薄，呈黃綠色或黃白色，扭頸、癱瘓等神經(jīng)癥狀的病鴿，采集病料進行鴿新城疫病毒檢測。

RT-PCR結(jié)果顯示，81份樣品中有12份樣品擴增到目的片段，和田地區(qū)鴿新城疫陽性率14.81%（12/81），其中縣市1 陽性率11.77%（2/17），縣市2 陽性率11.11%（1/9），縣市3陽性率18.75%（3/16），縣市4陽性率15.79%（3/19），縣市5陽性率11.11%（1/9），縣市6陽性率18.18%（2/11）。部分樣品RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 部分樣品RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretic results of RT-PCR products of some samples

2.2 基于F基因的核苷酸同源性分析（見圖2、圖3）

圖2 F基因RT-PCR擴增結(jié)果Fig.2 RT-PCR amplification results of F gene

圖3 不同毒株F基因核苷酸同源性分析Fig.3 Nucleotide homology analysis of F gene in different strains

從流行病學(xué)調(diào)查陽性樣品中選擇分別代表不同縣市和養(yǎng)鴿場的6株F基因擴增產(chǎn)物進行純化后測序，見圖2。

由圖2可知，所測6株序列與GenBank中PPMV-1的F基因序列一致，分別命名為:NDV/PIGEON/XJHT/446/2020/F、NDV/PIGEON/XJHT/467/2020/F、NDV/PIGEON/XJHT/491/2020/F、NDV/PIGEON/XJHT/472/2021/F、NDV/PIGEON/XJHT/802/2022/F 以及NDV/PIGEON/XJHT/812/2022/F。上述6株分離毒株與國內(nèi)外11株F基因核苷酸序列進行同源性分析，結(jié)果見圖3。

由圖3 可知，6 株F基因之間核苷酸同源性為97.7%～99.9%，與甘肅、寧夏來源的分離株核苷酸同源性為97.3%～99.5%，與國內(nèi)其他省份來源的分離株核苷酸同源性為97.2%～98.6%。6 株分離株F基因與基因Ⅱ型疫苗株LaSota 株、HB1 株、VG/GA 株、Clone30 株核苷酸同源性為83.5%～84.7%，與基因Ⅲ型Mukteswarz 株核苷酸同源性為84.9%～85.7%。

2.3 基于F基因的遺傳進化分析

分別與GenBank 中43 株代表不同基因型PPMV-1 的F基因進行核苷酸序列比對，并構(gòu)建進化樹，結(jié)果見圖4。

由圖4 可知，所測6 株F基因序列均屬Ⅵ.2.1.1.2.2，其中NDV/PIGEON/XJHT/802/2022/F 與分離自寧夏的MG840654.1 親緣關(guān)系最近，同在一個小分支內(nèi)；而其他5 株F基因（NDV/PIGEON/XJHT/446/2020/F、NDV/PIGEON/XJHT/467/2020/F、NDV/PIGEON/XJHT/491/2020/F、NDV/PIGEON/XJHT/472/2021/F、NDV/PIGEON/XJHT/812/2022/F）均在同在一個小分支內(nèi)；6 株F基因序列均與甘肅的OM640464.1 親緣關(guān)系較近，與基因Ⅱ型疫苗株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.4 F蛋白主要功能區(qū)的分子特征分析（見表1）

表1 6株F蛋白功能域中氨基酸突變Tab.1 Amino acid mutation in functional domain of six F protein

由表1 可知，對比6 株F 蛋白和10 株國內(nèi)流行株主要功能區(qū)域的分子特征，結(jié)果顯示，F(xiàn) 蛋白裂解位點序列均為112R-R-Q-K-R-F117，6株分離株F蛋白N端信號肽區(qū)的第4、5位點有苯丙氨酸、蘇氨酸的插入，第6位點絲氨酸突變?yōu)槔野彼帷?株分離株F蛋白融合肽區(qū)均有兩處氨基酸突變（V121I、A132S），HRa 區(qū)均有1 處氨基酸突變（V179I），其中NDV/PIGEON/XJHT/802/2022/F 在HRb、HRc 有一個氨基酸突變（L298F 和K483R），在跨膜區(qū)有2個氨基酸突變（V509I、V512I）。

