羊痘病毒80、81 基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

葛志毅，趙 微，程思危，周園霞，馬欣欣，李有文

（ 1. 塔里木大學(xué)動物與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300 ；2. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300 ）

羊痘作為動物痘病毒病中一種嚴(yán)重的疾病，常會引起牛、羊的皮膚丘疹和炎癥，對母羊和羔羊具有很高的致死率[1-3]。羊痘流行范圍廣，在中國、瑞典、印度等國家均有相關(guān)報道[4]。隨著分子技術(shù)的不斷發(fā)展，有關(guān)羊痘的研究不再局限于其癥狀、診斷，也進(jìn)入了基因水平[5]?；蚪M研究表明，羊痘病毒基因組全長約150 kb，共編碼147個開放閱讀框（ORF），分中間區(qū)域和兩端區(qū)域，兩端區(qū)域（ORF001～ORF023和ORF124～ORF156）與致病性、選擇宿主范圍等有關(guān)[6]。兩端區(qū)域基因研究內(nèi)容較多，如ANK基因[7]、KLPL基因等[8]。而中間區(qū)域（ORF024～123）是核心部分，編碼與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、加工等生物繁殖相關(guān)的重要蛋白[9]。80、81基因隸屬核心部分，其編碼基因與病毒的復(fù)制、蛋白合成相關(guān)。Tulman等[10]在對羊痘病毒基因組全序列進(jìn)行分析研究時也只是注明80、81基因?qū)儆诓《玖Ｗ拥鞍?，而無其他信息，后續(xù)也未見其他研究。本試驗(yàn)在前人基礎(chǔ)上探究80、81基因的生物學(xué)特性，研究其部分蛋白功能，以期為羊痘病毒的基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

pCDNA3.1 質(zhì)粒、Vero 細(xì)胞、大腸桿菌DH5α 細(xì)胞，均由塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

瓊脂糖水平電泳儀（北京市六一公司）、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海市一恒科研儀器設(shè)備股份有限公司）、XMTP-204水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、Tanon3500凝膠成像分析系統(tǒng)（河南博奧誠恒科貿(mào)有限公司）、T100 PCR 儀（Thermo 科技有限公司）、高速離心機(jī)小型臺式（eppendorf公司）、SWCJ-2FD超凈工作臺（BXOXUN公司）。

DNA Marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提取試劑盒等購自北京天根生物工程技術(shù)有限公司；PrimeSTAR聚合酶、Q.Cut EcoR I 和Q.Cut Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶、solutionⅠ均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

分別使用在線網(wǎng)站SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl? Page=npsasopm. html）和swiss model（https://swissmodel.expasy.org/interactive/）對羊痘病毒80、81基因表達(dá)蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；在線軟件Interpro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）對羊痘病毒80、81基因表達(dá)蛋白功能位點(diǎn)進(jìn)行研究。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 中檢索的基因組序列（GenBank 登錄號為AF124517）中80、81 基因的序列，使用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)2對擴(kuò)增引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 908和492 bp。上游引物添加EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn),下游引物添加Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，送至上海生物工程有限公司合成。引物序列見表1，虛線下標(biāo)為保護(hù)性堿基，實(shí)線下標(biāo)為酶切位點(diǎn)。

表1 引物序列信息Tab.1 A primer sequence's details

1.2.3 羊痘病毒80、81基因組的DNA提取

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室中已存的羊痘病毒疫苗株，按照病毒基因組試劑盒說明書提取病毒基因組，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 羊痘病毒80、81基因的擴(kuò)增與回收

以提取的基因組為模板擴(kuò)增羊痘80和81目的基因。

擴(kuò)增反應(yīng)體系：Prime STAR Max 25 μL、80/81-F 2 μL、80/81-R 2 μL、羊痘病毒基因組2 μL、RNase-free water 19 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，循環(huán)35 次；72 ℃ 10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 羊痘病毒80、81基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

將經(jīng)回收的80、81基因和pCDNA3.1質(zhì)粒分別使用內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ進(jìn)行快速雙酶切。酶切體系：膠回收80、81基因/pCDNA3.1質(zhì)粒30 μL、Q.Cut EcoR Ⅰ 6 μL、Q.Cut Hind Ⅲ 6 μL、10×Q.Cut G.buffer 5 μL、RNase-free water 3 μL。酶切產(chǎn)物取10 μL瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，鑒定正確的酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。

將酶切成功的80、81目的基因與pCDNA3.1空載體酶切產(chǎn)物于16 ℃，利用T4 連接酶過夜連接。連接體系為：solutionⅠ 9 μL、pCDNA3.1 2 μL及膠回收羊痘病毒80、81基因7 μL。連接后的重組質(zhì)粒命名為pCDNA3.1-80、pCDNA3.1-81，將重組質(zhì)粒按照轉(zhuǎn)化說明書操作，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆增殖。

