赤斑羚皮膚成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

劉群秀，袁耀華，梁小虎，劉玉良，安俊輝，王東輝，黃茗鑫，蔡志剛*

（ 1. 上海城建職業(yè)學(xué)院，上海 201415 ； 2. 上海動(dòng)物園，上海 200335 ； 3. 成都大熊貓繁育研究基地，四川 成都 610081 ）

赤斑羚（Naemorhedus baileyi）是一類小型哺乳動(dòng)物，別名紅山羊、紅巖羊等，屬于哺乳綱偶蹄目?？蒲騺喛瓢吡鐚伲∟aemorhedus），為典型的林棲獸類，善攀爬，多集群生活在海拔較高的林緣山地，主要以植物的嫩芽、綠葉為食[1-2]。赤斑羚的分布區(qū)域較小，僅棲息于某些亞洲國(guó)家，在我國(guó)僅分布于西藏東南部和云南西北部。由于棲息地喪失，其種群數(shù)量正在急劇減少[3-4]。1996 年，赤斑羚被IUCN列為易危（VU）物種，并于同年被中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書評(píng)定為稀有動(dòng)物[5]。目前上海動(dòng)物園擁有全國(guó)唯一的赤斑羚人工圈養(yǎng)種群。雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)于赤斑羚這一珍稀物種的研究在不斷進(jìn)行中，但目前對(duì)其生態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)及組織學(xué)等方面的研究仍十分匱乏。因此，在現(xiàn)有飼養(yǎng)管理模式的基礎(chǔ)上，非常有必要應(yīng)用分子生物學(xué)的方法和手段推進(jìn)對(duì)該物種的保護(hù)。

體細(xì)胞系的建立和低溫保存是研究瀕危物種的特性和保存有價(jià)值資源的基礎(chǔ)和重要方法[6]。皮膚成纖維細(xì)胞是皮膚主要的構(gòu)成成分，對(duì)皮膚損傷的修復(fù)和再生[7-8]、對(duì)抗皮膚衰老具有重要作用[9]。目前有關(guān)赤斑羚的各方面研究較少，現(xiàn)有的赤斑羚報(bào)道大多是上海動(dòng)物園提供的在人工圈養(yǎng)條件下的研究發(fā)現(xiàn)。赤斑羚是一種具有較大應(yīng)用價(jià)值的瀕危動(dòng)物，有必要建立有效的赤斑羚皮膚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法和體系?；诖耍趨⒖棘F(xiàn)有的多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚成纖維細(xì)胞獲取和培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上，本研究對(duì)赤斑羚原代皮膚細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)，選出最適赤斑羚皮膚成纖維細(xì)胞獲取方式，優(yōu)化培養(yǎng)條件，測(cè)定并記錄該細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，最終獲得可穩(wěn)定增殖的赤斑羚原代皮膚成纖維細(xì)胞，以此為培養(yǎng)赤斑羚皮膚成纖維細(xì)胞為基礎(chǔ)的科研工作的進(jìn)一步開(kāi)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

樣本選自上海動(dòng)物園繁育的赤斑羚，7歲齡，體重18～20 kg，譜系號(hào)：SHZ13-2，身體狀態(tài)健康。

1.1.2 試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸緩沖液（PBS）、膠原酶Ⅰ型、胎牛血清（FBS）、二甲基亞砜、青霉素、鏈霉素溶液、臺(tái)盼藍(lán)染液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 赤斑羚原代皮膚分離

在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取赤斑羚后腿內(nèi)側(cè)皮膚，剃毛后，皮膚表面采用20%碘酒和75%乙醇消毒處理，局部麻醉，隨后取2 cm×2 cm 大小的全層皮膚，放入含250 U/mL 青霉素和250 mg/L 鏈霉素的無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中浸泡。在超凈工作臺(tái)中輕輕刮去表皮細(xì)胞和皮下組織，保留真皮層，用眼科剪剪碎至1 cm×1 cm 的小塊。用吸管轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管內(nèi)，注入無(wú)菌雙抗PBS 溶液，重復(fù)洗滌3 遍，并棄去洗滌液，將離心管置于冰上保存。

1.2.2 赤斑羚原代皮膚細(xì)胞分離

用PBS分別配置0.1% Ⅰ型膠原酶溶液，100目濾膜過(guò)濾除菌，隨后裝入50 mL 離心管，將剪碎的皮膚組織轉(zhuǎn)移至離心管中，37 ℃水浴消化40 min，消化中每10 min 振蕩一次。分別采用40 目和100 目的濾膜過(guò)濾消化完成的細(xì)胞懸濁液，1 200 r/min離心5 min后棄去上清液，將離心管的細(xì)胞吹打均勻后移入使用完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d，在此期間觀察細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)情況并根據(jù)情況更換同類完全培養(yǎng)基。