3 討論

除APMV-1基因型Ⅵ外，APMV-1基因型ⅩⅪ也會引起鴿新城疫暴發(fā)。2017 年，巴基斯坦鑒定出APMV-1 基因型ⅩⅪ.1.1 和ⅩⅪ.1.2[7]。2011—2015 年，趙振振[8]從我國部分地區(qū)分離到基因Ⅵb 亞型鴿新城疫病毒11 株。2021—2022 年，彭真奇等[9]從不同地區(qū)鴿群中分離到8 株NDV 代表株，均屬于基因Ⅵ型；Zhan 等[10]通過對186 株中國PPMV-1分析證實目前中國亞基因型Ⅵ.2.1.1.2.2最多，其次是亞基因型Ⅵ.2.1.1.2.1、Ⅵ.2.2.2和Ⅵ.1。本試驗中的6 株鴿新城疫流行株鑒定為亞基因型Ⅵ.2.1.1.2.2，與目前APMV-1 基因Ⅵ亞型在我國鴿群中流行的特征相符。綜上，Ⅵ.2.1.1.2.2目前是我國鴿新城疫主要流行基因型。

據(jù)報道，融合肽和HR區(qū)的氨基酸替代或NDV跨膜結(jié)構(gòu)域的替換可能會影響F蛋白的融合活性，進而影響病毒的致病性[11]。本試驗中6株F蛋白的主要功能區(qū)域均發(fā)生了點突變，其中NDV/PIGEON/XJHT/802/2022/F 在HRb、HRc和跨膜區(qū)出現(xiàn)1～2個氨基酸突變。

在不斷開發(fā)新城疫疫苗的背景下，鴿NDV 的進化選擇壓力增加。有研究報道，NDV的所有編碼基因和一些非編碼區(qū)中均發(fā)現(xiàn)了來自疫苗譜系和循環(huán)病毒譜系的自然同源重組，活疫苗株可能通過與循環(huán)病毒的同源重組在NDV 進化中發(fā)揮作用[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn) 蛋白裂解位點序列112R-R-Q-K-R-F117雖然具有強毒株的特征，但NDV的毒力指標(biāo)如雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)低于0.7。Zhan等[10]在2020年從江蘇、安徽和河南省的病鴿中鑒定出7株P(guān)PMV-1毒株，其F蛋白切割位點序列是典型強毒特征，但根據(jù)雞胚最小致死量的平均死亡時間（MDT）和腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）值分析，這7 株毒株屬于中等毒力。裴育等[14]從北京、天津、山東鴿群分離的4 株鴿NDV F 蛋白切割位點序列是典型強毒特征，但對雞的致病性顯示出中等毒力。因此，進行鴿新城疫致病性分析時應(yīng)結(jié)合其他毒力判定指標(biāo)進行綜合判定。

目前，鑒于無鴿源新城疫疫苗的現(xiàn)狀，雞新城疫疫苗被廣泛應(yīng)用于鴿新城疫預(yù)防。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，近年和田地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)鴿場主要應(yīng)用雞新城疫、禽流感（H9亞型）二聯(lián)滅活疫苗（LaSota株+SZ株）、雞新城疫活疫苗（LaSota株）、雞新城疫活疫苗（CS2 株）、新城疫滅活疫苗、重組新城疫病毒滅活疫苗（A-Ⅶ株）防控鴿新城疫，雞源新城疫疫苗在控制鴿新城疫暴發(fā)流行中發(fā)揮了重要作用。本研究中，基于F基因的核苷酸同源性分析結(jié)果顯示，6 株新疆鴿NDV流行株與基因Ⅱ型的疫苗株核苷酸同源性為83.5%～84.7%，與基因Ⅲ型Mukteswarz株同源性為84.9%～85.7%。結(jié)果表明，基因型不匹配的新城疫疫苗對鴿子的臨床保護力有限，不能解決新城疫病毒脫落的缺點；在這種情況下，田間病毒仍可在鴿群中傳播并引起鴿新城疫呈點狀散發(fā)的流行特點。有研究報道，并非所有鴿子來源的病毒對雞的毒力均很低，鴿子病毒在家禽中的持續(xù)傳播可導(dǎo)致產(chǎn)生對家禽具有毒性的毒株，分離自孟加拉國的鴿子來源的NDV基因型ⅩⅪ.1.2對雞的致死率很高[15]。因此，規(guī)?；B(yǎng)鴿場需要定期進行血清學(xué)與病原學(xué)監(jiān)測并結(jié)合監(jiān)測結(jié)果制定相應(yīng)的免疫程序，同時還需加強養(yǎng)鴿場飼養(yǎng)管理及消毒管理，以達(dá)到有效防控鴿新城疫的目標(biāo)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，和田地區(qū)鴿NDV 基因型與我國鴿群中主要流行的NDV基因型Ⅵ的特征相符，6株F蛋白主要功能區(qū)均發(fā)生了點突變，且裂解位點序列具備強毒特征，但這些突變是否會影響病毒的致病性還需進一步研究加以證實。綜上所述，加強鴿新城疫流行病學(xué)調(diào)查，掌握鴿新城疫病毒分子特征，對養(yǎng)鴿業(yè)及養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展具有積極意義。