1.2.6 羊痘病毒80、81基因真核表達(dá)載體的鑒定

轉(zhuǎn)化增殖的連接產(chǎn)物挑取單克隆過夜培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定，鑒定結(jié)果為陽性的菌液產(chǎn)物提取重組質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果為兩條酶切條帶的產(chǎn)物送往上海生物工程有限公司進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.7 Vero細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

37 ℃水浴復(fù)蘇并培養(yǎng)Vero細(xì)胞，傳代2～3次待細(xì)胞穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染前1 d 傳代，轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞需要達(dá)到70%～90%覆蓋。使用HBS 稀釋重組質(zhì)粒pCDNA3.1-80、pCDNA3.1-81（使用無內(nèi)毒素的試劑盒提取質(zhì)粒），HBS稀釋Lip2000，兩液混合后加入Lip2000，37 ℃孵育6 h，更換培養(yǎng)基，加入新鮮生長培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.8 CCK-8測定轉(zhuǎn)染后蛋白毒力

在轉(zhuǎn)染12、24、36 h 后，分別取細(xì)胞懸液使用CCK-8試劑盒進(jìn)行表達(dá)蛋白毒性檢測。96 孔板接種細(xì)胞懸液100 μL，每孔加入CCK-8 10 μL，將細(xì)胞懸液置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h，之后使用酶標(biāo)儀檢測OD450nm吸光度。

對匯總的吸光度采用SPSS Statistics 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

1.2.9 羊痘病毒80、81基因轉(zhuǎn)染效果鑒定

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞48 h后，棄去細(xì)胞懸液進(jìn)行破碎，按照細(xì)胞基因組試劑盒提取細(xì)胞基因組，PCR 特異性擴(kuò)增羊痘病毒80、81基因，證明檢測的Vero細(xì)胞中羊痘基因80、81基因轉(zhuǎn)染成功，其蛋白在細(xì)胞中表達(dá)。擴(kuò)增程序同1.2.4、1.2.5，使用核酸電泳進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊痘病毒80、81基因生物信息學(xué)分析（見圖1～圖3）

圖1 羊痘病毒80、81蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.1 Protein secondary structure of capripoxvirus protein 80 and 81

由圖1 可知，80 基因表達(dá)蛋白含有α-螺旋205 個，占32.28%；延伸鏈178個，占28.03%；β-轉(zhuǎn)角60個，占9.45%；無規(guī)則卷曲192 個，占30.24%。81 基因表達(dá)蛋白含有α-螺旋30 個，占18.40%；延伸鏈65 個，占39.88%；β-轉(zhuǎn)角26個，占15.95%；無規(guī)則卷曲42個，占25.77%。

由圖2可知，80基因蛋白總長約為635個氨基酸，其分子量大小為73.43 kDa，等電點(diǎn)（PI）為6.88；在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為35（閾值40），推測蛋白性質(zhì)穩(wěn)定；親水性平均系數(shù)為-0.083，表現(xiàn)出親水性；預(yù)測80 蛋白主要以α 螺旋為主。81基因蛋白總長約為492個氨基酸，其分子量大小為40.59 kDa，PI 為5.32；在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為32.78，推測蛋白性質(zhì)穩(wěn)定；親水性平均系數(shù)為0.674，表現(xiàn)出疏水性；預(yù)測81蛋白主要以無規(guī)則卷曲為主。

圖2 羊痘病毒80、81蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.2 Tertiary structure of sheep pox virus proteins 80 and 81

由圖3可知，羊痘病毒80蛋白有2個解旋酶ATP結(jié)合位點(diǎn)，1 個解旋酶位點(diǎn)；羊痘病毒81 蛋白有1 個RNA 酶聚合位點(diǎn)，涉及病毒轉(zhuǎn)錄過程。

圖3 羊痘病毒80、81蛋白功能位點(diǎn)Fig.3 Functional sites of proteins 80 and 81 of sheep pox virus

2.2 羊痘病毒80、81基因的擴(kuò)增結(jié)果（見圖4）

圖4 羊痘病毒80、81基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of sheep pox virus genes 80 and 81

由圖4 可知，經(jīng)PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，成功擴(kuò)增出1 908、492 bp的羊痘病毒80基因、81基因。

2.3 羊痘病毒80、81基因真核表達(dá)載體構(gòu)建（見圖5、圖6）

圖5 羊痘病毒80、81基因酶切結(jié)果Fig.5 Enzyme digestion results of sheep pox virus genes 80 and 81