1.2.3 赤斑羚成纖維細(xì)胞的胰酶消化純化

每隔2 d 在顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，待貼壁細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化。棄去培養(yǎng)液后采用PBS 清洗3 次，加入0.25%胰酶，在37 ℃條件下水浴消化細(xì)胞。吸取完全培養(yǎng)基反復(fù)吹打細(xì)胞，直到變圓的成纖維細(xì)胞完全均勻混合于培養(yǎng)液中，將液體移至15 mL 離心管，1 200 r/min離心2 min，棄去上清。加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打均勻后按1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每間隔2 d 觀察一次細(xì)胞生長(zhǎng)情況，根據(jù)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況及時(shí)換液和傳代。

1.2.4 赤斑羚成纖維細(xì)胞凍存

細(xì)胞凍存：將生長(zhǎng)良好的赤斑羚細(xì)胞先用PBS沖洗兩遍，再去除漂浮的細(xì)胞；用預(yù)熱濃度為0.25%的胰酶消化貼壁的細(xì)胞；其混合液于室溫離心，再加入700 μL的完全培養(yǎng)基，溶解均勻后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞凍存管，并加入200 μL胎牛血清和100 μL二甲基亞砜，混勻。

程序性凍存盒凍存細(xì)胞：已加入凍存液的細(xì)胞放入程序性凍存盒并放進(jìn)-80 ℃超低溫冰箱儲(chǔ)存24 h 后于液氮罐中存放。

1.2.5 赤斑羚成纖維細(xì)胞復(fù)蘇

水浴鍋預(yù)熱至37 ℃，從-80 ℃取出細(xì)胞凍存管，放置于水浴鍋2～3 min，使凍存液溶解；1 200 r/min 離心3 min，保留沉淀，加入完全培養(yǎng)基，重懸后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，再加入3 mL 完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2 d換液時(shí)觀察并記錄細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況。

1.2.6 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)特性檢測(cè)

將復(fù)蘇后的成纖維細(xì)胞接種于24 孔板（濃度為1×104個(gè)/mL），每孔加入1 mL 細(xì)胞懸浮液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔1 d 進(jìn)行一次細(xì)胞計(jì)數(shù)，每次計(jì)數(shù)3個(gè)孔，連續(xù)9 d計(jì)數(shù)。將所得數(shù)據(jù)繪制赤斑羚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖（以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞濃度為縱坐標(biāo)）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 9.0 軟件中雙尾檢驗(yàn)進(jìn)行分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代培養(yǎng)赤斑羚成纖維細(xì)胞形態(tài)觀察（見(jiàn)圖1）

圖1 原代培養(yǎng)赤斑羚成纖維細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.1 Primary culture of Naemorhedus baileyi fibroblasts

用膠原酶消化法解離的細(xì)胞在貼壁1 d 后，細(xì)胞向外伸展出現(xiàn)生長(zhǎng)暈，主要成分為成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。由圖1可知，培養(yǎng)4 d后成纖維細(xì)胞成為優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)細(xì)胞。10 d時(shí)細(xì)胞密度達(dá)到80%以上，此時(shí)進(jìn)行第一次傳代，得到傳代細(xì)胞。傳代細(xì)胞快速貼壁生長(zhǎng)，12～14 d 后細(xì)胞密度可達(dá)90%，表明細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。倒置顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞大多呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)梭狀，胞體中央可見(jiàn)扁圓的細(xì)胞核，并伴有少量鋪路石狀的上皮細(xì)胞。

之后對(duì)含有上皮細(xì)胞的成纖維細(xì)胞使用差速貼壁法進(jìn)行純化，并對(duì)原代成纖維細(xì)胞經(jīng)首次傳代成功后所繁殖的細(xì)胞群體用于細(xì)胞系的構(gòu)建。

2.2 赤斑羚成纖維細(xì)胞的凍存前及復(fù)蘇后的活率（見(jiàn)表1、圖2）

表1 赤斑羚成纖維細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)Tab.1 Number before and after cryopreservation of Naemorhedus baileyi fibroblast cells

圖2 凍存前后赤斑羚成纖維細(xì)胞活率的比較Fig.2 Comparison of fibroblast viability of Naemorhedus baileyi before and after cryopreservation

由表1 可知，第6 代赤斑羚成纖維細(xì)胞凍存前活率和復(fù)蘇后細(xì)胞活率均在80%以上，適用于之后的研究。

由圖2可知，凍存前后細(xì)胞活率差異不顯著（P＞0.05），表明凍存和復(fù)蘇條件均適用于該細(xì)胞，細(xì)胞活力可完全滿足細(xì)胞復(fù)蘇及后續(xù)試驗(yàn)的要求。

2.3 赤斑羚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（見(jiàn)圖3）

圖3 赤斑羚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of fibroblasts from Naemorhedus baileyi

由圖3 可知，赤斑羚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈典型的“S”型，細(xì)胞的生長(zhǎng)均經(jīng)歷了增長(zhǎng)期、對(duì)數(shù)期和平臺(tái)期，符合細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)規(guī)律。剛接到24孔板時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢且基數(shù)較少；從第4 d 開(kāi)始，細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著加快，呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)；第8 d 由于空間有限出現(xiàn)接觸性抑制生長(zhǎng)，且細(xì)胞數(shù)量較大，可能養(yǎng)分較少，出現(xiàn)細(xì)胞減少的現(xiàn)象。