圖6 pCDNA3.1質(zhì)粒酶切結(jié)果Fig.6 pCDNA3.1 plasmid digestion results

對擴(kuò)增的80 基因和81 基因及真核質(zhì)粒pCDNA3.1 進(jìn)行雙酶切，之后進(jìn)行核酸電泳鑒定。由圖5可知，80、81基因由于本身是線性片段，酶切后未見其他變化。

由圖6 可知，環(huán)狀三條帶質(zhì)粒酶切后成線形單條帶質(zhì)粒，表明質(zhì)粒酶切成功。

2.4 羊痘病毒80、81基因真核表達(dá)載體鑒定（見圖7、圖8）

圖7 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 PCR amplification results

圖8 雙酶切鑒定結(jié)果Fig.8 Double enzyme digestion identification results

由圖7可知，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化菌液增殖后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，核酸電泳結(jié)果顯示均能夠擴(kuò)增出羊痘病毒80、81基因，表明初步構(gòu)建載體成功。

由圖8 可知，羊痘病毒80、81 重組質(zhì)粒均可酶切出一條質(zhì)粒、一條目的基因條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。進(jìn)一步將重組質(zhì)粒送往上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，其測序結(jié)果也表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.5 羊痘病毒80、81基因轉(zhuǎn)染后蛋白毒力（見圖9）

由圖9 可知，3 個時間段中，羊痘病毒80、81 基因轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞之后蛋白的細(xì)胞活力與對照組（pCDNA3.1 質(zhì)粒）相比差異均不顯著（P＞0.05），表明細(xì)胞中羊痘病毒80、81蛋白均未表現(xiàn)出相關(guān)毒性因子。

2.6 羊痘病毒80、81基因轉(zhuǎn)染效果鑒定

轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白的Vero細(xì)胞破碎后提取基因組PCR擴(kuò)增羊痘病毒80、81 基因，核酸電泳結(jié)果顯示均可擴(kuò)增出80、81基因，表明轉(zhuǎn)染成功，結(jié)果見圖10。

圖10 細(xì)胞基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.10 PCR amplification results of cell genome

3 討論

目前羊痘病毒預(yù)防以注射疫苗為主，疫苗主要為常規(guī)的滅活疫苗、弱毒疫苗，現(xiàn)階段對基因工程疫苗和活載體疫苗也進(jìn)行了探索。滅活疫苗由于效果差而不再使用[6]，因此弱毒苗成為常用疫苗。與滅活苗相比，弱毒苗免疫效果明顯，免疫力持久，免疫劑量低，但接種后動物后副反應(yīng)較大，接種部位可能出現(xiàn)痘疹[11-12]。在新型基因工程疫苗方面，Carn等[13]對P32蛋白進(jìn)行了探索，但由于P32蛋白表達(dá)量不高且不穩(wěn)定等問題，P32 蛋白開發(fā)成亞單位疫苗受到了嚴(yán)重制約，因此羊痘病毒疫苗研發(fā)仍是需要加以探索的領(lǐng)域。本試驗(yàn)通過分析預(yù)測羊痘80、81基因蛋白特性，構(gòu)建真核表達(dá)載體，探究羊痘病毒的80、81核心基因功能，以期為羊痘病毒疫苗的研發(fā)提供一定參考。

相比原核表達(dá)載體，本研究考慮到羊痘病毒的特性選用真核表達(dá)載體進(jìn)行構(gòu)建。構(gòu)建后的羊痘病毒真核表達(dá)載體也表明濃度高，質(zhì)粒與空載體連接容易等優(yōu)勢，與其他研究結(jié)論一致[14]。后續(xù)進(jìn)行細(xì)胞表達(dá)，模擬病毒在細(xì)胞中感染過程更接近真實(shí)情況。由于真核載體pCDNA3.1質(zhì)粒中間未插入綠色熒光標(biāo)簽，所以對80、81重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證無法使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，只能選擇轉(zhuǎn)染48 h之后提取基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證。雖然PCR驗(yàn)證成功，但相比熒光顯微鏡直接觀察仍存在一定不足。80、81基因轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后，運(yùn)用CCK-8試劑盒檢測12～36 h表達(dá)蛋白的相關(guān)毒力因子[15]。單因素分析結(jié)果表明其與單質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染差異不顯著，初步說明其表達(dá)蛋白在細(xì)胞中無毒力特性。但結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因預(yù)測，80、81基因均為病毒粒子蛋白，所以對其功能還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究初步構(gòu)建了羊痘病毒80、81 基因真核表達(dá)載體，并驗(yàn)證了其在細(xì)胞中表達(dá)的蛋白不具備毒性，研究結(jié)果為后續(xù)羊痘病毒核心基因的研究提供了參考，也為羊痘病毒疫苗的研究提供更多依據(jù)。