3 討論

已知赤斑羚分布范圍包括印度的東南部、西藏自治區(qū)、云南省西北部、緬甸北部等區(qū)域[10-11]。由于赤斑羚分布廣且分布區(qū)域的樣本數(shù)稀少，目前關(guān)于其系統(tǒng)發(fā)育和分類地位尚不明確。Xiong等[12]對(duì)赤斑羚、長(zhǎng)尾斑羚、喜馬拉雅斑羚和中國(guó)斑羚進(jìn)行了測(cè)序，并與GenBank中的中華斑羚（Naemorhedus caudatus：No. AY356357、FJ469673、U17861）、Nemorhaedus caudatus raddeanus（No.EU259099-EU259107、EU259195-EU259198）、斑羚（Naemorhedus goral：No.EU259118）、灰斑羚（Naemorhedus griseus：No.FJ207532、JN632664）、赤斑羚（Naemorhedus baileyi：No.JN632663、JX506309、JX506311、JX506310）序列進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)赤斑羚是獨(dú)立于它們的物種。但由于種群分布地和種群大小的關(guān)系，并沒(méi)有太多的樣本數(shù)據(jù)用于支撐分子進(jìn)化的討論，因此不能很好地解釋赤斑羚的分類問(wèn)題，今后關(guān)于斑羚屬分類問(wèn)題仍需要進(jìn)一步研究[13]。

膠原酶消化法[14]以及組織培養(yǎng)法[15]是細(xì)胞分離的經(jīng)典方法。由于組織培養(yǎng)法極易發(fā)生污染，一般多選用膠原酶消化法[16]。由于膠原酶解離細(xì)胞會(huì)損傷細(xì)胞，因此溫度、酶濃度、處理時(shí)間尤為關(guān)鍵。在37 ℃時(shí)，酶濃度過(guò)高或消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易導(dǎo)致細(xì)胞破損死亡，造成剩余未損傷細(xì)胞不易貼壁生長(zhǎng)，反之酶濃度過(guò)低或消化時(shí)間過(guò)短，則消化不完全，獲得細(xì)胞量不多。本試驗(yàn)中，由于赤斑羚皮膚組織樣本的珍貴性，在膠原酶消化過(guò)程中采取消化赤斑羚皮膚成纖維細(xì)胞的消化時(shí)間，結(jié)果得出膠原酶消化45 min是適用于赤斑羚皮膚成纖維細(xì)胞的消化時(shí)間[17-18]。

體細(xì)胞的建立和保存不僅是保存重要物種種質(zhì)資源的必要條件，而且為基因組和體細(xì)胞發(fā)育研究提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)。自1996年以來(lái)，赤斑羚已成為我國(guó)瀕危野生動(dòng)物，因此建立赤斑羚皮膚成纖維細(xì)胞系很有必要。隨著體細(xì)胞核移植技術(shù)（SCNT）的不斷革新與成熟，該技術(shù)已被廣泛用于拯救瀕危物種[19-20]。SCNT通常以去核卵母細(xì)胞為受體，供體采用單細(xì)胞核，是一種將體細(xì)胞核轉(zhuǎn)入成熟的去核卵母細(xì)胞中，從而激活新的克隆胚胎，進(jìn)而培育出基因型與供體體細(xì)胞一致的克隆動(dòng)物的方法。但體細(xì)胞核移植的效率和成功率仍然很低，其中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)就是挑選核移植供體，而成纖維細(xì)胞質(zhì)量好，有利于重構(gòu)胚胎的發(fā)育，是最常用的供體細(xì)胞[21-22]。有研究以小熊貓皮膚成纖維細(xì)胞為供體，兔卵泡為受體成功獲得了可發(fā)育的小熊貓-兔種間胚胎，進(jìn)而充分肯定了皮膚成纖維細(xì)胞在珍稀動(dòng)物種資源保護(hù)中所占的重要地位[23-24]。本試驗(yàn)成功培養(yǎng)了赤斑羚成纖維細(xì)胞，使赤斑羚基因組DNA 材料得以保存，為后續(xù)試驗(yàn)開(kāi)展以及資源保護(hù)奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究采用膠原酶消化法對(duì)赤斑羚的后腿內(nèi)側(cè)皮膚組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，擇優(yōu)培養(yǎng)出原代成纖維細(xì)胞，并通過(guò)傳代使細(xì)胞進(jìn)一步純化。通過(guò)生物學(xué)特性檢驗(yàn)確定了本試驗(yàn)所得的成纖維細(xì)胞有貼壁增長(zhǎng)快、形態(tài)穩(wěn)定等特點(diǎn)，可見(jiàn)本研究成功建立了培育赤斑羚成纖維細(xì)胞系的方法，也為赤斑羚的相關(guān)研究、瀕危物種資源的保護(hù)以及赤斑羚體內(nèi)皮膚治療提供了理想的生物學(xué)材料和依據(jù)。